Alle Verfahren mit Tiermodellen wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE Veterinärprüfungsausschuss überprüft.
>1. Chirurgische Instrumente und Lösungen für die Operation vorbereiten
- Autoklavieren Sie alle chirurgischen Instrumente aus Edelstahl.
- Bereiten Sie 70%iges Ethanol vor, indem Sie 200 prozentiges absolutes Ethanol mit sterilem, deionisiertem destilliertem Wasser in molekularer Qualität verdünnen.
- Befestigen Sie die 29-G-Nadel an der Hamilton-Spritze. Reinigen Sie das Innere der Hamilton-Spritze und -Nadel, indem Sie 1 Minute lang wiederholt Nanoreine Wasser aufziehen und ausstoßen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit 70% Ethanol.
- Entfernen Sie den Kolben und die Nadel von der Hamilton-Spritze. Trocknen Sie die Teile an der Luft in einer Laminar-Flow-Haube O/N.
- Bestrahlen Sie Nadel und Spritze vor Gebrauch 30 Minuten lang mit ultraviolettem Licht.
- Bereiten Sie eine Kochsalzlösung vor, indem Sie Natriumchlorid (NaCl) in molekularem Wasser auf eine Endkonzentration von 0,9 % auflösen. Sterilisieren Sie die Lösung, indem Sie sie durch einen 0,2 μm Porenfilter filtrieren.
>2. Präparat für oligomere Amyloid-beta (Aβ1-42)
- Monomerisieren und resuspendieren Sie rekombinantes humanes Aβ1-42 in Dimethylsulfoxid (DMSO) auf 5 mM, genau wie in der Veröffentlichung von Fa' und anderen beschrieben.
- Verdünnen Sie am Tag vor der Operation 5 mM Aβ1-42 mit steriler (1x) phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf 100 μM.
- Mischen Sie die Lösung gut durch Verreiben.
- Aβ1-42-Lösung 12 Stunden lang bei 4 °C inkubieren.
Anmerkung: Kontrolllösungen wie das Verdünnen von DMSO in PBS oder das Rühr-/Reverse-Peptid Aβ1-42 sollten auf die gleiche Weise wie Aβ1-42 hergestellt werden.
>3. Injektionskoordinaten bestimmen
- Verwenden Sie den Atlas des Gehirns adulter Mäuse, um die genauen anterior-posterioren (AP), medial-lateralen (ML) und dorsal-ventralen (DV) Koordinaten für die interessierende Hirnregion zu bestimmen.
Anmerkung: Um die Technik zu veranschaulichen, wählten wir den Gyrus dentatus des Hippocampus als Ziel mit den folgenden Koordinaten aus dem Bregma: AP, -2,00 mm; ML, ±1,3 mm; DV, -2,2 mm. Das negative Vorzeichen vor dem AP-Wert zeigt an, dass es sich 2,00 mm hinter dem Bregma befindet. Das ±-Zeichen vor dem ML-Wert gibt die Richtung nach links und rechts von der Mitte aus an. Schließlich deutet das negative Vorzeichen vor der DV darauf hin, dass sie sich ventral von der Oberfläche des Gehirns bewegt.
>4. Stereotaktische Frame-Einrichtung
- Tragen Sie eine chirurgische Gesichtsmaske, einen sauberen Laborkittel und sterile OP-Handschuhe.
- Wischen Sie den stereotaktischen Instrumenten- und Mausadapter mit 70 % Ethanol ab.
- Legen Sie ein steriles OP-Tuch auf die Theke.
- Platzieren Sie das stereotaktische Instrument mit einem Mausadapter auf dem sterilen OP-Tuch.
- Wischen Sie das Heizkissen der Maus mit 70% Ethanol ab. Positionieren Sie das Heizkissen über dem stereotaktischen Rahmenbett. Verwenden Sie ein Allzweck-Laborbeschriftungsband, um das Heizkissen über das Mausadapterbett zu kleben.
- Befestigen Sie das Heizkissen gemäß den Anweisungen des Herstellers an der Warmwasserumwälzpumpe.
- Schalten Sie die Warmwasserumwälzpumpe ein, stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein und warten Sie, bis sie diese Temperatur erreicht hat.
- Befestigen Sie die 50-μl-Hamilton-Spritze mit einer 29-G-Nadel auf dem stereotaktischen Rahmen, indem Sie sie gemäß den Anweisungen des Herstellers auf den motorisierten vertikalen Injektionsschaft schrauben.
- Schalten Sie den Bead-Sterilisator ein und warten Sie, bis er die vom Hersteller voreingestellte Temperatur erreicht hat.
Anmerkung: Dies wird zum Sterilisieren von Edelstahlinstrumenten zwischen Tieren verwendet. Die Instrumente benötigen 20 Sekunden Kontakt mit den Kügelchen für die Sterilisation.
- Schalten Sie die Kochplatte ein, stellen Sie sie auf 42 °C ein und stellen Sie einen sauberen, leeren Käfig darauf.
- Während die Hamilton-Spritze auf dem stereotaktischen Rahmen befestigt ist, wird mit dem motorisierten stereotaktischen Injektor die Aβ1-42-Lösung aufgezogen.
Anmerkung: Ziehen Sie mehr als 4 μl der Lösung in die Spritze auf und verwenden Sie dann den stereotaktischen Injektor, um das Injektionsvolumen einzustellen. Betreiben Sie den Injektor gemäß den Anweisungen des Herstellers.
>5. Vorbereitung von Tieren
- Bestimmen Sie das Gewicht der Maus mit der Waage.
- Betäuben Sie die Maus mit einem Ketamin/Xylazin-Cocktail in einer Dosis von 100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin durch intraperitoneale Injektion (IP). Überwachen Sie die Narkosetiefe durch den Verlust des Zehenquetschreflexes.
- Nachdem die Maus sediert ist, nimm den Haarschneider und rasiere ihren Kopf, um die Haut über dem Schädel freizulegen.
- Platzieren Sie die Maus auf dem Heizkissen auf dem stereotaktischen Bett.
- Öffnen Sie mit dem Spatel den Mund und platzieren Sie die Schneidezähne in den Zahnschutz. Befestigen Sie den Nasenbügel über der Vorderseite der Maus. Klemmen Sie es vorsichtig und nicht zu fest fest.
- Positionieren Sie die beidseitigen Ohrquerstangen in den Gehörgang, um den Kopf zu sichern. Bewegen Sie jede Querstange hinein, bis sie auf den Schädel trifft, und drehen Sie dann die Schraube, um sie zu verriegeln.
- Um sicherzustellen, dass der Kopf gesichert ist, drücken Sie mit dem Zeigefinger sanft auf den Kopf. Wenn der Kopf richtig gesichert ist, gibt er nicht nach oder bewegt sich nicht, wenn er gedrückt wird.
- Tragen Sie einen Tropfen Augencreme oder einen Augentropfen auf die Augen auf, um sie feucht zu halten. Stellen Sie sicher, dass die Augen während des gesamten chirurgischen Eingriffs feucht sind.
- Zur Desinfektion der Operationsstelle verwenden Sie sterile Wattestäbchen, um Betadinlösung auf die Haut über dem Schädel aufzutragen, gefolgt von 70% Ethanol. Führen Sie die abwechselnde Reinigung mit Betadin und 70 % Ethanol noch 2 Mal durch.
>6. Chirurgie und Infusion
- Verwenden Sie ein Skalpell, um einen 2-3 mm großen Schnitt in der Mittellinie der Kopfhaut zu machen, und verlängern Sie dann mit einer geraden, feinen Schere die Schnittlinie auf 1,0-1,5 cm, um die sagittale Naht, das Bregma und das Lambda des Schädels freizulegen, Orientierungspunkte, auf denen die stereotaktischen Koordinaten basieren. Verwenden Sie Mikroklammern, um die Haut auseinander zu halten.
Anmerkung: Die Bregma- und Lambda-Positionen werden im Mausgehirnatlas "Das Mausgehirn in stereotaktischen Koordinaten" erklärt.
- Nehmen Sie ein Wattestäbchen, tränken Sie es in steriler Kochsalzlösung und reinigen Sie damit den Schädel. Verwenden Sie dann ein sauberes, trockenes Wattestäbchen, um den Schädel zu trocknen.
- Verwende einen sterilen Stift mit feiner Spitze, um einen Punkt auf das Bregma zu markieren. Positionieren Sie die Hamilton-Spritze mit dem stereotaktischen Mikromanipulator so, dass die Nadelspitze gerade den Punkt auf dem Bregma berührt.
- Notieren Sie die DV-Koordinate.
- Um zu überprüfen, ob die AP-Achse des Schädels waagerecht ist, bewegen Sie die Hamilton-Spritze nach hinten, so dass die Spitze der Nadel den Lambda-Punkt berührt.
- Nehmen Sie die DV-Position auf. Stellen Sie sicher, dass die DV-Koordinaten für Bregma und Lambda innerhalb von 0,5 mm liegen.
Anmerkung: Ziel ist es, die DV-Differenz zwischen Bregma und Lambda zu minimieren.
- Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Nadelspitze der Hamilton-Spritze wieder auf den Bregma-Punkt zu setzen.
- Notieren Sie sich die Position des Start-Access Points
- Berechnen Sie die Position des End-Access Points durch Subtrahieren von 2,00 mm von der Start-AP-Koordinate
.
- Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Hamilton-Spritzennadel auf die endgültige AP-Koordinate neu zu positionieren.
- Notieren Sie sich die aktuelle ML-Koordinate.
- Berechnen Sie die ML-Endkoordinaten nach links und rechts, indem Sie 1,3 mm von der ML-Anfangskoordinate addieren oder subtrahieren.
- Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Hamilton-Spritzennadel auf eine der beiden ML-Endkoordinaten zu bewegen.
- Berühren Sie die Nadelspitze mit der Oberfläche des Schädels an beiden ML-Endkoordinaten, notieren Sie die DV-Koordinaten und stellen Sie sicher, dass die Werte innerhalb von 0,5 mm liegen.
HINWEIS: Das Ziel besteht darin, die DV-Differenz zwischen den beiden ML-Endkoordinaten zu minimieren.
- Ziehen Sie die Nadel an einer Endkoordinate 0,5-1 cm über den Schädel nach oben. Nimm einen sterilen Stift mit feiner Spitze, um einen Punkt auf der Oberfläche des Schädels zu markieren. Wiederholen Sie diesen Schritt für die kontralaterale Seite des Schädels.
- Schwenken Sie die Hamilton-Spritze aus dem Weg.
- Befestigen Sie einen 0,8-mm-Bohrkopf an der Bohrmaschine. Nehmen Sie den Bohrer mit beiden Händen, setzen Sie die Ellbogen zur Stabilität auf die Oberfläche des Tisches und positionieren Sie den Bohrkopf leicht über dem Sharpie-Punkt auf der linken oder rechten ML-Koordinate. Aktivieren Sie den Bohrer, senken Sie die Bohrerspitze auf die Schädeloberfläche, um ein Loch in den Schädel einzuführen. Wiederholen Sie diesen Schritt für die kontralaterale Seite.
Anmerkung: Aus den neu eingeführten Löchern kann es zu Blutungen kommen. Wenn es Blutungen gibt, tupfen Sie das Blut mit einem sauberen, trockenen Wattestäbchen ab.
- Bringen Sie die Hamilton-Spritze über einem der neu eingeführten ML-Löcher wieder in Position. Senke die Hamilton-Nadel knapp hinter dem Schädel ab. Achte an dieser Stelle darauf, das Gehirn nicht zu durchstechen. Um sicherzustellen, dass die Nadel den Schädel passiert hat, nimm deinen Zeigefinger und drücke die Nadel vorsichtig gegen den Schädel, um sicherzustellen, dass die Nadel nicht aus dem Loch austritt.
- Notieren Sie die Start-DV-Koordinate.
- Berechnen Sie die End-DV-Koordinate, indem Sie 2,2 mm von der Anfangs-DV-Koordinate subtrahieren.
- Senken Sie die Nadel bis zur End-DV-Koordinate ab.
- Aktivieren Sie die stereotaktische Injektorpumpe, um 4 μl Aβ1-42 mit einer Geschwindigkeit von 0,5 μl/min in den Gyrus dentatus zu pumpen.
- Wenn die Infusion abgeschlossen ist, lassen Sie die Nadel weitere 1 Minute an Ort und Stelle, um den Rückfluss der Lösung aus der Injektionsstelle zu minimieren.
- Bewegen Sie die Nadel auf die andere Seite des Gehirns und wiederholen Sie die Schritte 6.13-6.18.
>7. Tierentfernung und postoperative Pflege
- Schrauben Sie die Ohrbügel und den Gesichts-/Nasenschutz ab. Nehmen Sie die Maus aus dem Gerät.
- Ziehe die Kopfhaut mit einer Zange nach Standardmuster zu und versiegele die Wunde dann mit einer Naht.
