Untersuchung der Alpha-Synuclein-Akkumulation in primären embryonalen Dopamin-Neuronen der Maus

Abstract

Quelle: Er, S. et al., Untersuchung der durch vorgeformte Fibrillen induzierten α-Synuclein-Akkumulation in primären embryonalen Dopamin-Neuronen des Mittelhirns der Maus.J. Vis. Exp. (2020).

Dieses Video zeigt den Prozess der Quantifizierung der Alpha-Synuclein-Akkumulation in embryonalen Dopamin-Neuronen der Maus, die mit alpha-Synuclein-vorgeformten Fibrillen vorbehandelt wurden. Es werden die Schritte zur Fixierung, Färbung und Quantifizierung der Dopamin-Neuronen, die Alpha-Synuclein-Aggregate enthalten, mittels Immunfluoreszenz beschrieben.

Protocol

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.

>1. Vorbereitung

1. Bereiten Sie Dopamin-Neuronenmedium (DPM) mit 0,46 % D-Glukose, 1 % L-Glutamin, 1 % N2, 0,2 % Primocin vor, ergänzt mit DMEM/F12. Filtern Sie den DPM, nachdem Sie die Zutaten gemischt haben. DPM bei 4 °C lagern und jedes Aliquot nur einmal erwärmen.
   Anmerkung: DPM sollte keinen Glia-abgeleiteten neurotrophen Faktor (GDNF) enthalten, da er die Akkumulation von α-Synuclein in Dopamin-Neuronen reduziert.
2. Bereiten Sie silikonisierte Glaspipetten vor, die extrem hydrophob sind, um die Anhaftung an der Oberfläche und den Verlust von Zellen bei der ersten Handhabung embryonaler Neuronen zu minimieren.
   1. 10 ml Silikonisierungsflüssigkeit zu 1 l destilliertem Wasser geben und unter Rühren in einem 2-Liter-Gefäß mischen. Lassen Sie die Glaspipetten 15 Minuten lang in die Silikonisierungslösung eintauchen.
   2. Spülen Sie die Pipetten 3–5x mit destilliertem Wasser aus. Trocknen Sie die Pipetten über Nacht bei Raumtemperatur (RT) oder 1-2 h bei 100-120 °C beheiztem sterilen Raum, um die Trocknung zu beschleunigen.
   3. Sterilisieren Sie die Pipetten durch Standardautoklavieren in einem versiegelten Autoklavenbeutel.
Bereiten Sie mit
3. Poly-L-Ornithin (PO) beschichtete 96-Well-Platten mit transparentem Boden vor, indem Sie 60 μl PO-Lösung in die mittleren Vertiefungen der 96-Well-Platte geben, die für die Aussaat der Neuronen verwendet werden sollen, wobei mindestens eine Reihe/Spalte mit Vertiefungen an den Rändern der Platte verbleibt, um Kanteneffekte zu vermeiden. Halten Sie die beschichtete Platte über Nacht bei 4 °C oder 4 h bei RT.
4. Vor dem Plattieren der Zellen wird PO vollständig aspiriert und die Zellen dreimal mit 100 μl 1x Phosphatpuffersalzlösung (PBS) gewaschen. Aspirieren Sie 1x PBS aus den Vertiefungen und halten Sie den Deckel der Platte zum vollständigen Trocknen offen.
   Anmerkung: Es ist möglich, gebrauchte Bestellungen zu sammeln und für die Wiederverwendung zu filtern. Dies kann für dieselbe Bestelllösung zweimal wiederholt werden.
5. Geben Sie 50 μl DPM in die zuvor beschichteten Vertiefungen. Aspirieren Sie DPM mit einer 100-μl-Kunststoffspitze aus den Vertiefungen und kratzen Sie gleichzeitig den Boden der Vertiefung mit kreisenden Bewegungen an, um die Beschichtung am Umfang jeder Vertiefung zu entfernen. In der Mitte des Bohrlochs verbleibt eine PO-beschichtete Insel.
6. Geben Sie unter einer laminaren Haube 10 μl DPM in die Mitte jeder beschichteten Insel, um Mikroinseln zu erzeugen.
   Anmerkung: Eine Platte mit DPM-bedeckten Mikroinseln kann während der Isolierung der Zellen 1–2 h unter der Laminar-Flow-Haube aufbewahrt werden.

>2. Isolierung des ventralen Mittelhirnbodens aus E13.5 Mausembryonen

HINWEIS: Siehe Abbildung 1 für die Schritte zur Bodendissektion des Mittelhirns.

1. Füllen Sie vor dem Sezieren eine 10 cm große Petrischale mit Dulbecco-Puffer und stellen Sie sie auf Eis.
2. Euthanasieren Sie eine E13.5-trächtige weibliche Maus gemäß den Richtlinien der Einrichtung. Legen Sie die Maus flach auf den Rücken und besprühen Sie den vorderen Körper mit 70% Ethanol. Heben Sie die Haut mit einer Pinzette über die Gebärmutter und machen Sie einen Schnitt mit einer chirurgischen Schere, um die Gebärmutter freizulegen.
3. Entfernen Sie vorsichtig die Gebärmutter und legen Sie sie in die zuvor vorbereitete Petrischale auf Eis.
4. Entnehmen Sie mit einer chirurgischen Schere unter der laminaren Haube bei RT vorsichtig die Embryonen aus der Gebärmutter. Entfernen Sie alle Plazentareste mit einer Pinzette von den Embryonen und legen Sie sie in eine neue 10 cm Petrischale, die mit Dulbecco-Puffer gefüllt ist.
5. Schneiden Sie mit einer Präparierzange oder Nadel das Hinterviertel des Kopfes an den Stellen ab, die in Abbildung 1A mit schwarzen Pfeilen markiert sind. Nehmen Sie das abgeschnittene Stück vom Rest des Embryos weg (Abbildung 1B).
6. Platzieren Sie den hinteren Teil des geschnittenen Stücks in Richtung des Betrachters (Abbildung 1C) und schneiden Sie es vorsichtig von kaudal zu kranial auf (Abbildung 1D). Schneiden Sie 0,5 mm unterhalb der Schädelöffnung einen Bereich von^{2 mm 2}–3 mm² ab, wie in Abbildung 1E gezeigt.
7. Sammeln Sie den ventralen Mittelhirnboden (siehe Abbildung 1F) in einem leeren 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie das Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis, bis sich alle Mittelhirnböden darin angesammelt haben.
   Anmerkung: Alternativ können die Mittelhirnböden nach der Dissektion aller Embryonengehirne mit einer 1 ml-Mikropipette entnommen werden.

>3. Etablierung primärer embryonaler Mittelhirnkulturen aus E13.5-Mausembryonen im 96-Well-Plattenformat

1. Nach der Entnahme der Mittelhirnböden aller Embryonen im selben 1,5-ml-Röhrchen entfernen Sie den restlichen Dulbecco-Puffer und waschen Sie die Gewebestücke dreimal mit 500 μl Ca²⁺, Mg²⁺-freier Hank's Balanced Salt Solution (HBSS).
2. Entfernen Sie HBSS und geben Sie 500 μl 0,5 % Trypsin in das Röhrchen. Inkubieren Sie es bei 37 °C für 30 Minuten.
3. Während der Inkubation 1,5 ml fötales Rinderserum (FBS) bei 37 °C erwärmen, 30 μl DNase I in das FBS geben und mischen. Polieren Sie außerdem die Spitze einer Pipette aus silikonisiertem Glas. Stellen Sie sicher, dass das Loch keine scharfen Kanten aufweist und etwa die gleiche Größe wie eine 1-ml-Mikropipettenspitze hat.
   HINWEIS: Alternativ kann eine 1-ml-Mikropipettenspitze mit geringer Adhäsion für die Verreibung verwendet werden. Silikonisierte Glaspipetten scheinen jedoch die besten Ergebnisse zu liefern.
4. Sobald die Inkubation in Schritt 3.2 beendet ist, geben Sie 500 μl des FBS/DNase-Gemisches in das teilweise verdaute Gewebe. Verwenden Sie die Glaspipette, um das Gewebe in der FBS/Trypsin-Mischung zu zerreiben. Zerreiben, bis das Gewebe in winzige, kaum sichtbare Partikel zerfällt. Vermeiden Sie Blasen während der Verreibung.
5. Lassen Sie die übrig gebliebenen Partikel am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens durch die Schwerkraft ausfällen. Ohne den Niederschlag am Boden zu pipettieren, den Überstand in ein leeres konisches 15-ml-Polypropylen-Röhrchen auffangen.
6. FBS/DNase I aus Schritt 3.3 (98:2) mit 1.000 μl HBSS verdünnen, um FBS/DNase-I/HBSS (49:1:50) zu erhalten. Mischen Sie, indem Sie auf und ab pipettieren. Geben Sie 1.000 μl der neuen Mischung zu den übrig gebliebenen Partikeln im Mikrozentrifugenröhrchen. Trituieren Sie erneut und wiederholen Sie Schritt 3.5.
7. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt noch einmal, um alle FBS/DNase-I/HBSS aufzubrauchen (49:1:50).
8. Sobald der gesamte Überstand im 15-ml-Röhrchen gesammelt ist (aus den Schritten 3.5, 3.7 und 3.8), verwenden Sie eine Tischzentrifuge, um den Überstand (~3 ml) bei 100 x g für 5 Minuten abzuschleudern. Entfernen Sie den Überstand, ohne die pelletierten Zellen am Boden zu berühren.
9. Waschen Sie das Zellenpellet, indem Sie 2 mL DPM in das Röhrchen geben und es 5 Minuten lang bei 100 x g herunterschleudern. Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie das Waschen 2x, um den Schmutz in den pelletierten Zellen zu minimieren.
   HINWEIS: Verwenden Sie für die kultivierten Neuronen immer frisches, erwärmtes DPM. Für die Waschschritte muss DPM nicht frisch sein, sondern sollte auf 37 °C vorgewärmt werden.
10. Verdünnen Sie die Zellen mit frischem, warmem DPM und geben Sie sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Die Menge an DPM für die Verdünnung hängt von der Anzahl der Embryonen ab, die für die Gewebedissektion verwendet werden. Verwenden Sie zum Beispiel 150 μl DPM, um die Zellen von zehn Embryonen zu verdünnen.
11. Übertragen Sie 10 μl Zellen in DPM in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Mischen Sie sie mit 10 μl 0,4 % Trypanblau-Fleck. Zählen Sie lebende (d. h. Trypanblau-negative) Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.
    HINWEIS: Verwenden Sie 30.000 Zellen für die Beschichtung pro Well, um ~1.000 Dopamin-Neuronen pro Well zu erhalten. Wenn die Zelldichte höher als ~30.000 Zellen pro 6 μl ist, verdünnen Sie die Zellen vor dem Plattieren weiter mit DPM, so dass das Aussaatvolumen nicht weniger als 6 μl beträgt.
12. Entfernen Sie, ohne den Boden der Vertiefungen zu berühren, den DPM von den Mikroinseln, die in Schritt 1.6 erstellt wurden.
13. Um eine reproduzierbare Zelldichte in jeder Vertiefung zu erhalten, mischen Sie die Zellen durch sanftes Pipettieren vor dem Plattieren in der Vertiefung. Geben Sie mit einer Mikropipette von 1 bis 10 μl 6 μl Zellen in die Mitte der Vertiefung an der Stelle jeder ehemaligen Mikroinsel
.
14. Füllen Sie die leeren Vertiefungen an den Rändern der Platte mit 150 μl Wasser oder 1x PBS, um die Verdunstung aus den Vertiefungen mit neuronalen Kulturen zu minimieren. Die Platte in einem Inkubator bei 37 °C, 5 % CO₂ 1 h inkubieren.
15. Nehmen Sie nach 1 Stunde die Platte aus dem Inkubator, geben Sie 100 μl DPM in jede Vertiefung mit den Zellen und setzen Sie sie wieder in den Inkubator ein.
16. Zwei Tage nach der Beschichtung (Tag in vitro 2 oder DIV2) entfernen Sie 25 μl und fügen Sie 75 μl frisches DPM hinzu, um das endgültige Medienvolumen auf 150 μl zu bringen und Verdunstung so weit wie möglich zu vermeiden.
17. Tauschen Sie die Hälfte des Mediums gegen frisches DPM aus (d. h. entfernen Sie 75 μl und fügen Sie 75 μl frisches DPM hinzu) bei DIV5. Führen Sie nach DIV5 keine Medienwechsel mehr durch.

>4. Induktion von α-Synuclein-Aggregaten in primären embryonalen Dopamin-Neuronen durch Aussaat mit vorgeformten Fibrillen

Nach jeder Arbeit mit α-Synuclein-vorgeformten Fibrillen (PFFs), reinigen Sie die Laminarhaube oder andere Geräte, die mit den PFFs in Kontakt gekommen sein könnten, mit 1% Natriumdodecylsulfat (SDS), dann mit 70% Ethanol.

1. Verdünnen Sie die PFFs vor dem Experiment mit 1x PBS auf eine Endkonzentration von 100 μg/ml. Beschallung der verdünnten PFFs in Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Badbeschallungsgerät bei hoher Leistung und Wasserbadkühlung bei 4 °C für 10 Zyklen, 30 s EIN/30 s AUS.
   Anmerkung: Es ist entscheidend, dass die Fibrillen richtig beschallt werden, um Fragmente mit einer Länge von ~50 nm zu erzeugen. Die Größe von beschallten PFFs kann direkt aus transmissionselektronenmikroskopischen Bildern von gefärbten PFFs gemessen werden. Die Beschallung kann wie oben beschrieben in einem Hochleistungsbadsonicator erreicht werden. Alternativ kann ein Spitzensonicator verwendet werden. Beschallte PFFs können bei -80 °C in kleinen Aliquoten gelagert werden, um mehrere Gefrier-/Auftauzyklen zu vermeiden.
2. Geben Sie auf DIV8 3,75 μl 100 μg/ml PFFs pro Vertiefung zu den 150 μl Medium in der Vertiefung bis zu einer Endkonzentration von 2,5 μg/ml. Verwenden Sie die gleiche Menge an 1x PBS für die Kontrollgruppe.
3. Bereiten Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x PBS vor und lagern Sie die Aliquote bei -20 °C. Führen Sie dazu die folgenden Schritte aus.
   HINWEIS: PFA ist giftig; Tragen Sie während der Vorbereitung eine Maske und Handschuhe, arbeiten Sie immer unter einer laminaren Haube und entsorgen Sie alle festen und flüssigen PFA-Abfälle gemäß den Anweisungen der Einrichtung.
   1. 500 mL 1x PBS in einem 1 L Gefäß erwärmen. Legen Sie einen Rührstab in das Gefäß und stellen Sie das Gefäß auf einen Magnetrührer mit Heizfunktion. Stellen Sie die Temperatur zwischen 40 und 60 °C ein, um ein Kochen zu verhindern, während die Lösung warm gehalten wird.
   2. Messen Sie 20 g PFA-Pulver unter der Haube in einem Einweg-Messbehälter aus Kunststoff ab. Geben Sie das PFA-Pulver vorsichtig in das mit 1x PBS gefüllte Gefäß. Beginne mit dem Rühren der Lösung.
   3. Geben Sie 200 μL 5 M Natriumhydroxid in die Lösung und rühren Sie ~15 min weiter, bis sich das PFA vollständig aufgelöst hat.
   4. Nachdem die Lösung homogen erscheint, fügen Sie 168 μl 5 M Chlorwasserstoff hinzu, um den pH-Wert auf ~7 auszugleichen. Überprüfen Sie den pH-Wert mit farbfixierten Einweg-pH-Indikatorstreifen.
   5. Nehmen Sie das Gefäß aus der Heizung und lassen Sie es auf RT abkühlen. Filtern Sie die Lösung und das Aliquot für die Lagerung bei -20 °C. Tauen Sie die Aliquote vor dem Gebrauch bei RT auf und frieren Sie sie danach nicht wieder ein.
4. Entfernen Sie bei DIV15 alle Medien durch Pipettieren aus den Vertiefungen. Geben Sie 50 μl 4% PFA in jede Vertiefung, um die Zellen zu fixieren, und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei RT. Entfernen Sie nach der Inkubation das PFA aus den Vertiefungen und geben Sie 100 μl 1x PBS in jede Vertiefung, um die Zellen zu waschen. 1x PBS entfernen und 2x mehr waschen.
5. Lassen Sie 100 μl 1x PBS in jeder Vertiefung, um ein Austrocknen zu vermeiden. Lagern Sie die Platte bei 4 °C, bis eine Immunchemie durchgeführt wurde.

>5. Immunfluoreszenzfärbung und automatisierte Bildgebung von primären embryonalen Dopamin-Neuronen in 96-Well-Platten

1. Entfernen Sie 1x PBS und permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie 100 μl 0,2% Triton X-100 in PBS (PBST) pro Vertiefung hinzufügen und 15 Minuten lang bei RT inkubieren.
2. Entfernen Sie PBST und geben Sie 50 μl 5 % normales Pferdeserum (NHS) pro Vertiefung zum PBST. Um die unspezifische Antigenaktivität zu blockieren, inkubieren Sie 1 h lang bei RT.
3. Verdünnen Sie die Primärantikörper gegen Tyrosinhydroxylase (TH) und pS129-αsyn (1:2.000) in 5 % NHS in PBST. Geben Sie 50 μl verdünnte Antikörper in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C.
4. Entfernen Sie Antikörper und geben Sie 100 μl 1x PBS in jede Vertiefung, um die Zellen zu waschen. Entfernen Sie 1x PBS und wiederholen Sie das Waschen 2x.
5. Um das Ausbleichen von fluoreszierenden Molekülen zu verhindern, beginnen Sie bei minimalen Lichtverhältnissen mit der Arbeit. Verdünnen Sie die sekundären fluoreszenzmarkierten Antikörper (1:400) in PBST. Geben Sie 50 μl verdünnte Antikörper in jede Vertiefung und inkubieren Sie 1 h lang bei RT.
6. Entfernen Sie die Antikörperlösung und geben Sie 100 μl 1x PBS in jede Vertiefung, um die Zellen zu waschen. Entfernen Sie 1x PBS und wiederholen Sie das Waschen 2x.
7. Entfernen Sie 1x PBS, fügen Sie 50 μl 200 ng/ml 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) pro Vertiefung hinzu, um die Zellkerne der kultivierten Zellen zu färben, und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei RT.
8. Waschen Sie die Zellen 3x mit 100 μL von 1x PBS für jeweils 5 min. Bewahren Sie nach der letzten Wäsche 100 μl 1x PBS in jeder Vertiefung auf. Decken Sie die Platte mit Alufolie ab und lagern Sie sie bis zur Bildgebung bei 4 °C.
9. Bilden Sie primäre embryonale Dopamin-Neuronen in einer 96-Well-View-Platte mit einem High-Content-Plattenscanner (siehe Materialtabelle) ab, der mit einem 10-fach-Objektiv ausgestattet ist.
10. Passen Sie die Einstellungen basierend auf den Spezifikationen der 96-Well-Platte an, z. B. Plattentyp, Hersteller, Größe, Abstand zwischen den Wells sowie Art und Menge des Mediums.
11. Wählen Sie den Bildgebungsbereich der Vertiefung aus, um alle Zellen in einer Mikroinsel abzudecken. Wählen Sie ein Beispiel aus, um den Autofokus anzupassen. Stützen Sie den anfänglichen Fokus auf DAPI.
12. Kalibrieren Sie die Erfassungszeit für jeden Fluoreszenzkanal basierend auf der Intensität der Färbung in den Kontrollvertiefungen. Passen Sie die Parameter so an, dass in PFF-behandelten Kontrollwells Dopaminzellen, die pS129-αsyn-Aggregate in Zellsoma beherbergen, eindeutig unterschieden werden können, was eine eindeutige Quantifizierung von pS129-αsyn-positiven und pS129-αsyn-negativen Zellen ermöglicht.
    Anmerkung: Vertiefungen, die keine PFFs enthalten, sollten keine Färbung für pS129-αsyn aufweisen; Daher können diese Wells als Negativkontrolle zur Einstellung der pS129-αsyn-Intensität verwendet werden.
13. Bilden Sie alle ausgewählten Wells mit einem 10x-Objektiv gleichzeitig für alle Kanäle mit Immunfluoreszenzfärbung mit genau denselben Parametern ab.
14. Optional werden α-Synuclein-Einschlüsse in einer Untergruppe der Vertiefungen mit Antikörpern markiert, die spezifisch für filamentöse α-Synuclein sind, um zu bestätigen, dass Veränderungen in der Anzahl der pS129-αsyn-positiven Einschlüsse eher die Verringerung der Proteinakkumulation als eine Hemmung der Phosphorylierung oder Dephosphorylierung von pS129-αsyn widerspiegeln.
15. Wiederholen Sie Schritt 5.3, und ersetzen Sie den pS129-αsyn-Antikörper durch einen α-Synuclein-Filament-Antikörper (1:2.000). Bilden Sie das gefärbte aggregierte α-Synuclein wie in Schritt 5.13 ab.

Results

Abbildung 1: Sektion des Mittelhirnbodens von E13.5 Mausembryo. (A) Die Schnittstellen im Hinterviertel des Kopfes sind mit schwarzen Pfeilen und weißen gestrichelten Linien markiert. (B) Das Stück wurde aus dem Rest des Embryos entfernt. Das entnommene Stück wird eingekreist. (C) Das Stück wurde um 90° gedreht, so dass es nach hinten zum Betracht...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,4 % Trypanblau-Beize	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	15250061
15 ml CELLSTAR Tube aus Polypropylen	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland	188261
4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Vereinigte Staaten von Amerika	10236276001
5 M HCl	N/A	N/A	Medienküche, Institut für Biotechnologie, Universität Helsinki
5 M NaOH	N/A	N/A	Medienküche, Institut für Biotechnologie, Universität Helsinki
96-Well-ViewPlate (Schwarz)	PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, Vereinigte Staaten von Amerika	6005182
99,5 % Ethanol (EtOH)	Altia Oyj, Rajamäki, Finnland	N/A
AquaSil Silikonisierungsflüssigkeit	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	TS-42799
Autoklaviertes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen	N/A	N/A	Medienküche, Institut für Biotechnologie, Universität Helsinki
Bioruptor-Beschallungsgerät	Diagenode, Lüttich, Belgien	B01020001
Ca2+, Mg2+-freie Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	Artikel-Nr.: 14175-053
Softwarepakete CellProfiler und CellAnalyst	N/A	N/A	Freie Open-Source-Software
Zentrifuge 5702	Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland	5702000019
CO2-Inkubator	HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	N/A
Zählkammer	BioRad Inc., Hercules, Kalifornien, USA	1450015
DeltaVision Ultra High Resolution Mikroskop mit Lufttisch und Schrank	GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA	29254706
Desoxyribonuklease-I (Dnase I)	Roche, Basel, Schweiz	22098700
D-Glukose	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. G8769
DMEM/F12	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	Nr. 21331–020
Anti-Maus für Esel AlexaFluor 488	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	Nr. A21202
Anti-Kaninchen für Esel AlexaFluor 647	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	Nr. A31573
Anti-Schafe für Esel AlexaFluor 488	Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	Nr. A11015
Der Puffer von Dulbecco	N/A	N/A	Medienküche, Institut für Biotechnologie, Universität Helsinki
Fötales Rinderserum (FBS)	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	10500056
Fisherbrand Plain Economy PTFE-Rührstäbchen	fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	11507582
ImageXpress Nano Automatisiertes Bildgebungssystem	Molecular Devices, San Jose, Kalifornien, USA	N/A
L-Glutamin	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	Nr. 25030–032
Monoklonale Anti-Tyrosin-Hydroxylase der Maus	Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Deutsch	MAB318
N2-Ergänzung	Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	Nr. 17502–048
Normales Pferdeserum	Vector Laboratories Inc., Burlingame, Kalifornien, Vereinigte Staaten	Nr. S-2000
Paraformaldehyd (PFA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Vereinigte Staaten von Amerika	158127
Paraformaldehyd-Pulver, 95%	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Vereinigte Staaten von Amerika	158127
pH-Fix, farbfixierte Indikatorstreifen	Macherey-Nagel, Düren, Deutschland	92110
Phospohat-Puffer-Kochsalzlösung (PBS)	N/A	N/A	Medienküche, Institut für Biotechnologie, Universität Helsinki
Poly-L-Ornithin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. P4957
Primocin	InvivoGen, San Diego, Kalifornien, USA	Ant-PM-1, Ant-PM-2
Kaninchen monoklonales Anti-Alpha-Synuclein-Filament	Abcam, Cambridge, Vereinigtes Königreich	Artikel-Nr.: ab209538
Monoklonales Anti-Phospha-Serin129-alpha-Synuclein für Kaninchen	Abcam, Cambridge, Vereinigtes Königreich	AB51253
RCT Basic, IKA Magnetrührer	IKA-Werke® GmbH, Staufen, Deutschland	Artikel-Nr.: 3810000
rekombinanter humaner Glia-abgeleiteter neurotropher Faktor (hGDNF)	PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA oder Prospec, Ness-Ziona, Israel	450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec)
rekombinante Maus-Alpha-Synuclein-vorgeformte Fibrillen (PFFs)	N/A	N/A	Geschenk von Mitarbeiter, Prof. Kelvin C Luk
Stereomikroskop-System für die Forschung	Olympus Corporation, Tokio, Japan	SZX10
Polyklonale Anti-Tyrosin-Hydroxylase für Schafe	Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, Deutsch	AB1542
TC 20 Automatisierter Zellzähler	BioRad Inc., Hercules, Kalifornien, USA	1450102
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Vereinigte Staaten von Amerika	11332481001
Trypsin	MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China	Artikel-Nr.: 2199700