$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Mikrovermischung RT Reaction
- Vor der Durchführung einer RT-Reaktion mit Mikrovermischung, bringen die Mikromischer auf die gewünschte Temperatur der RT-Reaktion.
- Legen Sie die Mikromischer in einem 37 ° C (oder die Temperatur durch die RT Lieferant empfohlen) Inkubator für mindestens 1 Stunde vor Beginn der RT-Reaktion.
- Richten Sie die RT-Mix nach dem Reverse-Transkriptase-Lieferanten (zB MMTV-RT von Promega, Omniscript von Qiagen) Anweisungen, außer Nutzung Single-Cell-Mengen-Eingang Gesamt-RNA (z. B. 0.1-1pg/μl), anstelle der ng-pg Beträge, die Lieferanten zu empfehlen.
- Wir verwenden Standard-sterile, Nuklease-freies 200 ul dünnwandigen PCR-Gefäße.
- Position RT Rohre sicher in den Mikromischer, sobald sie bereit sind für das Mischen sind. Die Mikromischer sollte innerhalb der 37 ° C Inkubator für die Dauer der RT-Reaktion bleiben.
- Wählen Sie die gewünschte Frequenz und Amplitude Mikrovermischung. In diesem Beispiel verwenden wir 150Hz.
- Schalten Sie den Mikromischer auf und lassen Sie es für die gesamte Dauer der RT-Reaktion (60 Minuten).
- Schalten Sie den Mikromischer aus und nehmen Sie die RT Rohre aus, wenn die RT-Reaktion abgeschlossen ist.
- Legen Sie die RT Röhrchen auf Eis, und fahren wie gewohnt mit weiteren Anwendungen wie quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR oder real-time PCR).
2. Repräsentative Ergebnisse:
Der Vorteil der Mikrovermischung im Rahmen der RT-Reaktionen ist eine Erhöhung der cDNA Ausbeute bezogen auf, wenn andere Mischverfahren (zB Zittern, Vortexen oder Verreibung) verwendet werden. Dies zeigt sich zum Beispiel bei der anschließenden Analyse der cDNA mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR oder real-time PCR) werden. Abbildung 2A zeigt die Auswirkungen der Mikrovermischung für die ersten 5 Minuten (blau, "micromixed5") oder den gesamten 60 Minuten (rot, "micromixed60"), verglichen mit Verreibung der RT-Reaktion unmittelbar vor der RT Inkubation (schwarz, "Verreiben" ). In diesem Fall wird die Lautstärke des vorangegangenen RT-Reaktion wurde 25 &mgr; l, und es enthielt 2.5pg von Gesamt-RNA. qPCR Spuren unter Verwendung der Primer entwickelt, um cDNA repräsentiert Nurr-1 mRNA erkennen sind oben gezeigt, und die Mittelwerte ± SEM der Anzahl der Zyklen bis 50% maximale Fluoreszenz in 3 Wiederholungen desselben Experiments zu erreichen sind nachfolgend dargestellt. Das Sternchen bedeutet einen statistisch signifikanten Unterschied (one-way ANOVA mit Tukey multiple Vergleiche). Beachten Sie, dass Mikrovermischung für die ersten 5 Minuten des vorangegangenen RT-Reaktion eine nicht-signifikante Verbesserung gegenüber Verreibung hergestellt, während Mikrovermischung für den gesamten 60 Minuten der vorhergehenden RT-Reaktion zu einer signifikanten Verbesserung gegenüber Verreibung, deren Größe entsprach etwa 15 qPCR Zyklen im Durchschnitt.
Der Vorteil der Mikrovermischung kann auch in Schmelzkurvenanalyse der nachfolgenden qPCR erhaltenen Produkte gesehen werden. In dem Experiment in Abbildung 2B dargestellt, Mikrovermischung für den gesamten 60 Minuten der vorhergehenden RT-Reaktion führte zu einer konsequenten qPCR-Signal in zwei Proben (Abbildung 2Ba, 2 rote Spuren), während Mikrovermischung für die ersten 5 Minuten oder Verreibung nur produziert inkonsistent qPCR Spuren (Abbildung 2Ba, 2 blaue Spuren und 2 schwarzen Spuren, jeweils). Der graue Spuren sind negative Kontrollen ("neg."), In der cDNA aus der qPCR-Reaktion wurde nach links. Wenn die qPCR Produkten aus diesem Experiment wurden denaturiert durch Rampen ihre Temperatur (dh Schmelzkurvenanalyse) war es offensichtlich, dass geeignete PCR-Produkte (dh ein Amplikon derjenigen identisch ist, erhält man, wenn viel höhere Konzentrationen des mRNA revers transkribiert wurden und durch qPCR amplifiziert wurde, Daten nicht gezeigt) waren nur folgende RT Reaktionen, die für 60 Minuten (Abbildung 2Bb, 2 rote Spuren) war micromixed. Alle anderen (dh micromixed5, Zerreiben und negative Kontrollen) generiert alternative Amplikon Produkte (zB Primer-Dimere).
Abbildung 1. Fließschema des Protokolls für die Anwendung Mikrovermischung Standard-Labor-RT-Reaktionen. Genauere Beschreibungen des physikalischen Prinzips beteiligt, die Mikromischer und wie eine in-house Mikromischer bauen in Verweise 13,14 zur Verfügung gestellt
Abbildung 2. Representative qPCR-Daten, welche die Vorteile der Mikrovermischung zu vorangegangenen RT-Reaktionen mit Single-Cell-Mengen von mRNA in sonst üblichen Labor-RT-Reaktionen eingesetzt. Ein Beispiel qPCR Spuren erkennen cDNA repräsentiert mRNA codiert Nurr-1-Gen. Die vorstehenden RT Reaktionen enthielten 2.5pg von Gesamt-RNA in einem Volumen von 25 &mgr; l und wurden in einem Brutschrank bei 37 ° C für 60 Minuten durchgeführt. RT-Reaktionen wurden durch Verreiben der R gemischtT-Mix vor der Inkubation (schwarz Spuren ", Verreibung"), während der ersten 5 Minuten der RT-Reaktion (blau Spuren ", micromixed5") micromixed oder micromixed für den gesamten 60 Minuten der RT-Reaktion (rot Spuren ", micromixed60" ). Mittelwert ± SEM der Anzahl der qPCR-Zyklen erforderlich, um 50% maximale Fluoreszenz zu erreichen sind nachfolgend für n = 3 dargestellt Wiederholungen dieses Experiments. Asterisk zeigt einen signifikanten Unterschied (one-way ANOVA mit Tukey multiple Vergleiche). B Ein weiterer qPCR Experiment untersucht Nurr-1 cDNA-Produkt, diesmal nach RT-Reaktionen, die 25pg von Gesamt-RNA in einem Volumen von 25 &mgr; l. qPCR Spuren (a) sowie Schmelzkurvenanalyse der qPCR Produkten erhalten (b) sind für die verschiedenen Misch-Bedingungen gezeigt. Negative Kontrollen, in denen keine cDNA in den vorangegangenen RT-Reaktion enthalten war sind ebenfalls enthalten (graue Spuren ", neg."). RT-Reaktionen mit sehr viel höheren Konzentrationen von mRNA wurden ebenfalls durchgeführt und produziert Schmelzkurve Peaks (Daten nicht gezeigt) identisch mit denen in (b) für micromixed60 (rote Kurven) Proben.