Erzeugung eines Verschlusses der mittleren Hirnarterie bei einem Rattenwelpen zur Induktion einer lokalen Hirnischämie

Zusammenfassung

Quelle: Larpthaveesarp, A., et. al. Transientes Modell des Verschlusses der mittleren Hirnarterie des neonatalen Schlaganfalls bei P10-Ratten. J. Vis. exp. (2017)

Dieses Video zeigt die Etablierung des Modells des Verschlusses der mittleren Hirnarterie bei einem Rattenwelpen. Die Arteria carotis interna (ICA) wird freigelegt und eine Ligatur wird gesichert, um den Blutfluss zu begrenzen. Durch die ICA wird ein Verschluss eingeführt, um die Arteria cebraralis media zu erreichen. Der Welpe darf sich dann erholen, bevor er weiter analysiert wird.

Protokoll

Alle Verfahren, bei denen Tiermodelle zum Einsatz kommen, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss der JoVE überprüft.

1. Verschluss der mittleren Hirnarterie

1. Wiegen Sie den Welpen und stellen Sie sicher, dass er das richtige Gewicht (19-21 g) hat. Betäuben Sie den Welpen mit 3 % Isofluran in 100 % Sauerstoff (O₂) und stellen Sie sicher, dass es keine Reaktion auf ein Einklemmen des Fußes gibt. Halten Sie die Körperoberflächentemperatur zwischen 35,5 °C und 37 °C mit einem Heizkissen unter dem Operationstisch.
2. Befestigen Sie das Tier in Rückenlage mit Klebeband über die Schulterregionen. Tupfen Sie mit sterilen Wattestäbchen den vorderen Gebärmutterhalsbereich mit einer Povidon-Jod-Lösung ab, gefolgt von einem Tupfer mit 70 % Ethanol in doppelt destilliertem Wasser, wobei Sie zwischen jeder Lösung für insgesamt vier Tupfer wechseln.
3. 0,25 % Bupivacain lokal in die geplante Inzisionsstelle infiltrieren. Führen Sie mit einem Stereoskop einen Mittellinienschnitt von 5 bis 7 mm an der vorderen Halsschlagader durch, um die Arteria carotis communis (CCA) freizulegen. Platzieren Sie 2-4 Retraktoren, um die Kavität offen und die Arterie freizulegen.
4. Lokalisieren Sie die Arteria carotis interna (ICA), die Arteria occipitalis (OA) und die Arteria carotis externa (ECA). Pflegen Sie die Arterien, um eine klare Sicht zu erhalten. Achten Sie darauf, den Vagusnerv nicht zu stören.
   HINWEIS: Bei scheinoperierten Welpen wird der Schnitt offen gelassen und die Arterien freigelegt, wonach der Schnitt zugenäht wird. Die Gesamtnarkosezeit entspricht der der Okklusionsoperation.
5. Schneiden Sie 1,5 cm 6-0 geflochtenen Seidenfaden ab. Flechten Sie die Naht und ziehen Sie einzelne Strähnen heraus. Achte darauf, dass die einzelnen Stränge sauber und nicht ausgefranst sind.
   HINWEIS: Glätten Sie bei Bedarf die ausgefransten Enden, indem Sie den einzelnen Strang in steriles Wasser tauchen und den Strang mit Pinzettenspitzen pflegen.
6. Während Sie den Nahtstrang mit einer 45-Grad-Pinzette halten, bewegen Sie die Pinzette in einer geschwungenen Bogenbewegung, um unter die ICA zu gelangen, so dass die Pinzettenspitzen zwischen ICA und OA hervortreten.
   HINWEIS: Wenn die Sektion gut gemacht ist, wird dieser Schritt relativ einfach sein. Wenn sich ICA und OA berühren, achten Sie darauf, dass die Arterien nicht platzen, wenn Sie die Pinzette verwenden, um die ICA zu isolieren. Wenn Blutungen auftreten, üben Sie mit der Zange Druck auf die Arterie aus, bis die Blutung aufhört. Nehmen Sie das Blut mit einem sterilen Tupfer auf.
7. Fassen Sie das Ende des Nahtstrangs, das von der Pinzette gehalten wird, und ziehen Sie daran, so dass das Ende leicht zugänglich ist. Lösen Sie den Strang von der Pinzette und ziehen Sie die Pinzette unter dem ICA hervor, wobei Sie die Bewegung in Schritt 1.5 umkehren (Abbildung 1A).
8. Binden Sie eine temporäre Ligatur um den ICA an der Basis, am nächsten an der Stelle, an der er sich vom CCA trennt.
   HINWEIS: Es ist wichtig, den Knoten so zu binden, dass das Ende des Strangs, an dem gezogen wird, um den Knoten zu entfernen, lang genug ist (mehr als 1 mm, weniger als 3 mm), um ihn leicht mit einer Pinzette zu greifen, während sichergestellt wird, dass auf der anderen Seite des Knotens eine angemessene Menge an Nahtstrang für die Zurückziehung vorhanden ist.
9. Ziehen Sie den ICA vorsichtig seitlich zurück und befestigen Sie den Strang mit einem Clip an der überschüssigen Haut in der Nähe der Achselregion auf der dem Schnitt gegenüberliegenden Seite. Stellen Sie sicher, dass dieser zurückziehende Strang straff genug ist, um den Blutfluss zu stoppen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren, um das Risiko unkontrollierter Blutungen zu minimieren. Beobachten Sie, dass die Arterie flach und blass ist.
   HINWEIS: Ziehen Sie nicht zu viel ein, da dies zu einem teilweisen oder vollständigen Riss des ICA führen kann. Die Retraktion kann kurz vor der Arteriotomie eingestellt werden, indem an dem Strang auf der dem Clip gegenüberliegenden Seite gezogen wird.
10. Greifen Sie mit einer 45°-Pinzette einen weiteren ungeflochtenen Nahtstrang und schlingen Sie ihn unter und um den ICA, wie in Schritt 1.5. Positionieren Sie diesen Strang lateral zum Retraktionsstrang (Abbildung 1B).
    HINWEIS: Dieser Schritt kann auch vor dem Zurückziehen durchgeführt werden. Wenn Sie sich über die Qualität der Retraktion unsicher sind, kann dieser Knoten vor dem nächsten Schritt sehr locker gebunden werden.
11. Schneiden Sie eine 0,2 mm große Arteriotomie auf halbem Weg zwischen der gebundenen und der ungebundenen Ligatur und irren Sie sich näher an die gebundene Ligatur.
    HINWEIS: Das in der abgebundenen Arterie verbleibende Blut kann durch die Arteriotomie entleert werden, sollte jedoch 5 μl nicht überschreiten. Wenn die Blutung anhält, ziehen Sie vorsichtig am Retraktionsstrang, um die Retraktion zu erhöhen, und achten Sie darauf, dass die Arterie nicht durch übermäßige Spannung beschädigt wird.
12. Messen Sie mit einem metrischen Lineal die Verschlussnaht und schneiden Sie die Naht mit einem zusätzlichen Aufmaß von 2-3 mm, um den Okkluder während der Reperfusion zu entfernen. Halten Sie den Okkluder mit einer 45-Grad-Pinzette fest und verwenden Sie eine gerade Pinzette, um eine Biegung in der richtigen Länge zu erzeugen, um den MCA zu erreichen und einen Stopppunkt für den Vorschub zu markieren.
    HINWEIS: Eine Okklusionslänge von 10 mm vom Ende der Silikonspitze bis zur Biegung wird für postnatale oder P-10 Sprague Dawley oder Long Evans Rattenbabys in diesem Gewichtsbereich verwendet.
13. Führen Sie mit einer 45°-Pinzette die silikonbeschichtete Nylon-Okklusionsnaht in die Arteriotomie ein und schieben Sie die Naht bis zu der Biegung vor, die den vorgegebenen Abstand zum MCA markiert (Abbildung 1C). Stellen Sie sicher, dass sich der Fortschritt reibungslos anfühlt. Stoppen Sie sofort den Vorschub, wenn ein Widerstand zu spüren ist. Während der Vorverstellung richten Sie die Naht in eine Richtung, die parallel zum CC/ECA in Richtung Kopf ist.
    HINWEIS: Wenn die Naht dorsal in Richtung der Wirbelsäule des Tieres vorgeschoben wird, kann sie in die Arteria pterygopalatina (PTA) laufen. Wenn nach 3-5 mm Vorschub ein Widerstand zu spüren ist, hat die Naht den PTA-Übergang getroffen. Ziehen Sie den Okkludor aus der Arterie zurück, bis sich der Silikonkopf in der Nähe der Arteriotomie befindet, bevor Sie die Vorschubrichtung einstellen. Es ist nicht notwendig, den Okkluder vollständig aus der Arteriotomie zu entfernen.
14. Sichern Sie den Okkluder, indem Sie eine provisorische Ligatur mit dem Strang aus Schritt 1.10 binden (Abbildung 1D).
15. Entfernen Sie den Retraktorclip. Schneiden Sie die Stränge der beiden temporären Ligaturen so ab, dass der Strang des Knotens, an dem gezogen wird, um den Knoten zu entfernen, mit einer geraden Pinzette leicht zu greifen ist und länger ist als der Strang, der gezogen wird, um den Knoten festzuziehen.
    HINWEIS: Die Strähnen müssen kurz genug sein, damit sie sich nach dem Verschluss nicht in der Kavität verheddern.
16. Entfernen Sie die Retraktoren und verschließen Sie den Hohlraum mit 6-0 geflochtener Seide, um drei bis vier unterbrochene Nähte zu erzeugen.
17. Nehmen Sie den Welpen aus der Narkose und legen Sie ihn auf ein Heizkissen an der Raumluft. Überwachen Sie den Jungen, bis er wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten, und stellen Sie sicher, dass er sich vollständig erholt hat, bevor Sie ihn zum Muttertier zurückbringen. Stellen Sie sicher, dass der Welpe eine Körperoberflächentemperatur zwischen 35,5 °C und 37 °C beibehält.

Ergebnisse

Abbildung 1: Chirurgische Live-Bilder des tMCAO-Verfahrens. (A) Der erste Nahtstrang wird um den ICA geschlungen, wie in Schritt 1.6 beschrieben. (B) Die erste provisorische Ligatur wird gebunden und die ICA zurückgezogen. Der zweite Nahtstrang wird um den ICA lateral des ersten Nahtstrangs geschlungen, wie in Schritt 1.9 beschrieben. (C) Die silikon...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Isoflourane	Henry Schein	50033<
Trinocular Surgioscope	World Precision Instruments	PSMT5N
Heizkissen	Sunbeam	000731-500-000<
IR Thermometer	Extech Instruments	72-5270
Retraction kit for small animals	Fine Science Tools	18200-20
CermaCut Scissors	Fine Science Tools	14958-09
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	112522-00	2x
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35<
B-2 Micro Clamp	Fine Science Tools	00398-02
Forcepts for Clamp Application	Fine Science Tools	00072-14
Micro Vannas Scissors	Fine Science Tools	15000-03	2mm cutting edge
Occlusion Sutures	Doccol	602123PK10	701712PK5Re
Ruler	Fine Science Tools
6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture	Ethicon	769G
Euthasol	Virbac	710101	0.22 ml/kg
Applikatoren mit Baumwollspitze	Henry Schein	100-9249<
Laboratory Tape	VWR	89097-990

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