Aufbereitung von plättchenreichem Plasma aus menschlichem peripherem Blut

Zusammenfassung

Dieses Video zeigt die Herstellung von hochwertigem plättchenreichem Plasma (PRP) durch Screening der Thrombozytenzahl, Entnahme und Zentrifugation von Blut und Isolierung von Blutplättchen. Dieses PRP wird in therapeutischen Anwendungen zur Geweberegeneration und -heilung eingesetzt.

Protokoll

Alle Eingriffe, an denen menschliche Teilnehmer beteiligt sind, wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen des Menschen durchgeführt und vom lokalen institutionellen Prüfungsausschuss überprüft.

1. Probenentnahme

1. Screenen Sie die Patienten anhand eines vorläufigen Blutbildes, um eine Thrombozytopenie auszuschließen und die Zellzahl zu Studienbeginn zu ermitteln. Verwenden Sie dazu ein Hämozytometer in klinischer Qualität für die Zellzählung. Stellen Sie sicher, dass die Thrombozytenzahl über 150.000 Zellen/μl liegt.

2. Stellen Sie sicher, dass der Patient vor der Probenentnahme gut hydriert ist. Dies kann durch eine visuelle Inspektion der Zunge, des Hautturgors und der Blutdruckmessung sichergestellt werden.

3. Entnehmen Sie 100 ml peripheres venöses Blut aus der Antekubitalvene des Patienten mit 2 x 50 ml-Spritzen, die mit 5 ml Säure-Citrat-Dextrose-Adenin (ACDA)-Antikoagulans im Verhältnis 1:10 gefüllt sind. Kippen Sie die gesammelten Spritzen, um das Antikoagulans richtig zu mischen, um eine Gerinnung der Blutprobe zu vermeiden, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
   HINWEIS: Eine langsame Blutabnahme kann zu einer unzureichenden Vermischung des gesammelten Blutes mit dem Antikoagulans und der Gerinnung führen; Verwenden Sie daher eine Kanüle von mindestens 18 G für die Blutentnahme.

4. Übertragen Sie 100 mL Blut in den Spritzen auf 15 mL Zentrifugationsröhrchen mit konischem Boden und 10 mL in jedem Röhrchen.

2. Zentrifugation und Isolierung

1. Die Zentrifugationsröhrchen in eine klinische Tischzentrifugationsmaschine legen, die bei Raumtemperatur in einer sterilen Umgebung gehalten wird, und den ersten weichen Schleudervorgang 15 Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 100 x g durchführen. Das antikoagulierte Blut teilt sich in drei Schichten, d.h. rote Blutkörperchen unten, Plasma oben und Buffy Coat in der Mitte.

2. Pipettieren Sie die obere Schicht der dreischichtigen Probe steril mit einer sterilen 18G-Spinalnadel und sammeln Sie sie in einem separaten Zentrifugationsröhrchen mit konischem Boden. Stellen Sie sicher, dass für jeweils 10 ml entnommenes Plasma einzelne Röhrchen verwendet werden.
   HINWEIS: Die Entscheidung, den Buffy Coat einzubeziehen, hängt von der Art des plättchenreichen Plasmas ab, das wir zu isolieren versuchen, was wiederum von der Art seiner klinischen Anwendung abhängt. Wenn leukozytenarmes PRP das gewünschte Produkt ist, verzichten Sie auf die Einbeziehung der Buffy-Coat-Schicht, während bei leukozytenreichem PRP das gewünschte Produkt ist, wird die oberste Plasmaschicht zusammen mit dem Buffy-Coat für die zweite Zentrifugationsrunde herauspipettiert.

3. Das gesammelte Plasma in 15-ml-Zentrifugationsröhrchen mit je 10 mL Plasma wird 20 Minuten lang einer Hard-Spin-Zentrifugation bei 1600 x g unterzogen. Die im Plasmapellet vorhandenen Blutplättchen am Boden des Reagenzglases. Sammeln Sie den Überstand in einem separaten Röhrchen.

4. Pipettieren Sie das Thrombozytenpellet mit Hilfe einer sterilen 18-G-Spinalnadel in eine 5-ml-Spritze. Sammeln Sie alle Reagenzgläser mit den Pellets in einer einzigen 5-ml-Spritze zum Auftragen.

5. Rekonstituieren Sie das gesammelte Pellet mit ausreichendem Volumen für die klinische Verwendung mit dem überstehenden Plasma im Zentrifugationsröhrchen nach der zweiten Zentrifugationsrunde.

3. Validierung

1. Das endgültige PRP wurde einer Zellzählung unter Verwendung eines Hämazytometers in klinischer Qualität unterzogen, um die Thrombozytenzahl zu berechnen und die absolute Thrombozytenzahl im PRP, den gegenüber dem Ausgangswert erreichten Thrombozytenkonzentrationsgradienten und die Wirksamkeit der Thrombozytenrückgewinnung des Protokolls unter Verwendung der folgenden Formel zu berechnen.
   Absolute Thrombozytenzahl = Thrombozytenzahl des PRP in μL x 1000 x Volumen PRP in mL
   Thrombozytenkonzentrationsgradient =
   Effizienz der Thrombozytenrückgewinnung =
   Zum Beispiel werden 100 ml Blut mit einer Thrombozytenzahl von 200.000 / μl zu Studienbeginn für die PRP-Zubereitung verwendet, und 5 ml PRP mit einer endgültigen Thrombozytenzahl von 3.000.000 / μl erhalten. Die oben genannten Parameter werden wie folgt berechnet:
   Absolute Thrombozytenzahl = 3.000.000 x 1000 x 5 = 15 Milliarden Thrombozyten
   Gradient der Thrombozytenkonzentration = 3.000.000 / 200.000 = 15{
   Effizienz der Thrombozytenrückgewinnung = 3.000.000 x 1000 x 5 / 200.000 x 1000 x 100 = 75%

2. Sicherstellung der Wiederherstellungseffizienz des Protokolls durch wiederholte Zyklen. Ein effektives Protokoll liefert einen Konzentrationsgradienten über dem 5-fachen des Ausgangswerts mit einer Wiederfindungseffizienz von >80 %. Basierend auf der gewünschten Verwendung des PRP-Volumens können die Thrombozytenzahlen, die abgegeben werden müssen, entsprechend titriert werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Antikoagulans Citrat Dextrose Solution IP	Fresenius Kabi, Indien	ACDAIP/L/A/19/00
BD Quincke Needle	Becton Dickinson, Spanien	405125	18G
DISPOVAN 50ml Spritze	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd, Indien
DISPOVAN 5ml Spritze	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd, Indien
Spinwin Tube Conical Bottom	Tarsons, Indien	546021
Sysmex XN-350	Sysmex Inc., USA	XN 350
Table Top Clinical Centrifugation Machine	REMI, India	R-8C	4x4 Well-Swing-Out-Rotor