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Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.
1. Schnittscreening auf das Vorhandensein von Methoxy-X04-gefärbten Plaques
- Mit Hilfe eines stereotaktischen Maushirnatlas werden Gehirnschnitte ausgewählt, die die interessierende Region enthalten, beispielsweise den Hippocampus CA1, wie im vorliegenden Beispiel verwendet. Legen Sie jeden Abschnitt in eine Vertiefung innerhalb einer 24-Well-Kulturplatte, die genügend Kryoprotektivlösung enthält, um ein Austrocknen der Abschnitte zu verhindern.
- Untersuchen Sie jeden Schnitt nacheinander, um ein Austrocknen der Schnitte zu vermeiden, indem Sie folgendermaßen vorgehen:
- Geben Sie mit einer Einwegpipette einen Tropfen phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf einen Objektträger und legen Sie den Schnitt auf den Tropfen.
- Untersuchen Sie den Schnitt unter einem Fluoreszenzmikroskop, um Bereiche zu identifizieren, die Methoxy-X04-markierte Aβ-Plaques enthalten.
Hinweis: Methoxy-X04 kann mit einem Fluoreszenz-Ultraviolett-Filter (UV) (Anregung 340 - 380 nm) leicht sichtbar gemacht werden.
- Erfassen Sie Bilder von Regions of Interest (ROI) sowohl im Hellfeld- als auch im Fluoreszenzmodus, ohne den Mikroskoptisch zu bewegen, da jedes Bild in beiden Feldern die gleiche Region zeigen muss, um das Vorhandensein der Plaques direkt mit der strukturellen Region des Gewebeschnitts zu korrelieren.
- Speichern und benennen Sie die aufgenommenen Bilder nach der Tiernummer. Notieren Sie auch die Well-Nummer in der Platte und das Feld der aufgenommenen Bilder. Beispiel: Beispiel: 9978A1B; Tiernummer: 9978; Bohrloch-Nummer: A1; Feld: Hell. Setzen Sie den Schnitt nach Abschluss der Bildgebung wieder in die dafür vorgesehene Vertiefung ein.
Hinweis: Am Ende erhalten wir für jeden untersuchten Schnitt zwei Bilder, eines im Hellfeld und eines im UV-Feld. - Öffnen Sie die beiden Bilder desselben ROI (eines im Hellfeld und das andere im UV-Feld) in Bild J und richten Sie mit dem MosaicJ-Plugin die Kanten der beiden Bilder aus und speichern Sie das ausgerichtete und kombinierte Bild entsprechend der Well-Nummer, aus der es stammt.
- Speichern Sie das Bild in einem separaten Ordner mit der Nummer des jeweiligen Tieres. Kombinieren Sie die Bilder, um die Plaques im Gewebeschnitt zu identifizieren und zu lokalisieren, und erhalten Sie einen vollständigen Überblick über den gesamten Schnitt in den beiden verschiedenen Feldern (hell und UV).
- Nach Abschluss des Screening-Prozesses sind die untersuchten Schnitte bei -20 °C in einer 24-Well-Kulturplatte mit Kryoprotektivum zu lagern, bis eine Immunfärbung oder eine weitere Verarbeitung erfolgt.