Visualisierung eines zerebralen Thrombus bei einer Maus mittels Mikro-Computertomographie

Zusammenfassung

Quelle: Kim, D., et. al. Kombinierte Nahinfrarot-Fluoreszenzbildgebung und Mikrocomputertomographie zur direkten Visualisierung von zerebralen Thromboembolien. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt die Visualisierung des zerebralen Thrombus bei Mäusen mittels Mikro-Computertomographie (Mikro-CT). Einem zerebralen Thrombus-Mausmodell werden Fibrin-gezielte Goldnanopartikel injiziert, die als Kontrastmittel wirken. Die Maus wird auf dem Bett eines Mikro-CT-Geräts platziert, und die Bilder werden aus mehreren Blickwinkeln aufgenommen. Mit Hilfe einer entsprechenden Software werden die Bilder rekonstruiert und verarbeitet.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Herstellung eines exogen gebildeten Gerinnsels, markiert mit Fluoreszenzmarker (Abbildung 1)

1. Anästhesie einer Maus in einer Induktionskammer mit 3 % Isofluran, gemischt mit 30 % Sauerstoff (1,5 l/min, 100 % Sauerstoff). Stellen Sie eine angemessene Anästhesietiefe sicher, indem Sie den Muskeltonus beobachten und das Fehlen des Zehenkneifreflexes bestätigen.
2. Legen Sie das Tier in Bauchlage auf ein steriles Tuch und halten Sie es unter Narkose mit einer Inhalationsmaske und 2 % Isofluran gemischt mit 30 % Sauerstoff. Führen Sie die folgenden Verfahren mit aseptischen Techniken und sterilen Kitteln/Masken/Handschuhen/Instrumenten durch. Halten Sie sterile Bedingungen aufrecht, indem Sie den Versuchsbereich vor und nach den Eingriffen mit 70 % Alkohol reinigen und desinfizieren.
3. Sammeln Sie etwa 300 ~ 1.000 μl arterielles Blut nach einer Herzpunktion. Mischen Sie 70 μl Vollblut mit einer 30 μl C15-Sonde (20 μmol/l Konzentration), einer Cy5.5-Fluoreszenzsonde, die empfindlich auf die Fibrinvernetzungsaktivität des aktivierten Faktor XIII (FXIIIa) Gerinnungsenzyms reagiert, um das Gerinnsel fluoreszierend zu markieren (Abbildung 1A). Injizieren Sie das Mischblut mit einer 3-ml-Spritze (23-Gauge-Nadel) in ein 20 cm langes Polyethylenröhrchen (PE-50, I.D. 0,58 mm). PE-Schläuche müssen sterilisiert (oder vom Hersteller als steril zertifiziert) werden, und die Gerinnsel müssen aseptisch in einer Gewebekulturhaube vorbereitet werden.
4. Überprüfen Sie den Tod des Tieres, indem Sie den Mangel an Atmung und Herzpuls beobachten.
5. Lassen Sie das blutbelastete Röhrchen 2 Stunden lang bei Raumtemperatur, dann 22 Stunden lang bei 4 °C und führen Sie die folgenden Verfahren durch, wie bereits berichtet.
6. Schneide den thrombishaltigen Schlauch in 1,5 cm lange Stücke. Stoßen Sie den Thrombus mit einer 3-ml-Spritze, die mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefüllt ist, auf eine PBS-haltige 6-Well-Platte aus, indem Sie PBS vorsichtig in jedes Stück des Röhrchens injizieren. Waschen Sie die Thromben dreimal mit PBS (Abbildung 1B).
7. Beladen Sie den distalen Endteil eines 15 cm langen PE-10-Schlauchs (ID 0,28 mm) mit einem 1,5 cm langen Thrombus, indem Sie den gewaschenen Thrombus vorsichtig ziehen und dabei Luftblasen vermeiden, indem Sie eine mit Kochsalzlösung gefüllte 1-ml-Spritze mit einer 30-Gauge-Nadel verwenden, die in das proximale Ende des Schlauchs eingeführt wird.
8. Verbinden Sie den thrombusbeladenen PE-10-Schlauch mit einem 3 cm langen PE-50-Schlauch (I.D. 0,58 mm), der so modifiziert ist, dass er ein konisches Ende (I.D. 200 μm) hat, der in einem Mausmodell eines embolischen Schlaganfalls (Abbildung 1C) auf dem Bifurkationsbereich der Arteria cerebraralis media (ACA) (vordere Hirnarterie (ACA) platziert wird.

2. Modellierung eines Mausmodells für einen thromboembolischen Schlaganfall (Abbildung 2)

1. Anästhesie eine andere Maus, die gestreichelt werden soll, in einer Induktionskammer mit 3 % Isofluran gemischt mit 30 % Sauerstoff (1,5 l/min). Injizieren Sie Meloxicam (5 mg/kg) subkutan, um postoperative Schmerzen zu lindern. Stellen Sie eine angemessene Anästhesietiefe sicher, indem Sie den Muskeltonus beobachten und das Fehlen des Zehenkneifreflexes bestätigen.
2. Tragen Sie eine kleine Menge Tiersalbe auf jedes Auge auf, um Trockenheit während der Narkose zu vermeiden. Führen Sie die folgenden chirurgischen Eingriffe mit aseptischen Techniken und sterilen Kitteln/Masken/Handschuhen/Instrumenten durch. Halten Sie sterile Bedingungen aufrecht, indem Sie den Operationsbereich vor, während und nach der Operation mit 70 % Alkohol reinigen und desinfizieren.
3. Bewegen Sie die Maus auf einen Operationstisch. Legen Sie das Tier in Bauchlage auf ein steriles Tuch und halten Sie es unter Narkose mit einer Inhalationsmaske und 2% Isofluran. Messen Sie dann die Körpertemperatur mit einer homöothermen Decke auf 36,5 °C mit Rückmeldung durch ein Rektalthermometer.
4. Nach der chirurgischen Vorbereitung mit Betadin und 70% Alkohol machen Sie einen 1 cm langen vertikalen Schnitt mit einem Skalpell auf der Kopfhaut zwischen dem linken Ohr und dem Auge. Kleben Sie das distale Ende der optischen Faser eines Laser-Doppler-Durchflussmessers auf die freiliegende linke Schläfenknochenoberfläche (1 mm links und 4 mm unterhalb des Bregmas). Starten Sie dann die Dopplerflussüberwachung (Abbildung 2A).
5. Lege das Tier hin. Richte den Hals auf, indem du mit einer Schnur, die an einer Nadel befestigt ist, am oberen Frontzahn ziehst und den Halsbereich rasierst. Machen Sie dann einen 3 cm langen vertikalen Mittellinienschnitt, spreizen Sie ihn und legen Sie den Bereich des linken Karotisbulbus frei, indem Sie perivaskuläre Weichteile präparieren. Achten Sie darauf, den Vagusnerv nicht zu verletzen.
6. Ligatieren Sie die linke proximale Arteria carotis communis (CCA) mit einer sterilen 6-0 schwarzen Seidennaht und ligieren Sie die linke ICA und die linke Pterygopalatinarterie (PPA) mit sterilen 7-0 schwarzen Seidennähten.
7. Kauterisieren Sie die linke obere Schilddrüsenarterie, die ein Ast der linken Arteria carotis externa ist, mit einem monopolaren elektrischen Kauter und ligieren Sie die linke proximale Arteria carotis (ECA) locker und die distalere Stelle mit sterilen 7-0 schwarzen Seidennähten.
8. Machen Sie mit einer Mikroschere ein kleines Loch (ca. 0,2 ~ 0,25 μm Durchmesser) zwischen den ligierten Stellen der ECA.
9. Führen Sie den thrombushaltigen Katheter in das Loch in der ECA ein, während Sie die proximale ECA-Ligatur lösen. Ziehen Sie die proximale ECA-Ligatur erneut fest, nachdem Sie den Katheter in den CCA geschoben haben, um den Katheter an Ort und Stelle zu ziehen.
10. Kauterisieren, um den distalen Teil der ECA zu durchtrennen, der distal der distalen Ligaturstelle liegt, und die freie proximale ECA im Uhrzeigersinn drehen, um sie in Richtung der ICA auszurichten, während der Katheter aus der CCA gezogen wird. Schieben Sie dann den Katheter unmittelbar nach dem Lockern der ICA-Ligatur etwa 9 mm in den MCA-ACA-Bifurkationsbereich des distalen ICA vor. Ziehen Sie dann die ICA-Ligatur fest.
11. Platzieren Sie den Thrombus in den Bifurkationsbereich, indem Sie die Spritze vorsichtig 1 ml drücken, um den Thrombus zu injizieren. Überprüfen Sie die Abnahme des Doppler-Hirnblutflusses (CBF), der im Vergleich zum Ausgangswert um 30 % oder niedriger gesenkt werden sollte, wenn der Thrombus das Gefäß erfolgreich verschlossen hat (Abbildung 2B).
12. Entfernen Sie den Katheter und ligieren Sie die proximale ECA-Stelle sofort und fest. Heben Sie außerdem die Ligation des CCA und des PPA auf.
13. Verschließen Sie die Inzisionsstelle mit 6-0 Seidennähten. Beenden Sie die Anästhesie, nachdem Sie die Dopplerüberwachung über einen erforderlichen Zeitraum fortgesetzt haben (hier für 30 Minuten nach der Thrombusinjektion). Lege die Maus in einen leeren Käfig zurück und halte sie mit einer Heizlampe warm. Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt, bis sie genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten.

3. In vivo MicroCT-Bildgebung des zerebralen Thrombus (Abbildung 3)

1. Die Maus wird wie in Schritt 2.1 beschrieben zu einem vorher festgelegten Zeitpunkt (hier 1 Stunde) nach dem Einsetzen des embolischen Schlaganfalls aufgrund der Platzierung des Thrombus in der Hirnarterie erneut mit 2 % Isofluran betäubt. Stellen Sie eine ausreichende Anästhesietiefe sicher, indem Sie das Fehlen des Zehenquetschreflexes bestätigen. Tragen Sie eine kleine Menge Tiersalbe auf jedes Auge auf, um Trockenheit während der Narkose zu vermeiden.
2. Resuspendieren Sie Fibrin-zielgerichtete Gold-Nanopartikel (fib-GC-AuNP4) in einer Konzentration von 10 mg Au/ml in 10 mM PBS und beschallen Sie das Thrombus-Bildgebungsmittel für 30 Minuten, um die Auflösung und Dispersion der Nanopartikel sicherzustellen. Injizieren Sie 300 μl fib-GC-AuNP (10 mg/ml) in die Penisvene.
3. Legen Sie das Tier auf das Bett eines microCT-Geräts und richten Sie den Hals auf, indem Sie den oberen Vorderzahn mit einer Schnur ziehen, die an einem Stift befestigt ist, um Bewegungsartefakte zu reduzieren.
4. Beginnen Sie 5 Minuten nach der Injektion von fib-GC-AuNP mit der Aufnahme von Mikro-CT-Bildern des Gehirns. Für die hier beschriebenen Experimente werden die folgenden bildgebenden Parameter verwendet: 65 kVp, 60 μA, 26,7 x 26,7 x 27,9 mm³ Sichtfeld, 0,053 x 0,053 x 0,054 mm³ Voxelgröße, 100 Millisekunden pro Frame, eine Mittelwertbildung, 360 Ansichten, 512 x 512 Rekonstruktionsmatrix, 600 Schichten, Scanzeit von 64 Sekunden.
5. Stellen Sie die Maus wieder in einen leeren Käfig und halten Sie sie mit einer Heizlampe warm. Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt, bis sie genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten.
6. Transformieren Sie die Rohbilddaten in das DICOM-Format (Digital Imaging and Communications in Medicine) mit dem Befehl 'Start' des Bedienfelds 'Rekonstruktion' in einem Softwarepaket, das auf dem Mikro-CT-Scanner installiert ist.
7. Für die quantitative Analyse der Bilder (in Schritt 6) wandeln Sie die DICOM-Daten mit einem handelsüblichen Softwarepaket gemäß den Anweisungen des Herstellers in das TIFF-Format um.
8. Für qualitative Analysen sowie quantitative Analysen auf einfachere und schnellere Weise verwenden Sie das Softwarepaket und die ursprünglichen 0,054 mm dicken Bilder im DICOM-Format, um einen neuen Satz von axialen und koronalen Bildern zu erzeugen, die mit einer Dicke von 1 oder 2 mm (hier 2 mm) gerendert werden, wie folgt.
   1. Wählen Sie den DICOM-Ordner in der Baumstruktur 'Data Source' aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste und importieren Sie den Ordner in 'MasterDB' oder 'PrivateDB.'
   2. Klicken Sie auf 'MasterDB' oder 'PrivateDB' in der 'Datenquelle'-Struktur und wählen Sie den importierten Ordner aus. Nachdem Sie auf die Registerkarte "3D" im linken Fenster geklickt haben und das Fenster "Ladeoptionen" angezeigt wird, drücken Sie "OK", um eine Sequenz von Bildern in den Ordner als Stapel zu importieren.
   3. Ändern Sie die Bilddarstellung in das MIP-Format (Maximum Intensity Projection), indem Sie in den axialen und koronalen Bildfenstern auf das Wort "MRP" klicken und im Popup-Menü die Option "MIP" auswählen. Ändern Sie dann die Bildstärke auf 2 mm, nachdem Sie im selben Fenster auf "TH : 0 [mm]" geklickt haben.
   4. Mit der 2 mm breiten 3D-Navigatorleiste, die es ermöglicht, einen Bildstapel zu erkunden und ihn in einem geeigneten Winkel und an einer geeigneten Position zu schneiden, bereiten Sie ein 2 mm dickes Axialschnittbild mit vollständiger Abdeckung des Willis-Kreises (COW) vor, der Thromben beherbergt. Klicken Sie auf die Aufnahmeschaltfläche (Kamerasymbol) im Bereich 'Ausgabe'. Speichern Sie das Bild im TIFF-Format.
9. Bereiten Sie dann fünf 2 mm dicke koronale Schnittbilder vor, die sich vom Frontallappen bis zum Kleinhirn erstrecken.
   1. Bereiten Sie zunächst die zweite Schicht vor, indem Sie die Navigatorleiste vorsichtig auf dem axialen Bild ausrichten, damit das koronale Bild die MCA-ACA-Thromben am besten visualisieren kann.

Als nächstes bereitest du die anderen vier Scheiben zusammenhängend vor. Klicken Sie auf die Aufnahmeschaltfläche (Kamerasymbol) im Bereich "Ausgabe". Speichern Sie die Bilder im TIFF-Format.

Ergebnisse

Abbildung 1: Überblick über die Präparation von fluoreszenzmarkierten Blutgerinnseln. (A) Mischen von frischem Vollblut mit einer Cy5.5-Nahinfrarot-Fluoreszenzsonde (NIRF) (C15), die durch die fibrinvernetzende enzymatische Wirkung des aktiv...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Maschinen
microCT	NanoFocusRay, JeonJu, Korea	NFR Polaris-G90
Laser-Doppler-Durchflussmessgerät	Perimed, Stockholm, Schweden	PeriFlux System 5000
Operationsmikroskop	Leica Microsystems, Seoul, Korea	EZ4HD
Inhalations-Anästhesiegerät	PerkinElmer, Massachusetts, USA	XGI-8
Software
NFR-Steuerung	NanoFocusRay, JeonJu, Korea	NFR Polaris-G90	microCT-Steuerungssoftware
Lucion	Infinitt, Seoul, Korea	Lucion	3D-Rendering-Imaging-Software
Labordiagramm 7	ADInstruments, Colorado, USA	Labordiagramm 7	rCBF
Image J Software	Wanye Rasband, NIH, USA	1.49d	bildgebende Analyse
Geräte/Instrumente
Infusionspumpe	Harvard, Massachusetts, USA	Pumpe 22( 55-2226)
Homöotherme Decke	Panlab, Barcelona, Spanien	HB101
Taschenkauter	Daejong, Seoul, Korea	DJE-39
Gehirnmatratze	Ted pella, CA, USA	15003	koronaler Abschnitt
PE-50 Schlauch	Natsume, Tokio, Japan	SP-45(PE-50)	I.D. 0,58 mm AD 0,96 mm
PE-10 Schlauch	Natsume, Tokio, Japan	SP-10(PE-10)	ID 0,28 mm Außendurchmesser 0,61 mm
30 Gauge Nadel	Sungshim-medical, Seoul, Korea
Spritze	CPL-medical, Ansan, Korea		1 & 3 cc
Gaze	Panamedic, Cheonan, Korea
Tape	Scotch, Seoul, Korea	3M-810
Micro Pinzette	Fine Science Tools, Vancouver, Kanada	11253-27	Dumont #L5
Mikroschere	Fine Science Tools, Vancouver, Kanada	15000-03	Vannas
Federschere	Fine Science Tools, Vancouver, Kanada	14084-08	8,5 cm
Naht aus schwarzer Seide	Ailee, Busan, Korea	SK6071, SK728	6-0 und 7-0
Reagenzien
Meloxicam	Yuhan, Seoul, Korea
Tierarztsalbe	Novartis, Basel, Schweiz
10% Povidon-Jod (Betadin)	Firson, Cheon-an, Korea
Eisenchlorid	Sigma, Missouri, Vereinigte Staaten	157740-5G
TTC	Amresco, Ohio, USA	0765-100g
Isofluran	Hana-Pham, Gyeonggi, Korea	Ifran	100 mL
PBS	Welgene, Daegu, Korea	LB001-02	500 mL
Goldnanopartikel			Synthese
Normale Kochsalzlösung	Daihan Pham, Seoul, Korea	48N3AF3	20 mL