Juxtazelluläre Aufzeichnung und Färbung zur präzisen Kartierung der neuronalen Aktivität bei einer wachen Ratte

Zusammenfassung

Quelle: Moore, J. D., et al. Juxtazelluläre Überwachung und Lokalisierung einzelner Neuronen innerhalb subkortikaler Hirnstrukturen von wachen, kopfgefesselten Ratten. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video zeigt die Methode der juxtazellulären Aufzeichnung und Färbung bei einer gefesselten, wachen Ratte. Das Verfahren beinhaltet die Aufzeichnung von Signalen von Neuronen und die Injektion von Farbstoff, um die Aufnahmestelle genau zu lokalisieren. Diese Technik ermöglicht eine genaue Zuordnung der neuronalen Aktivität zur anatomischen Struktur des Gehirns.

Protokoll

Alle Verfahren, bei denen Tierversuche durchgeführt werden, wurden vom örtlichen institutionellen Tierschutzausschuss und dem Tierprüfungsausschuss der JoVE überprüft.

1. Juxtazelluläre Überwachung neuronaler Einheiten

1. Ziehen Sie Quarz-Kapillarschläuche an einem Kohlendioxid-Laser-Mikropipettenabzieher (siehe Abschnitt Materialien) mit Spitzendurchmessern von weniger als 1 μm (Abbildung 2A).
   HINWEIS: Die Heizparameter variieren je nach dem jeweiligen Instrument, und der erforderliche Halsdurchmesser hängt von der interessierenden Gehirnstruktur ab. Für Aufnahmen im Thalamus von Ratten haben Mikropipetten Hälse von 5 bis 7 mm.
2. Befestigen Sie die Pipette unter einem DIC-Mikroskop (Differential Interference Contrast), das mit Objektiven mit großem Arbeitsabstand ausgestattet ist. Verwenden Sie Modelliermasse, um die Pipette auf dem Mikroskoptisch an Ort und Stelle zu halten.
3. Schieben Sie mit der Pipettenspitze einen Glasblock (0,5 - 1 cm dick; ein Stück Glas, das zur Herstellung von Ultramikrotommessern verwendet wird) langsam in das Sichtfeld. Berühren Sie mit dem Tischmikromanipulator vorsichtig die Pipettenspitze mit dem Glas, sodass es zerbricht. Wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf, bis der Außendurchmesser der Pipettenspitze zwischen 1 und 3 μm liegt (Abbildung 2B, C). Stellen Sie sicher, dass diese Mikropipetten Impedanzen zwischen ca. 5 und 15 MΩ haben.
4. Bereiten Sie extrazelluläre Kochsalzlösung (135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 5 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-ethansulfonsäure, pH 7,2 mit NaOH) vor und fügen Sie 2% (w/v) Chicago Sky Blue hinzu. Füllen Sie das hintere Ende der Pipette mit der Lösung mit einer Spritze mit einer 30-G-Nadel oder kleiner. Alternativ können Sie für die einzelzellige juxtazelluläre Markierung 2 % (w/v) Neurobiotin oder biotinyliertes Dextranamin (BDA-3000 oder BDA-10000) anstelle von Chicago Sky Blue zur Kochsalzlösung hinzufügen.
5. Setzen Sie die Ratte in die Stoffsocke in das starre Rohr auf eine geeignete Versuchsvorrichtung (Abbildung 1). Warten Sie mindestens 72 Stunden nach der Operation, bevor Sie das Tier auf die Kopfstützenvorrichtung setzen. Ziehe den Kordelzug um das obere Brustbein und nicht um den Hals fest, um eine Verstopfung der Atemwege zu vermeiden. Wenn die Atmung erschwert oder behindert zu sein scheint, lösen Sie den Kordelzug oder bewegen Sie ihn nach hinten. Führen Sie diesen Vorgang durch, während die Ratte in Alarmbereitschaft ist.
6. Befestige die Kopfhalteplatte an der Ratte an dem entsprechenden Stück an der Vorrichtung. Dazu wird zunächst die Kopfstützenplatte fixiert und anschließend mit einer Schraube 4-40 fixiert. Warten Sie, bis sich das Tier beruhigt hat, um ein übermäßiges Drehmoment auf den Kopf auszuüben. Platzieren Sie als Nächstes eine Mutter 8-32 auf der Kopfhalteschraube, die in die Ratte implantiert ist. Schrauben Sie dann eine Gewindestange aus Edelstahl in die Kopfschraube ein. Befestigen Sie den Stab so an der Versuchsvorrichtung, dass er festgezogen werden kann (Abbildung 1).
   HINWEIS: Das Sichern des Tieres mit der Kopfschraube sowie der Kopfstützenplatte minimiert das Verbiegen des Geräts und verbessert die Aufnahmestabilität. In den meisten Fällen kann die Aufzeichnung am ersten Tag beginnen, an dem das Tier an den Kopf gefesselt wird. Wenn das Tier jedoch übermäßig zappelt oder lautgibt, sollten Sie einen Tag lang ein Gewöhnungstraining an die Kopfstütze durchführen, bevor Sie mit den Aufnahmen beginnen. Lassen Sie das Tier in diesem Fall 15 Minuten auf der Vorrichtung und setzen Sie es dann wieder in seinen Käfig. Wiederholen Sie diesen Schritt am nächsten Tag und fahren Sie mit dem Protokoll fort.
7. Öffnen Sie die Aufnahmekammer und entfernen Sie das Silikongel. Wenn in der Kraniotomie Gewebe nachgewachsen ist, reinigen Sie es mit einer feinen Zange.
8. Befestigen Sie die Pipette an den motorisierten Mikromanipulator und schließen Sie den Vorverstärker des Kopftisches an.
   HINWEIS: In der vorliegenden Demonstration schaltet eine kleine Relaisschaltung an der Kopfstufe zwischen den Anschlussdrähten des Verstärkers und einer externen Stromquelle mit hoher Nachgiebigkeit um (Abbildung 3A-C). Beachten Sie, dass einige Verstärker über eine geeignete eingebaute High-Compliance-Quelle verfügen.
9. Verwenden Sie den motorisierten Mikromanipulator, um die Spitze der Pipette zur stereotaktisch identifizierten Markierung in der Aufnahmekammer zu bewegen. Notieren Sie sich die Koordinaten dieses Ortes. Achten Sie darauf, dass Sie die Spitze der Pipette am Schädel nicht brechen.
10. Bewegen Sie die Pipette an die gewünschte Aufnahmestelle in der anterior-posterioren und mediolateralen Achse. Schieben Sie dann die Pipette ventral durch die Dura, bis sie etwa 500 μm dorsal zum vorgesehenen Aufnahmeort ist.
11. Schieben Sie die Pipette langsam vor, während Sie auf einem Audiomonitor auf Spike-Ereignisse der verstärkten Spannung achten, die zwischen der Pipettenspitze und dem Referenzdraht aufgezeichnet wird. Sobald Spike-Ereignisse identifiziert wurden, bewegen Sie die Pipette weiter von 0 bis 100 μm, bis positive Spannungsablenkungen von mehr als ca. 500 μV beobachtet werden.
    HINWEIS: Der Elektrodenwiderstand erhöht sich in diesem Fall um den Faktor 1,5-10.
12. Die Aufzeichnung sollte beginnen, sobald eine Einheit isoliert wurde, zusammen mit allen anderen verhaltensbezogenen und physiologischen Messungen, die von Interesse sind. In der vorliegenden Demonstration werden selbst erzeugte Vibrissa-Bewegungen mit Hochgeschwindigkeits-Videografie überwacht (siehe Abschnitt Materialien ).
13. Um den Aufnahmeort zu beschriften, schalten Sie die Elektrodenkabel um, um eine Verbindung zur Stromquelle herzustellen. Es gibt mehrere Möglichkeiten, dies zu tun, entweder mit einer Relaisschaltung (Abbildung 3A-C), einer eingebauten Stromquelle am Verstärker oder manuell (Abbildung 3D). Passieren Sie -4 μA mit 2-Sekunden-Impulsen bei 50 % Einschaltdauer für 4 Minuten, um Chicago Sky Blue iontophoretisch durch die Pipette zu injizieren.
14. Töte und perfundierte das Tier nach mehreren Etikettierungsverfahren gemäß der üblichen Praxis. Schneiden Sie das Gehirn und kontrastieren Sie bei Bedarf, um die anatomische Lage der Aufnahmestelle zu identifizieren. Gegenfärbung des Gewebes auf Reaktivität der Cytochromoxidase. Alternativ können Sie die Chicago Sky Blue-Ablagerungen mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie identifizieren.
    HINWEIS: Um genau zwischen verschiedenen beschrifteten Einheiten zu unterscheiden, ist es wichtig, dass alle Etiketten mit derselben Pipette am selben Tag erstellt werden, ohne die Pipette zwischen den Etiketten zu lösen. In diesem Fall können die Aufzeichnungsstellen anhand ihrer relativen Positionen in der Post-hoc-Histologie unterschieden werden, zusammen mit den notierten Manipulatorkoordinaten der einzelnen Standorte. Zur eindeutigen Identifizierung markieren Sie die Markierungen in einem Abstand von mindestens 200 μm zueinander und nicht mehr als 3-5 Markierungen pro Hirnregion.

Ergebnisse

Abbildung 1: Experimentelle Vorrichtung. Diagramm einer Ratte in der mechanischen Vorrichtung für elektrophysiologische und verhaltensüberwachende Experimente. Die Vorrichtung verwendet die Stange und die Platte

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ketaset (Ketamine HCl)	Fort Dodge	N/A
Anased (Xylazinlösung)	Lloyd Laboratories	N/A
Betadyne (Povidon-Jod)	CVS Apotheke	269281
Loctite 495	Grainger Industrial Supply	4KL86	20-40 cp Cyanacrylat
Vetbond	3M	1469SB
Grip Zementpulver	Dentsply Intl	675571	Für den Boden der Aufnahmekammer
Grip Zementflüssigkeit	Dentsply Intl 675572		Für den Boden der Aufnahmekammer
Silikongel	Dow Corning	Mar-80
Jet Prothesenreparatur Acrylpulver	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	Zur Befestigung der Kopfstütze am Schädel
Ortho-Jet Schnell aushärtende kieferorthopädische Acrylharzflüssigkeit	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	Zur Befestigung der Kopfstütze am Schädel
Chicago sky	blue Sigma	C8679
Paraformaldehyd	Sigma	158127	Zur Perfusion und Gewebefixierung
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Sigma	P3813	Zur Perfusion und Gewebefixierung
Cytochrom C	Sigma	C2506
Diaminobenzidin	Sigma	D5905
Rattensocke	Sew Elegant (San Diego, CA)	N/A
PVC Schlauch 2 1/2"	U.S. Plastic Co.	34108
Subminiatur-D-Stifte und -Buchsen	TE Connectivity	205089-1
Notendraht aus Edelstahl mit 0,010" Durchmesser	Precision Brand Products, Inc.	21010
Stereotaktischer Halterahmen	Kopf Instruments	Modell 900
Stereotaktische Ohrbügel	Kopf Instruments	Modell 957
Stereotaktischer Manipulator	Kopf Instruments	Modell 960
1/2 mm Bohrfräser	Henry Schein	100-3995
Quiet-Air Dentalbohrer	Midwest Dental	393-1600
Edelstahl 0-80 1/8"	Schraube Verschluss Superstore	247438
0,2 mL Zentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	05-407-8A
Benutzerdefinierte Kopfhaltestange	UCSD SIO Machine	Shop N/A
Rechtwinklige Pfostenklemme	Newport	MCA-1
8-32 3/4" Schraubbefestigung	Superstore	240181
4-40 1/4" Schraubbefestigung	Superstore	239958
Quarz-Kapillarschlauch	Sutter Instruments	QF-100-60-10
Motorisierter Mikromanipulator	Sutter Instruments	MP-285
Mikroelektrodenverstärker	Molecular Devices	Multiclamp 700B	Alternativteil: Molecular Devices Axoclamp 900A
Mikroelektrodenverstärker Kopftisch	Molecular Devices	CV-7B	Alternativteil: HS-9Ax10 mit Molecular Devices Axoclamp 900A
Isolierter Impulsstimulator	A-M Systems	Modell 2100	Alternativteil: HS-9Ax10 mit Molecular Devices Axoclamp 900A
Audiomonitor	Radio Shack	32-2040
Elektrodenzuleitungsdraht	Cooner-Draht	NEF34-1646
Relais für Verstärkerkopfstufe	COTO Technology	#2342-05-000	(optional) Wird mit einer speziell angefertigten Leiterplatte verwendet (UCSD Physics Electronics Shop), Abbildung 6A-C
Digitale Videokamera	Basler	A602fm
Pipettenhalter	Warner Instruments	#MEW-F10T
Kundenspezifische Kopfhalteplatte	UCSD SIO Machine Shop	N/A