Intranasale mesenchymale Stammzellabgabe in einem Mausmodell für traumatische Hirnverletzungen

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Markierung von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) mit superparamagnetischen Eisenoxid (SPIO)-Nanopartikeln

1. Um MSCs mit SPIO zu markieren, geben Sie 6 ml Markierungsmedium (25 μg/ml SPIO in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) ohne fötales Rinderserum (FBS)) in einen T75-Kolben, der MSCs enthält (80 % Konfluenz).
2. Inkubieren Sie die Zellen mit dem Markierungsmedium in einem CO₂ -Inkubator (37 °C, 5 % CO₂ ) ohne Schütteln. Entfernen Sie das Etikettiermedium nach 24 h vorsichtig mit einer sterilen Pasteurpipette mit einer Kunststoffspitze, die an einem Vakuum befestigt ist. Waschen Sie die Monoschicht der Zellen 2x mit 6 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um alle Spuren von nicht internalisiertem SPIO zu entfernen.
   1. Um festzustellen, ob die Zellen erfolgreich markiert wurden, überprüfen Sie die markierten Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop oder Konfokalmikroskop, wenn der SPIO mit einem Fluorophor markiert ist (d.h. wie die hier verwendeten; Abbildung 1B, C).
3. Adhärente Zellen durch Behandlung mit 3 ml Trypsin ernten und bei 37 °C inkubieren. Nach 5 Minuten Inkubation fügen Sie 7 ml vorgewärmtes DMEM-Medium mit 10 % FBS (v/v) hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren. Sammeln Sie die Zellsuspension mit einer Pipette in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
4. Die Zellsuspension bei 300 x g für 5 min zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und das Zellpellet in PBS resuspendieren. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit einem Trypanblau-Farbstoff und einem Hämozytometer.
   HINWEIS: Das Zellpellet der markierten Zellen erscheint aufgrund der Eisenbelastung als dunkle Farbe (Abbildung 1D). Dieses Protokoll ist relevant für die MSC-Markierung und die Magnetresonanztomographie (MRT). Das Verfahren für die MSC-Markierung wurde bereits optimiert, und es werden hier nur die Schritte zur Vorbereitung markierter MSCs für die In-vivo-Verfolgung berücksichtigt, da die In-vivo-Verfolgung im Vordergrund steht. Das Protokoll für die Kultivierung und Markierung anderer Zelltypen sollte vom Forscher optimiert werden.
5. Passen Sie die Zellkonzentration mit PBS auf 150.000 Zellen (oder eine Anzahl, die zu einem ausreichenden MRT-Signal führt) in 18 μl PBS (oder das Gesamtvolumen, das bei der intranasalen Verabreichung verwendet wird) an.
   HINWEIS: Es wurde festgestellt, dass eine Zellkonzentration von mehr als 150.000 Zellen/18 μl PBS zu einer Zellaggregation führt, Dies kann die Effizienz der intranasalen Verabreichung beeinträchtigen. Wenn eine höhere Anzahl von Zellen für die intranasale Verabreichung benötigt wird, erhöhen Sie das Gesamtvolumen der Zellsuspension und erhöhen Sie die Anzahl der intranasalen Verabreichungen, da die intranasale Verabreichung ein nicht-invasives Verfahren ist und eine Mehrfachdosierung möglich ist.

2. Kontrollierte kortikale Einwirkung (CCI) Schädigung

HINWEIS: In diesem Protokoll wurden männliche C57 BL/6-Mäuse (7–8 Wochen alt) in einem 12/12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser gehalten.

1. Um jede Maus auf eine CCI-Verletzung vorzubereiten, verabreichen Sie den Anästhesiecocktail Zolazepam (50 mg/kg) und Xylazin (20 mg/kg) über intraperitoneale (i.p.) Injektion (1 ml/kg). Stellen Sie sicher, dass die Anästhesietiefe ausreichend ist, indem Sie nicht auf das Zusammendrücken der Zehen reagieren. Alternativ können Sie die Maus 60 s lang in eine Kammer stellen, die mit 2 % bis 4 % Isofluran versorgt ist.
2. Rasieren Sie das Fell der dorsalen Oberfläche des Schädels zwischen den Ohren mit einem elektronischen Haarschneider. Reinigen Sie die rasierte Stelle mehrmals mit einem sterilen, in Jod getränkten Wattestäbchen. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, das in 70%igem Ethanol getränkt ist, um das Jod zu entfernen.
3. Platzieren Sie die betäubte Maus in den stereotaktischen Rahmen und befestigen Sie die Maus mit Ohr- und Nasenbügeln. Machen Sie mit einer sterilen Schere einen mittelsagittalen Schnitt (ca. 2,5 cm) in die rasierte Haut, um an die Oberfläche des Schädels zu gelangen.
4. Entferne das Gewebe am Knochen mit einem Wattepad, um den Schädel freizulegen. Reinigen Sie die Schädeloberfläche mit einem Wattestäbchen, das 10 s lang in 3%igem Wasserstoffperoxid (H₂O₂) getränkt ist, und reinigen Sie es dann mit einem trockenen Wattepad.
   HINWEIS: Die Schädelnähte und sowohl Bregma als auch Lambda können nun leicht identifiziert werden.
5. Identifizieren Sie die Koordinaten der Wahl auf der Schädeloberfläche für die CCI-Verletzung und zeichnen Sie mit einem Bleistift oder einem geeigneten Marker einen Kreis (4 mm Durchmesser) um die Koordinaten.
   HINWEIS: In diesem Protokoll wurden die Koordinaten anteroposterior (AP) -2,0 mm und mediolateral (ML) +1,5 mm für die CCI-Induktion verwendet.
6. Verwenden Sie einen Mikrobohrer und einen runden Fräser (0,5 mm Durchmesser), um den Schädel an dem markierten Kreis auszudünnen. Vermeiden Sie es, beim Bohren Druck auszuüben, da das Bohren durch den Knochen das Hirnparenchym schädigen kann. Reinigen Sie den Knochenstaub mit einem sauberen und trockenen Wattestäbchen.
7. Entfernen Sie den Knochenlappen vorsichtig mit einer sterilen feinen Pinzette, um die Dura mater freizulegen, während sie intakt bleibt. Entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen, der für die Vorbereitung auf die Verletzung verwendet wurde, und setzen Sie sie in den stereotaktischen Rahmen des CCI-Geräts ein.
8. Stabilisieren Sie den Kopf der Maus mit den Ohrbügeln und Nasenbügeln. Stellen Sie sicher, dass der Kopf der Maus in rostral-kaudaler Richtung waagerecht ist, und passen Sie bei Bedarf die Nasenbügel an.
9. Befolgen Sie die Anweisungen auf der Steuerbox, um die Impaktorspitze auf die freiliegende kortikale Oberfläche zu setzen. Stellen Sie sicher, dass die Impaktorspitze direkt über den gewünschten Cortex-Koordinaten ausgerichtet ist, indem Sie die X- und Y-Steuerräder an der Basis des Impaktors verwenden.
10. Stellen Sie die Experimentparameter mit der Steuerbox auf eine Geschwindigkeit von 5 m/s, eine Verweilzeit von 250 ms und eine Verletzungstiefe von 1 mm ein, um eine leichte Verletzung in der Maus zu induzieren.
11. Verursachen Sie Verletzungen, indem Sie die "Aufprall"-Taste an der Steuerbox drücken. Tupfen Sie alle auftretenden Blutungen mit einem sterilen Wattestäbchen ab.
12. Entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen und schließen Sie den Schnitt mit chirurgischen Seidennähten. Verwenden Sie keine Metallklammern, um die Operationsstelle zu verschließen, da die Maus für die MRT einem Magnetfeld ausgesetzt wird.
13. Tragen Sie topische Antibiotika (Bacitracin, Neomycin) auf die Operationsstelle auf, um Infektionen zu verhindern. Halten Sie die Maus auf dem Heizkissen und überwachen Sie es während der Erholungsphase genau.
14. Verabreichen Sie Ketoprofen (2,5 mg/kg, IP) täglich für 3 Tage nach der Operation, es sei denn, die Ketoprofen-Verabreichung widerspricht den Studienzielen.

3. Intranasale Verabreichung

1. 1 Tag nach der CCI-Induktion den Anästhesiecocktail Zolazepam (50 mg/kg) und Xylazin (20 mg/kg) per i.p. Injektion verabreichen. Stellen Sie sicher, dass die Maus tief betäubt ist, da sie nicht auf das Zusammendrücken der Zehen reagiert.
2. Bereiten Sie die Maus auf die intranasale Verabreichung von MSCs durch Hyaluronidase-Behandlung vor.
   1. Greife das Genick der Maus und drehe sie fest auf den Rücken, während du den Schädel bewegungsunfähig machst. Platzieren Sie die Spitze einer Pipette, die Hyaluronidase in sterilem PBS (4 U/μl) enthält, in einem Winkel von 45° in der Nähe des Nasenlochs der Maus.
   2. 3 μl Hyaluronidase-Suspension in jedes Nasenloch verabreichen. Halten Sie die Maus immobilisiert und mit dem Gesicht nach oben auf einem sauberen Pad für 5 Minuten. Wiederholen Sie die Hyaluronidase-Behandlung 4x (insgesamt 100 U Hyaluronidase-Suspension).
3. Halten Sie die behandelte Maus nach der Hyaluronidase-Behandlung 30 Minuten lang auf einem sauberen Pad mit der Vorderseite nach oben.
4. Um MSCs in das Gehirn zu bringen, halten Sie die Maus fest, wie in Schritt 3.2.1 beschrieben. 3 μl/Nasenloch MSC-Suspension im Abstand von 3 s verabreichen. Halten Sie die Maus 30 s lang in derselben Position, bis die Probentropfen vollständig verschwunden sind.
   HINWEIS: Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen während der Verabreichung.
5. Wiederholen Sie die Verabreichung in einem 2-Minuten-Intervall bis zu 3x.
   HINWEIS: Die Gesamtzahl der zu liefernden Zellen beträgt 150.000, so dass 18 μl der Zellsuspension in einer Dosierung von 3 μl für jedes Nasenloch, jeweils 3x, abgegeben werden können.
6. Bringen Sie die Maus wieder in ihren Käfig zurück und überwachen Sie sie genau, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hat.

Abbildung 1: Schematisches Flussdiagramm des Protokolls und In-vitro-Bestätigung der SPIO-Aufnahme durch MSCs. (A) MSCs wurden zur Markierung 24 Stunden lang mit SPIO inkubiert. Anschließend wurden die markierten MSCs über einen intranasalen (IN) Weg in ein SHT-Mausmodell eingebracht. Um die markierten MSCs zu verfolgen, wurde eine MRT zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt. Die Bestätigung einer ausreichenden Markierung der MSCs durch SPIO wurde durch (B) Fluoreszenzmikroskopie und (C) konfokale Mikroskopie mit dem FITC-Kanal erreicht, da SPIO-Nanopartikel mit FITC markiert wurden. (D) Das Zellpellet der markierten MSCs erschien aufgrund der Eisenbelastung dunkel. FITC = Fluorescein-Isothiocyanat; SPIO = superparamagnetische Partikel des Eisenoxids; MSCs = mesenchymale Stammzellen; MRT = Magnetresonanztomographie; IN = intranasal; SHT = Schädel-Hirn-Trauma.