Methodenartikel

Teratom-Generation in den Hoden Capsule

DOI:

10.3791/3177

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7. November 2011

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1Department of Chemical Physiology, Scripps Research Institute, 2Department of Chemical Physiology, Scripps Research Institute , 3Department of Reproductive Medicine, University of California

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Menschliche pluripotente Stammzellen (hPSCs) haben das Potenzial, eine Vielzahl von verschiedenen Krankheiten zu behandeln. Die Nützlichkeit dieser Zellen besteht darin, dass sie in einem beliebigen Zelltyp im Körper zu unterscheiden. Hier beschreiben wir die Teratom-Assay, mit dem die Pluripotenz von hPSCs demonstrieren wird.

Zusammenfassung

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Pluripotente Stammzellen (PSC) haben die einzigartige Eigenschaft, dass sie können in Zellen von allen drei Schichten unterscheiden. Damit sind sie ein wertvolles Werkzeug für die Behandlung vieler verschiedener Krankheiten. Mit dem Aufkommen von pluripotenten Stammzellen (IPSCs) und weitere Forschungsarbeiten mit humanen embryonalen Stammzellen (HES) gibt es einen Bedarf für Tests, die zeigen, dass eine bestimmte Zelllinie ist pluripotenten kann. Keimbahntransmission wurde der Goldstandard für den Nachweis der Pluripotenz von embryonalen Maus-Stammzellen (MESC) Linien 1,2,3. Mit diesem Test können die Forscher zeigen, dass eine MESC Linie können alle Zelltypen im Embryo einschließlich der Keimzellen 4 vorzunehmen. Mit der Erzeugung von menschlichen ESC-Linien 5,6, war der entsprechende Test zur Pluripotenz dieser Zellen nachweisen unklar, da die menschliche WSR kann nicht für Keimbahntransmission getestet werden. Als Ersatz wird die Teratom-Assay verwendet, um die derzeit pluripot demonstrierenTransparenz der menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) 7,8,9. Obwohl dieser Test wurde vor kurzem unter die Lupe genommen und neue Technologien werden aktiv erforscht, ist das Teratom Assay dem derzeitigen Goldstandard 7. In diesem Assay werden die Zellen in Frage in einem immungeschwächten Maus injiziert. Wenn die Zellen pluripotent sind, wird ein Teratom schließlich entwickeln und Abschnitte des Tumors wird Gewebe aller drei Keimblätter 10 zeigen. Im Teratom Assay kann hPSCs in verschiedene Bereiche der Maus injiziert werden. Die häufigsten Injektionsstellen umfassen den Hoden Kapsel, die Nierenkapsel, die Leber oder in das Bein entweder subkutan oder intramuskulär 11. Hier beschreiben wir eine robuste Protokoll für die Erzeugung von Teratome aus hPSCs mit dem Hoden Kapsel als Standort für das Tumorwachstum.

Protokoll

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Hinweis: Alle Tier Verfahren müssen durch IACUC oder gleichwertig genehmigt werden.

Alle chirurgischen Ausrüstung muss vor dem Eingriff sterilisiert werden. Sterile Handschuhe, Tücher und Gaze verwendet werden muss.

1. Vorbereitung vor der Operation

  1. Besorgen Sie 6 Wochen alten Mus Musculus CbySmn.CB17-Prkdc SCID / J männlichen Mäusen oder anderen immungeschwächten Stamm der Maus.
  2. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente, Handschuhe und Gaze.
  3. Dissociate hPSCs mit Accutase injiziert werden.
  4. Zählen von Zellen und resuspendieren Million Zellen pro 20-30 ul in Matrigel verdünnt 1:1 in DMEM/F-12. Halten Zellen auf Eis, bis fertig.
  5. Beachten Sie, dass es oft nützlich, einen Durchlauf der Versuch, bei dem Trypanblau wird injiziert zu tun ist. Dies wird helfen, mögliche Probleme zu identifizieren, bevor die Zellen verschwendet werden.
  6. Im Vivarium, betäuben Sie mit der Maus nach anerkannten Verfahren an Ihrer Hochschule. In unseren Experimenten verwendeten wir einen AnesthESIA Maschine mit Isofluran. Die Mäuse wurden zunächst in einer Kammer mit Induktion 1L/min Sauerstoff und 3-4% Isofluran setzen. Einmal betäubt wurde eine Bugspitze mit 1L/min Sauerstoff und 2-3% Isofluran eingesetzt.
  7. Rasieren Sie den Bauch mit Klipper, und reinigen Sie die vordere Wand der Maus Bauch, ab der Mitte des Bauches und Arbeitsbedingungen im Uhrzeigersinn nach außen. Erster Einsatz Povidonjodlösung dann mit 70% Ethanol waschen. Wiederholen Sie 3 Mal, jedes Mal wechselnden Tupfern. Übertragen des Tieres zu einem Heizkissen zu halten das Tier warm einer Gewebekultur oder die Analyse Haube.
  8. Machen Sie eine 1 cm Längsschnitt durch die Haut und Bauchfell mit sterilen OP-Schere knapp unter dem Niveau des Hüftgelenks.
  9. Halten Sie das Peritoneum mit einer Pinzette, erreichen nach unten in Richtung der rechten Hüfte mit einem anderen sterilen forcept und ziehen Sie den weißen Fettgewebe zusammen mit dem befestigten Hoden.
  10. Legen Sie die Hoden auf steriler Gaze.
  11. Füllen Sie ein Tuberkulin-oder Hamilton (1 cc) Spritze wite die hPSCs injiziert werden. Beachten Sie, dass es eine gute Idee, um eine Kontrolle HPSC Linie, dass Sie wissen, ist, wie pluripotente WA09 (auch als H9 bekannt) enthalten ist. Auf diese Weise haben Sie eine positive Kontrolle, die Sie verwenden, um festzustellen, ob Ihr Injektion oder eine Operation kann fehlerhaft war.
  12. Spritzen Sie das hPSCs (20-30 ul) in der Mitte des Hodens Kapsel entfernt von den großen Blutgefäßen, Anhalten, wenn die Hodenhüllen beginnt zu schwellen.
  13. Entfernen Sie die Nadel langsam zum Rückfluss der Zellen zu vermeiden.
  14. Mit einer Pinzette, übertragen Sie die Hoden-und Fettgewebe wieder in seine ursprüngliche Position in den Unterleib.
  15. Schließen Sie das Bauchfell mit 2 oder 3 resorbierbaren Nahtmaterial und schließen Sie die Haut mit Autoclips.
  16. Die Maus sollte warm gehalten werden, bis es wieder gegeben und eine Form von Analgetikum (siehe Was ist in Ihrem Vivarium akzeptiert) nach der Operation zweimal täglich für 1-2 Tage.
    Beachten Sie, dass weder die Betäubung noch das Analgetikum mit mit Tumor-Entwicklung beeinträchtigen könnte.
  17. Überwachen the Tier für das Tumorwachstum für 6-12 Wochen. Sehr selten Tumoren auf 5 mm Größe vor bis 6 Wochen nach der Injektion zu wachsen, so ist es wichtig, die Tiere zu überwachen. In diesem Fall sind die Tiere getötet und die Tumore werden verarbeitet und analysiert, wie üblich.
  18. Sobald der Tumor ist spürbar und erreicht etwa 5 mm in der Größe, betäuben die Maus, und opfere sie nach anerkannten Verfahren Tier-Protokoll.
  19. Entfernen Tumor und dementsprechend Dokument - Lichtbild, Größe messen, wiegen.
  20. Schneiden Sie Tumor in kleine Stücke und fixieren in 4% Paraformaldehyd-Lösung. Shop in 4% Paraformaldehyd, bis Proben werden an einen Pathologen für Schneiden, Färben und Analyse geschickt.

2. Repräsentative Ergebnisse:

Wenn dieses Protokoll durchgeführt wird, wie beschrieben und das injizierte Zelllinie ist pluripotent, sollte eine greifbare, optisch klar, Tumor innerhalb von 12 Wochen auf der am besten zu bilden. Für etablierte HPSC Zeilen wie WA09, wir sehen in der RegelTumoren innerhalb von 6 Wochen. Für IPSC-Linien ist es nicht ungewöhnlich, um Tumore innerhalb von 8-10 Wochen zu sehen. Es ist sehr wichtig, Mäusen, die mit einer Linie, die bekanntermaßen pluripotent wird injizieren, als eine positive Kontrolle, um sicherzustellen, dass das Verfahren richtig durchgeführt wurde. Tumoren in der Regel schauen sehr heterogen und haben viele angehängten Zysten (Abbildung 1). Die Analyse der Tumorproben von einem Pathologen sollten differenzierte Gewebe aller drei Keimblätter (Abbildung 2) zeigen.

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Abbildung 1. Typische HPSC abgeleitet Teratom im Hoden Kapsel.

Nach der beschriebenen Protokoll wurden eine Million WA09 Zellen in den Hoden Kapselsack eines immungeschwächten Maus injiziert. Sechs Wochen später ein Teratom beobachtet wurde. A) Teratom aus der Maus gezogen. B) Nahaufnahme Bild von der Teratom. Notieren Sie sich die Heterogenität und Zyste Strukturen.

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Abbildung 2. Hämatoxylin und Eosin gefärbten Schnitten aus dem Teratom zeigen Gewebe aus jedem Keimblatt.
Nach Fixierung war das Teratom geschnitten und gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin. Analyse durch einen Pathologen zeigte die Anwesenheit von Zellen von jedem der 3 Keimblätter.

Diskussion

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Die hier vorgestellte Methode bietet sehr zuverlässige, einfache Mittel zur Erzeugung von hPSCs Teratome im Hoden Kapsel. Es gibt mehrere kritische Parameter in dieser Technik. Insbesondere ist es wichtig, HPSC Zelllinien, die bekanntermaßen pluripotenten als Steuerelement zu injizieren. Andere wichtige Parameter sind das Zeitintervall zwischen der Impfung und Tumor-Beobachtung. Für Zelllinien, wie WA09, sollte Teratome in 6-8 Wochen beobachtet werden. Für neue iPSC Zeilen finden wir, dass oft 10 Wochen benötigt werden. Ein weiteres Problem ist die Anzahl der Zellen injiziert. Wir injizieren eine Million Zellen, der Assay kann einfach mit weniger Zellen durchgeführt werden. Darüber hinaus ist das Einspritzmedium wichtig. Wir finden, dass wir die besten Ergebnisse erzielen, wenn die Zellen in einer 1:1-Mischung aus Matrigel und DMEM/F-12 injiziert werden, wie zum PBS oder DMEM/F-12 entgegengesetzt.

Offenlegungen

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse CIRM # TR-1250, RT1-01108, und CL1-00502 finanziert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Name des Reagenzes Firma Katalog-Nummer
Accutase Invitrogen A1110501
DMEM/F-12 Invitrogen 113300-032
Matrigel BD Biosciences 354277

Referenzen

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  2. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154(1981).
  3. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78, 7634-7634 (1981).
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  11. Gertow, K. Isolation of human embryonic stem cell-derived teratomas for the assessment of pluripotency. Curr Protoc Stem Cell Biol. Chapter 1, Unit1B 4-Unit1B 4 (2007).

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Schlagwörter

Teratom Assaypluripotente StammzellenHodenkapsel InjektionKeimblattspezifische Differenzierungimmundefiziente M usehumane pluripotente StammzellenTumorhistopathologiechirurgisches VerfahrenZellinjektionsprotokollKeimbahn bertragung

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