Transkranielle elektrische Stimulation des motorischen Kortex bei einer wachen Ratte

Alle Verfahren, bei denen Tiermodelle zum Einsatz kommen, wurden von der örtlichen institutionellen Tierpflegekommission und der tierärztlichen Prüfstelle der JoVE überprüft.

1. Chirurgischer Eingriff: Implantation einer Brustelektrode

HINWEIS: Dieser Schritt kann übersprungen werden, wenn die Gegenelektrode mit einer Weste extern auf der rasierten Brust platziert wird.

1. Legen Sie das Nagetier in Bauchlage (auf der Brust) auf den Operationstisch.
   HINWEIS: Bei einer Inhalationsanästhesie halten Sie die Schnauze der Ratte in der Anästhesiedüse, um die Isoflurankonzentration weiter auf 1,5-2% zu reduzieren.
2. Desinfizieren Sie die rasierte Kopfhaut mit einem Desinfektionsspray oder mit einem Tupfer, der mit einem Antiseptikum (z. B. Ethanol 70%) getränkt ist, und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal.
3. Schneiden Sie die Haut mit einem Skalpell in einer Linie von der rostralen Augenhöhe bis zur Höhe des Mittelohrs.
   HINWEIS: Dies ermöglicht das Tunneln des Verbindungskabels von der implantierten Brustelektrode zur Oberseite des Kopfes und ist auch der gewünschte Schnitt für die Platzierung der Elektrodenschaft mit Gleichstromstimulation (DCS).
4. Drehen Sie die Ratte in Rückenlage, so dass die Brust freiliegt.
5. Desinfizieren Sie die Haut des Brustkorbs wie in Schritt 1.2 beschrieben.
6. Heben Sie die seitliche Haut der rechten Brust mit einer Gewebezange an und schneiden Sie mit einer kleinen Schere ein Knopfloch von etwa 0,5 cm medial von der rechten Achselhöhle ab. Machen Sie dann mit der Schere einen geraden sagittalen Schnitt in kranialer Ausrichtung.
7. Bilden Sie einen subkutanen Beutel, indem Sie die Haut atraumatisch vom linken großen Brustmuskel lösen. Öffnen Sie dazu wiederholt die kleine Schere (oder mit einem in Kochsalzlösung getränkten Wattestäbchen).
8. Drehen Sie das Tier auf die rechte Seite, um den Kabelweg von der linken Hinterhauptecke der geöffneten Kopfhaut entlang des Halses zu tunneln, um in den Brustbeutel auszutreten, indem Sie mit einer homöostatischen Pinzette in die oberflächliche Faszie eindringen.
9. Öffnen Sie vorsichtig die homöostatische Pinzette, um das Ende des Elektrodenkabels, das an der Platinelektrode befestigt ist, zu greifen, ohne dass scharfe Drähte verrutschen. Ziehen Sie das Kabel durch den Tunnel, bis die Elektrode in den Beutel eintritt, und richten Sie ihn mit dem Lötpunkt auf die linke Hintergliedmaße des Nagetiers aus. Drehen Sie den Nager wieder in die Bauchlage.
10. Befestigen Sie die Platinplatte mit einer sterilen synthetischen, geflochtenen, nicht resorbierbaren Naht an der Brustfaszie an den beiden gegenüberliegenden Ecklöchern (4-5 Knoten werden für die Stabilität empfohlen).
11. Befestigen Sie das Kabel auf ähnliche Weise mit einem losen Knoten an der Faszie, so dass vor dem Eingang des Gewebetunnels eine leichte Schlaufe entsteht.
12. Verschließen Sie die Haut mit 3-4 Hautnähten, je nach Größe des Schnitts (das gleiche Nahtmaterial kann für die Elektrode und das Kabel verwendet werden).

2. Chirurgischer Eingriff: Platzierung der epikraniellen transkraniellen elektrischen Hirnstimulation (tES) Steckdose

1. Platzieren Sie das Tier in einem stereotaktischen Rahmen.
   HINWEIS: Wenn Sie eine Inhalationsanästhesie verwenden, senken Sie die Konzentration des Anästhetikums auf einen Erhaltungsisofluranfluss von ~1,5-1%, angepasst an den Zehenkneifreflex und das Atemmuster.
2. Desinfizieren Sie die rasierte Kopfhaut wie in Schritt 1.2 beschrieben.
3. Schneiden Sie die Haut mit einem Skalpell in einer Linie von der rostralen Augenhöhe bis zur Höhe des Mittelohrs.
   HINWEIS: Wenn die Platzierung der Brustelektrode durchgeführt wurde, wurden die Schritte 2.2 und 2.3 bereits durchgeführt.
Das
4. Periost (Bindegewebe am Schädel) zu den Seiten mit dem Skalpell abkratzen und mit Wattestäbchen gründlich abwischen. Fixieren Sie das Bindegewebe an den 4 Ecken des Schnitts mit Bulldog-Klammern und lassen Sie diese seitlich hängen, um das Operationsfeld offen zu halten.
5. Tragen Sie 0,9% Kochsalzlösung auf, um die Knochenoberfläche und das Gewebe mit Wattestäbchen zu reinigen. Reinigen Sie dann die Knochenoberfläche mit 3 % H₂O₂. Vermeiden Sie den Kontakt mit dem Gewebe. Dadurch wird der Knochen gründlicher gereinigt und kleinere Blutungen aus dem Knochen werden gestoppt. Auch Rückstände des Periosts werden sichtbar. Entfernen Sie diese Rückstände mit einem Wattestäbchen unter mäßigem Druck.
   HINWEIS: Die Entfernung der Periostrückstände erhöht die Adhäsion und Haltbarkeit der auf den Knochen geklebten tES-Alveole.
   1. Bei unaufhaltsamer Blutung benutze einen Knochenbohrer und berühre ihn 1-3 s lang mit leichtem Druck auf den Knochen. Dieses mechanische Verfahren stoppt in den meisten Fällen die Blutung ohne nennenswerte Erwärmung. Verwenden Sie niemals Elektrokauter auf dem Knochen; Schon eine kurze Anwendung führt zu einer Schädigung des Hirngewebes (Elektrokauter sollte nur bei Blutungen im Wundgewebe verwendet werden).
6. Da Befestigungsschrauben die Haftung der Einrichtung verbessern, wählen Sie einen Bohrer, der zur Schraubengröße passt. Platzieren Sie zwei Bohrlöcher auf zwei verschiedenen Knochenplatten, indem Sie mit einer Handbohrmaschine vorbohren und dann mit dem Knochenbohrer leichten vertikalen Druck ausüben. Vermeiden Sie die Nähe zur gewünschten Position des tES-Sockels, da dies das Einschrauben der Elektrode behindern könnte (z. B. wählen Sie für die linke primäre motorische kortikale tES die rechte frontale und hintere parietale Schraubenposition).
7. Bei einer implantierten Gegenelektrode ist ein drittes Loch im rechten hinteren Parietalknochen für die zukünftige Fixierung des getunnelten Kabels zu bohren.
8. Setzen Sie die Kunststoffschrauben in die Fräslöcher ein und schrauben Sie so lange, bis die erste Reibung zu spüren ist. Führen Sie dann drei weitere 180° Schraubendrehungen durch. Überprüfen Sie mit einer Pinzette die Stabilität der Schraube und fügen Sie eine weitere Umdrehung hinzu, wenn sie nicht fest genug angezogen ist.
   HINWEIS: Bei erwachsenen Ratten wird dadurch die epidurale Platzierung der Schrauben gewährleistet, ohne die Dura oder das Gehirn zu beschädigen (je nach Ausführung des Schraubengewindes kann die Windungszahl variieren). Auch der Einsatz von Edelstahlschrauben sollte machbar sein, da auch bei DCS-Stromdichten oberhalb der Neurodegenerationsschwelle; Die Platzierung der Schraube störte weder die Lage noch das Ausmaß der Läsion unterhalb der Schrauben.
9. Schalten Sie den Lötkolben ein und heizen Sie ihn ca. 5 Minuten lang vor. Wickeln Sie das Kabel, das aus dem Gewebetunnel austritt, okzipital um die rechte Parietalschraube und schneiden Sie es dann ab, wobei Sie ca. 1 cm Kabel hinter der Wicklung lassen. Ziehen Sie die Isolierung am Ende des Kabels vorsichtig mit einem Skalpell ab.
10. Befestigen Sie das aufgewickelte Kabel mit Cyanoacrylkleber an der Schraube und dem Knochen.
11. Tragen Sie eine kleine Menge des bleifreien Zinn-Lots auf den Steckverbinder und auf die blanken Drähte des Gegenelektrodenkabels auf und verbinden Sie beides, indem Sie beide vorgelöteten Teile kurz zusammendrücken, während Sie die Lötspitze berühren, bis das Zinn-Lot schmilzt (ca. 2-3 s). Entfernen Sie die Lötspitze sofort, um eine übermäßige Metallerwärmung des Kabels mit anschließender Gewebebeschädigung zu vermeiden.
12. Nehmen Sie die maßgefertigte tES-Elektrodenhülse (Abbildung 1B, in rot) mit einer gebogenen, gezackten Pinzette auf und tragen Sie eine dünne Schicht Cyanoacrylatkleber auf den unteren Rand der Steckdose auf. Für die Platzierung oberhalb des motorischen Kortex und unter Verwendung einer Pfanne mit einem Durchmesser von 4 mm platzieren Sie die mittlere Pfanne 2 mm vor und 2 mm seitlich vom Bregma. Für diese Position sollte der innere mediale Rand der Pfanne direkt an der sagittalen Naht enden, und der kaudale Rand sollte auf Höhe des Bregmas enden. Drücken Sie die Steckdose kurz auf den Knochen (die meisten Cyanoacrylat-Klebstoffe härten durch Druck aus).
    HINWEIS: Wenn Sie eine Lichtquelle direkt über der Steckdose platzieren, kann dies das Platzieren der Steckdose erleichtern.
13. Stellen Sie sicher, dass der Knochen im Bereich der Pfanne frei von Klebstoff ist (durch Überprüfung mit Licht, da der Kleber reflektierend ist). Im Falle eines Verschüttens von Klebstoff entfernen Sie die Steckdose, kratzen Sie den Kleber mit dem Skalpell ab und wiederholen Sie Schritt 2.12.
14. Nachdem die Pfanne eingesetzt ist und der zukünftige Stimulationsbereich frei von Klebstoff ist, versiegeln Sie zunächst den seitlichen Rand der Pfanne zum benachbarten Gewebe mit einem kleinen Tropfen Cyanoacrylatkleber, um eine Flüssigkeitsbrücke zu vermeiden, die zu einem Verschieben des Stroms an dieser Stelle führen könnte. Tragen Sie nicht zu viel Klebstoff auf, da dieser in den Stimulationsbereich fließen kann (in diesem Fall kehren Sie zu Schritt 2.12 zurück).
    HINWEIS: Es ist wichtig, den Stimulationsbereich frei von Klebstoff zu halten, da eine Verkleinerung des Stimulationsbereichs die Stromdichte (A/m²) drastisch erhöhen kann.
15. Bedecken Sie alle Schrauben mit Cyanoacrylkleber.
16. Mischen Sie den Zweikomponenten-Dental-Acrylzement in einem kleinen Silikonröhrchen oder Glas. Sobald es zähflüssig wird, tragen Sie es mit einem Zahnspatel auf, um die verbleibenden Ränder der Pfanne zum Knochen hin zu versiegeln. Vermeiden Sie das Eindringen von Zahnacrylzement in den Stimulationsbereich.
17. Zum Schluss bedecken Sie den gesamten Schädel, die Schrauben, das Gegenelektrodenkabel und den Sockel bis zu 1/3 des Sockels mit Zahnacrylzement. Stellen Sie sicher, dass der Zement die richtige Viskosität hat: Wenn er zu flüssig ist, fließt er in das umgebende Gewebe; Wenn es zu hart ist, ist es schwierig, es gleichmäßig zu verteilen.
18. Wenn der gesamte Knochen bedeckt und der Zement ausgehärtet ist, entfernen Sie die Bulldoggenklemmen; die Haut sollte nur den angesammelten Zement berühren, so dass kein Nähen erforderlich ist. (Wenn der Anfangsschnitt zu lang gewählt wurde und das Bindegewebe oder der Muskel sichtbar ist, legen Sie eine Naht an, wie in Schritt 1.12 beschrieben).
19. Tragen Sie eine Schicht Jod mit einem Wattestäbchen um den Rand der aufgeschnittenen Haut auf und injizieren Sie subkutan Carprofen (5 mg/kg Körpergewicht gelöst in 5-7,5 ml 0,9%iger Kochsalzlösung zur Schmerzbehandlung und zum Flüssigkeitsersatz).
    HINWEIS: Wenn Sie eine Inhalationsanästhesie verwenden, schalten Sie diese jetzt aus.
20. Legen Sie das Nagetier in eine Wärmebox, um sich von der Narkose zu erholen, bis das Nagetier wach ist und die Haltungsstabilität wiederhergestellt ist.
    HINWEIS: Überprüfen Sie täglich die Gewichtsentwicklung, den Wundzustand und die allgemeinen Wohlbefindenskriterien des Tieres gemäß den Empfehlungen der Einrichtung.

3. Verfahren der transkraniellen Elektrostimulation

HINWEIS: Da die Anästhesie die Auswirkungen auf tES beeinflusst, wird empfohlen, die Stimulation nach Möglichkeit bei wachen Nagetieren durchzuführen. Lassen Sie das Nagetier mindestens 5 Tage lang genesen (Heilung der Kopf- und Brustwunde), bevor Sie mit den Versuchen beginnen. Experimente können zu früheren Zeitpunkten nach der Operation durchgeführt werden, wenn eine externe Gegenelektrode verwendet wird, die mit einer Weste befestigt ist, da die Brustwunde am reizbarsten ist, aber die Tiere müssen sich mehrere Tage lang an die Elektrodenweste gewöhnen, und es kann zu einer Beeinträchtigung von Verhaltensaufgaben kommen.

1. Füllen Sie die tES-Elektrodenfassung zur Hälfte mit 0,9 % Kochsalzlösung und entfernen Sie Luftblasen.
2. Überprüfen Sie vor einer kathodalen transkraniellen Gleichstromstimulation (tDCS) immer die Chlorierung und chlorieren Sie die Ag/AgCl-Elektrode bei Bedarf (z. B. auf einer glänzenden silbernen Oberfläche) erneut. Entfernen Sie vor anodalen tDCS-Sitzungen mögliche überschüssige AgCl-Ablagerungen aus früheren Stimulationen mit Schleifpapier, um eine gute Leitfähigkeit während der Stimulation zu ermöglichen. Schrauben Sie den Schraubverschluss der tES-Elektrode ein (Abbildung 1B, graues Stück).
   VORSICHT: Wenn die Elektrode zwischen den kathodalen tDCS-Sitzungen nicht erneut chloriert wird, führt dies zu einer Erschöpfung der Chlorierung während der Stimulation und zu toxischen Ablagerungen durch elektrochemische Reaktion. Dies führt zu Gewebeschäden. Eine erneute Chlorierung ist nicht innerhalb einer einzigen Sitzung erforderlich, wenn die Stimulationsdauer kürzer als 20 Minuten ist.
3. Verbinden Sie die Kabel mit den beiden Anschlüssen am Kopf (bei der anodalen Stimulation wird das anodale Kabel mit dem Anschluss an der Schraubkappe verbunden, bei der kathodalen Stimulation ist es umgekehrt).
   HINWEIS: Wenn Sie eine extern platzierte Gegenelektrode verwenden, bedecken Sie die Gegenelektrode mit leitfähigem Gel und legen Sie sie auf die Brust des Nagetiers. Dies ist am einfachsten, wenn die Elektrode in einer kleinen Nagetierweste vorfixiert ist, die der Nager während der Stimulation tragen kann.
4. Setzen Sie das Nagetier in den Versuchskäfig, wobei die Kabel mit einem Drehgelenk über dem Käfig verbunden sind, das eine freie Bewegung ermöglicht.
5. Schalten Sie den Stimulator ein und passen Sie die Stimulationsparameter an (Stimulationsintensität, Dauer, Auf- und Abfahrzeit).
6. Wenn Sie kein handelsübliches Stimulationsgerät mit Sicherheitsabschaltung und Abschaltalarm verwenden, schließen Sie ein Messgerät in den Stromkreis ein, um den Konstantstromfluss zu überprüfen.
   HINWEIS: Mit diesem Aufbau kann die Stimulation während der Durchführung oder des Trainings von Verhaltensaufgaben angewendet werden.
7. Überprüfen Sie während der Stimulation auf Anzeichen von Stress oder Unbehagen beim Nagetier.
8. Trennen Sie nach Beendigung der Stimulation die Kabel, schrauben Sie die Elektrodenkappe am Kopf ab und reinigen und trocknen Sie die Steckdose mit einem Wattestäbchen. Bringen Sie das Nagetier in die häusliche Umgebung zurück oder fahren Sie mit einer Verhaltensprozedur fort, falls gewünscht.

Abbildung 1: Verbrauchsmaterialien für die Chirurgie und technisches Schema der tES-Buchse und der Elektrodenkappeneinheit. (A) 1. Wattestäbchen, 2. Desinfektionsmittel, 3. stereotaktischer Rahmen, 4. Lötkolben, 5. Analgetikum (z. B. Carprofen), 6. & 7. Urheberrecht Anästhetika (z. B. Xylazin und Ketamin), 8. Spritze, 9. Klipper, 10. Ohrlocher, 11. Augensalbe (z. B. Bepanthen), 12. bleifreies Zinnlöten, 13. Zweikomponenten-Dental-Acryl-Zement (DAC), 14. Jod, 15. 3% H2O2, 16. 0,9% Kochsalzlösung, 17. synthetisches geflochtenes, nicht resorbierbares Nahtmaterial (z. B. Mersilene 4-0), 18. Bohrer, 19. Cyanoacrylat-Kleber, 20. Bulldog-Klemmen 21. Homöostatische Zange, 22. gebogene, gezackte Pinzette, 23. gerade, scharfe Pinzette, 24. gerade, Gewebezange, 25. Zahnspatel, 26. Skalpell, 27. Schere, 28. Handbohrmaschine, 29. Schraubendreher, 30. motorbetriebene Bohrmaschine, 31. Buchsen, 32. tES-Steckdose, 33. quadratische Platinelektrode am Kabel befestigt, Lötstelle mit Histoacrylkleber überzogen, 34. Kunststoffschrauben. (B) tES-Sockel (rot) zur Befestigung am Nagetierschädel mit einem Innendurchmesser von 4 mm; Die Elektrodeneinheit (grau) besteht aus einem Schraubverschluss und einem Innenstempel mit einem Mittelloch, das Platz für das Kabel der Ag/Cl-Scheibenelektrode lässt, das auf die Unterseite des Stempels geklebt wird. Dies ermöglicht eine maximale Stabilität des Aufbaus und die Vermeidung von Drahtbrüchen an der empfindlichen Draht-Elektroden-Verbindungsstelle.