Expansion von humanen peripheren Blut γδ T-Zellen mit Zoledronat

Zusammenfassung

Eine Methode, um γδ T-Zellen aus dem peripheren Blut mononukleären Zellen (PBMC) erweitern wird beschrieben. PBMC-derived γδ T-Zellen stimuliert und erweitert mit Zoledronat und Interleukin-2 (IL-2). Großräumige Ausdehnung der γδ T-Zellen können zur autologen zellulären Immuntherapie von Krebs angewendet werden.

Zusammenfassung

Menschliche γδ T-Zellen erkennen und reagieren auf eine Vielzahl von Stress-induzierte Antigene, wodurch die Entwicklung angeborenen breiten Anti-Tumor-und anti-infektiösen Aktivität. ¹ Die Mehrheit der γδ T-Zellen im peripheren Blut haben die Vγ9Vδ2 T-Zell-Rezeptor. Diese Zellen erkennen Antigen in einer Haupthistokompatibilitätskomplex-unabhängige Art und Weise und zu entwickeln starke zytolytischer und Th1-like Effektor-Funktionen. ¹ Darum sind γδ T-Zellen attraktiven Kandidaten Effektorzellen zur Immuntherapie von Krebs. Vγ9Vδ2 T-Zellen zu phosphoantigens wie reagieren (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl-pyrophosphat (HMBPP), die in Bakterien über Isoprenoidbiosynthese synthetisiert wird; ² und Isopentenylpyrophosphat (IPP), das hergestellt wird in eukaryotischen Zellen durch die Mevalonatweges. ³ In physiologischer Zustand, ist die Erzeugung von IPP in transformierten Zellen nicht ausreichend für die Aktivierung von γδ T-Zellen. Dysregulation des Mevalonat-Weg in Tumorzellen führt zu einer Akkumulation von IPP und γδ T-Zellen-Aktivierung. ³ Weil Aminobisphosphonate (wie Pamidronat oder Zoledronat) hemmen Farnesylpyrophosphat Synthase (FPP), das Enzym wirkt hinter IPP in der Mevalonat-Weg, intrazellulären IPP und sensitibity auf γδ T-Zellen Anerkennung kann therapeutisch durch Aminobisphosphonate erhöht werden. IPP Akkumulation ist weniger effizient in nontransfomred Zellen als Tumorzellen mit einem pharmakologisch relevante Konzentration von Aminobisphosphonate, die es uns ermöglichen Immuntherapie gegen Krebs durch Aktivierung γδ T-Zellen mit Aminobisphosphonate. ⁴ Interessanterweise, IPP in Monozyten ansammelt, wenn PBMC mit Aminobisphosphonate behandelt werden, weil der effizienten Drogen-Aufnahme durch die Zellen. ⁵ Monozyten, die IPP zu akkumulieren Antigen-präsentierenden Zellen und stimulieren Vγ9Vδ2 T-Zellen im peripheren Blut. ⁶ auf diese Mechanismen, entwickelten wir eine Technik, die für eine groß angelegte Ausbau des γδ T-Zell-Kulturen mit Zoledronat und Interleukin -2 (IL-2). ⁷ Andere Methoden zur Erweiterung der γδ T-Zellen nutzen die synthetische phosphoantigens Bromhydrin Pyrophosphat (BrHPP) ⁸ oder 2-Methyl-3-Butenyl-1-pyrophosphat (2M3B1PP). ⁹ Alle diese Methoden ex ermöglichen vivo Expansion, die sich in einer großen Anzahl von γδ T-Zellen für den Einsatz in adoptiven Immuntherapie. Allerdings ist nur Zoledronat eine FDA-Zulassung im Handel erhältlichen Reagenz. Zoledronat-expanded γδ T-Zellen-Display CD27 ^- CD45RA ^- Effektor-Memory-Phänotyp und ihre Funktion kann durch IFN-γ Produktion Assay ⁷ ausgewertet werden.

Protokoll

1. Isolierung von PBMC

1. Draw Blut (7,5 bis 8,0 ml) in einen BD Vacutainer CPT Cell Preparation Röhrchen mit Natrium Heparin. Die Röhre enthält eine Natrium-Heparin als Antikoagulans und eine Ficoll-Hypaque Dichte Flüssigkeit, plus ein Polyester-Gel-Schranke, die die beiden Flüssigkeiten voneinander trennt. Zentrifugenröhrchen / Blutprobe bei Raumtemperatur (18 ° C bis 25 ° C) in einer horizontalen Rotor (swing-out Kopf) für 20 min bei 1800 x g. Schalten Zentrifuge bremst ab.
2. Nach der Zentrifugation erfolgt die Reihenfolge der Schichten wie folgt (gesehen von oben nach unten): a) Plasma - b) periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) und Thr....

Diskussion

Die hier vorgestellte Methode ermöglicht eine effiziente Erweiterung der γδ T-Zellen aus PBMC. γδ T-Zellen aktiviert und durch Zoledronat erweitert und IL-2 entwickeln komplette Effektor-Funktionen, durch die Zytokin-Produktion und Zytotoxizität wider. Es wurde berichtet, dass die synthetischen phosphoantigens Bromhydrin Pyrophosphat (BrHPP) und 2-Methyl-3-Butenyl-1-pyrophosphat (2M3B1PP) auch erweitern γδ T-Zellen, jedoch sind sie nicht im Handel erhältlich. Im Gegensatz dazu ist Zoledronat bereits für klinische Anwend.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagent Name	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
ZOMETA	Novartis Pharma K. K		Zoledronat
Proleukin	Novartis Pharmaceuticals		humanem rekombinantem IL-2
BD Vacutainer CPT Cell Preparation Röhrchen mit Natrium-Heparin	BD	362753
RPMI1640	Invitrogen	21870-076
ALyS203-Medium	Cell Science & Technology Institute	0301-7
OpTmizer	Invitrogen	0080022SA
Brefeldin A	Sigma	B5936-200 &mgr; l
Phorbol 12-myristat 13-Acetat (PMA)	Sigma	P1585-1MG
Ionomycin	Sigma	13909-1ML
IntraPrep	Wichtige Produktinformation	A07803
anti-human CD3-FITC oder PE/Cy5	Wichtige Produktinformation	A07746 FITC A07749 PE/Cy5
Anti-Human-CD4-ECD	Wichtige Produktinformation	6604727
Anti-Human-CD8-PE/Cy5	Wichtige Produktinformation	6607011
Anti-Human-CD14-PE/Cy5	Wichtige Produktinformation	A07765
Anti-Human-CD19-PE	Wichtige Produktinformation	A07769
Anti-Human-CD45-ECD	Wichtige Produktinformation	A07784
Anti-Human-CD56-PE/Cy5	Wichtige Produktinformation	A07789
Anti-Human-TCRαβ-PE	Wichtige Produktinformation	A39499
Anti-Human-TCR Vγ9-FITC	Wichtige Produktinformation	IM1463
Anti-Human-CD27-PE/Cy5	Wichtige Produktinformation	6607107
Anti-Human-CD45RA-ECD	Wichtige Produktinformation	IM2711
Anti-Human-CD69-PE	BD	555531
Anti-Human-NKG2D-PE	Wichtige Produktinformation	A08934
Anti-humal IFNy-PE	Wichtige Produktinformation	IM2717U
Maus IgG1 Isotyp-Kontroll-PE	Wichtige Produktinformation	A07796
Maus IgG1 Isotyp-Kontroll-ECD oder PE/Cy5	Wichtige Produktinformation	A07797 A07798