Mikrofluidik-basiertes Mikroinjektrodensystem für die kombinierte Wirkstoffinfusion und Elektrophysiologie

Zusammenfassung

Quelle: Vanegas, M. I., et al. Mikroinjektrodensystem für kombinierte Wirkstoffinfusion und Elektrophysiologie. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt ein mikroelektrodenbasiertes mikrofluidisches Gerät, das eine Arzneimittellösung durch ein Kapillarrohr abgibt, wobei eine ölbasierte Markerlösung für eine präzise Volumenverfolgung verwendet wird und eine gleichzeitige neuronale Aufzeichnung und Wirkstoffinfusion ermöglicht wird.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Aufbau der Mikroinjektrode für die Stimulation und Aufzeichnung (Abbildung 1a)

1. Messen Sie die Länge der Kanüle und der Sonde (in diesem Beispiel eines Nanosensors). Die Sonde muss länger als die Kanüle sein, und zwar um die Länge, die sie aus der Kanülenspitze herausragen soll (je nach Sondenausführung), plus ca. 2 cm.
2. Laden Sie die Sonde unter einer Lupe oder einem Mikroskop (~10-fache Vergrößerung) in die Kanüle; wenn möglich, ist ein Backloading vorzuziehen, um die Spitze der Sonde zu schützen.
   HINWEIS: Dieser Schritt, der manuell durchgeführt wird, ist eine Herausforderung. Es wird empfohlen, mit einer Mikroelektrode unter einer Lupe zu üben, bevor man es mit einer tatsächlichen experimentellen Sonde versucht.
3. Führen Sie die Kanüle (mit der Sonde) durch die obere Ferrule, den T-Übergang und die untere Ferrule.
   1. Wenn die Sonde nur ein einzelner Draht ohne jegliche Befestigungen ist, lade sie zurück in die Kanüle und setze die Baugruppe von der unteren Ferrule in den T-Übergang ein. Die Oberseite der Kanüle (flache Seite) sollte in der Mitte des T-Übergangs innerhalb der unteren, aber nicht der oberen Ferrule positioniert werden. Die experimentelle Sonde oder der Biosensor sollte über die Oberseite der Ferrule hinausragen.
      HINWEIS: Sonderanfertigungen können auch hergestellt werden, indem mit Mikrobohrern ein Loch in die Ferrule-Stopfen gebohrt wird, wobei die Größe des Lochs auf dem Durchmesser basiert, der zum Anziehen der Kanüle an der T-Überleitung erforderlich ist.
4. Verwenden Sie den Aderendhülsenschlüssel, um die Aderendhülsen an der Ober- und Unterseite der T-Kreuzung festzuziehen. Nicht zu fest anziehen. Ein kleines Stück Schlauch kann hinzugefügt werden, um die Elektrodenhalterung in der oberen Ferrule zu verstärken.
5. Löten Sie Goldstifte an jeden der Sondenanschlüsse (Signal, Masse usw.) gemäß den Spezifikationen der Sonde.
6. Passen Sie die relative Position von Sonde und Kanüle an. Messen Sie den Abstand, den die Sonde unter der Vergrößerung aus der Kanüle herausragt, und stellen Sie ihn manuell vom oberen Ende aus ein (die Sonde kann frei in den Aderendhülsen gleiten).
7. Fügen Sie Epoxidkleber zwischen den Goldstiften und der oberen Zwinge hinzu, um die Sonde an der Zwinge zu befestigen.
8. Schrauben Sie die obere Ferrule ab, um die Sonde in der Kanüle zurückzuziehen. Vergewissern Sie sich visuell, dass sich die Sonde unter der Vergrößerung vollständig in der Kanüle befindet.
9. Befestigen Sie die Injektionsrode an der Mikroschraube.

2. Aufbau der Mikroinjektionsrode für die Arzneimittelinfusion (Abbildung 1b)

1. Befestigen Sie das "nicht abgeschrägte" oder flache Ende der Kanüle mit einer Zwinge an der Unterseite des T-Übergangs. Verwenden Sie den Aderendhülsenschlüssel, um die Aderendhülse festzuziehen.
2. Befestigen Sie ein kleines Stück Kapillarschlauch (~1,5 cm) an der Oberseite der T-Verbindung, indem Sie es durch die Standardhülse führen. Mit einem Aderendhülsenschlüssel festziehen.
3. Laden Sie die Mikroelektrode durch den Kapillarschlauch, den T-Übergang, die Kanüle und die entsprechenden Ferrules zurück.
4. Achten Sie darauf, dass das hintere Ende der Elektrode weniger als 1 cm aus der Rückseite des Kapillarschlauchs herausragt und die Spitze der Elektrode an der Unterseite im gewünschten Abstand aus der Kanüle herausragt. Die Elektrodenposition kann manuell von oben eingestellt werden.
5. Löten Sie einen Goldstift an den Mikroelektrodenanschluss.
6. Fügen Sie Epoxidkleber zwischen dem Goldstift und der oberen Ferrule hinzu, um die Mikroelektrode an der Ferrule zu befestigen.
7. Schrauben Sie die obere Ferrule ab, um die Sonde in der Kanüle zurückzuziehen. Bestätigen Sie visuell, dass die Mikroelektrode vollständig in die Kanüle eingefahren ist.

3. Aufbau des mikrofluidischen Schaltkreises (Abbildung 2)

1. Stellen Sie ein Steckbrett auf eine stabile Oberfläche. Platzieren Sie die beiden Dreiwegeventile parallel zu den längsten Seiten des Steckbretts, etwa 6 Zoll. auseinander, wobei ein Port (der immer offen ist) einander zugewandt ist. Befestigen Sie die Ventile mit Schrauben am Steckbrett.
2. Legen Sie ein Lineal neben die Ventile (um die Bewegung von Flüssigkeiten im Kapillarschlauch zu messen und zu verfolgen).
3. Geben Sie eine Mischung aus 1:1 niedrigviskosem Öl und Lebensmittelfarbe (Marker) in die gasdichte Spritze und geben Sie sie in die Markerpumpe. Schneiden Sie ein Stück Kapillarschlauch ab und verwenden Sie Standard-Aderendhülsen und Luer-Lock-Anschlüsse, um die Spritze mit einem der Anschlüsse am Eingangsventil zu verbinden. Dies ist die "Markierungslinie".
4. Schneiden Sie ein kurzes Stück Kapillarschlauch für die "Lineallinie" ab. Verwenden Sie Standard-Aderendhülsen, um sie an den gegenüberliegenden Anschlüssen der Ventile festzuziehen.
5. Schneiden Sie zwei längere Stücke Kapillarschlauch ab, um das Ausgangsventil mit der Mikroinjektionsstange und die Arzneimittelpumpe mit dem Eingangsventil zu verbinden (verwenden Sie Standardhülsen).
   HINWEIS: Die Länge dieser beiden Leitungen hängt vom Versuchsaufbau ab, eine muss lang genug sein, um vom Infusionsapparat zum Tier zu gelangen, und die andere von der Medikamentenpumpe zum Eingangsventil. Verwenden Sie einen Spaltstein, um den Kapillarschlauch zu durchtrennen.

4. Montieren der Mikroinjektrode am Mikroantrieb (Abbildung 3)

1. Stellen Sie sicher, dass die Mikroelektrode/experimentelle Sonde vor der Montage in die Kanüle eingefahren ist.
   HINWEIS: Das Führungsrohr sollte sich in einer Position im Mikroantrieb befinden.
2. Befestigen Sie einen speziell angefertigten Adapter an der Mikroinjektrode.
3. Laden Sie die Mikroinjektionsrode von oben durch das Führungsrohr und befestigen Sie sie mit Schrauben am Adapter.
4. Messen Sie die Position des Mikroantriebs (Tiefe), in der die Mikroinjektionsrode aus dem Führungsrohr herausragt, und ziehen Sie sie dann ~1 cm zurück, um das Einführen vorzubereiten.
5. Für Mikroinfusionsexperimente verbinden Sie die "Gehirnleitung" mit der unbenutzten T-Übergangsöffnung der Mikroelektrode. Verwenden Sie eine Standard-Aderendhülse und ziehen Sie sie mit einem Aderendhülsenschlüssel fest.

5. Spülen und Vorbereiten des mikrofluidischen Systems

1. Positionieren Sie den Mikroantrieb mit der Mikroinjektionsrode über einem Abfallbecher.
2. Laden Sie Chlorhexidin (z. B. Nolvasan, gelöst bei 20 g/L) in die 1 mL gasdichte Spritze und geben Sie sie in die Medikamentenpumpe. Drehen Sie die Strömungsrichtung der Ventile so, dass die Flüssigkeit von der Medikamentenpumpe durch das Ventil zur Ventilleitung und aus der "Gehirnleitung" fließt.
3. Spülen Sie den Kreislauf mit Chlorhexidin bei einer niedrigen Durchflussrate (50-200 μl/min) für mindestens 10 Minuten. Wiederholen Sie die Schritte 5.2 bis 5.3 mit steriler Kochsalzlösung und dann mit Luft.
   HINWEIS: Es ist wichtig, zu diesem Zeitpunkt auf Undichtigkeiten zu prüfen. Tragen Sie vorsichtig fusselfreie Tücher an den Verbindungsstellen auf, um Flüssigkeitslecks durch die Aderendhülsen sichtbar zu machen.
4. Laden Sie das Medikament in die gasdichte 500-μl-Spritze, komprimieren Sie die Luft und geben Sie es dann in die Medikamentenpumpe. Fließen Sie mit 50 μL/min, bis einige Tropfen aus der Mikroinjektrode fließen.
5. Weichen Sie das Führungsrohr 15 Minuten lang in Chlorhexidin (gelöst bei 20 g/L) ein.
6. Drehen Sie die Richtung des Ausgangsventils in Richtung der "Spülleitung". Schieben Sie die Markierungspumpe voran, bis eine klare Kante aus Farbe und Öl auf der Lineallinie zu sehen ist. Stellen Sie sicher, dass sich immer Öl zwischen dem Medikament und der Farbe befindet, um die beiden wasserlöslichen Materialien nicht zu vermischen und die scharfe Kante zwischen ihnen zu verlieren. Markieren Sie die Startposition dieser Öl-/Färbelinie (mit einem Stück Klebeband oder Marker).
7. Drehen Sie die Richtung des Ausgangsventils in Richtung der Gehirnleitung.

6. Durchführung einer Aufzeichnung oder eines Infusionsexperiments

HINWEIS: Die Schritte zur Handhabung der Tiere variieren je nach Labor und Experiment. Die folgenden Schritte sind nach dem notwendigen chirurgischen Aufbau und der Vorbereitung zur Freilegung der Dura durchzuführen. Im Anschluss an das Experiment müssen alle notwendigen Schritte nach dem Eingriff in Übereinstimmung mit institutionell anerkannten Protokollen durchgeführt werden.

1. Schließen Sie das Mikrolaufwerk an die Aufnahmekammer an. Senken Sie das Führungsrohr ab, um in die Dura einzudringen.
   HINWEIS: Das Führungsrohr sollte nicht weiter als die Dura eindringen, um eine Beschädigung der Hirnrinde zu vermeiden.
2. Senken Sie die Mikroinjektionsrode auf etwa 2 mm über die Stelle für die Aufnahme/Injektion im Gehirn ab.
3. Ziehen Sie die obere Ferrule (hervorstehende Mikroelektrode/Biosensor) fest und verbinden Sie die goldenen Stifte mit dem Aufzeichnungssystem. Schieben Sie die Mikroinjektrode weiter zur Zielstelle.
   HINWEIS: Denken Sie daran, die Entfernung, die die Mikroelektrode über die Kanüle hinaus reicht, in die Berechnungen einzubeziehen.
4. Verwenden Sie für Infusionsexperimente die manuelle Mikrospritzenpumpe, um die Ölsäule alle 3 Minuten um 1 cm (~60 nL/min) zu bewegen. Sobald das gewünschte Volumen infundiert wurde, schalten Sie das Ausgangsventil in Richtung der Spülleitung.
   HINWEIS: Das infundierte Volumen variiert je nach Modellspezies und Zielhirnbereich. Schnellere Flussraten können das Nervengewebe schädigen.
5. Wenn die Versuche abgeschlossen sind, ziehen Sie die Mikroinjektrode in das Führungsrohr zurück (lassen Sie die Sonde hervorstehen). Entfernen Sie dann das Mikrolaufwerk zum Spülen. Spülen Sie das mikrofluidische System, um es für die Wiederverwendung vorzubereiten. Anmerkung: Unserer Erfahrung nach hält die Mikroinjektrode bei richtiger Pflege mehrere Anwendungen. Die Qualität der elektrophysiologischen Aufzeichnung sinkt schneller als die Fähigkeit der Injektion.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schritt-für-Schritt-Herstellung von Mikroinjekrode.) Konfiguration für den Einsatz unabhängig vom mikrofluidischen System. Kanüle und Sonde werden vermessen, um zu bestätigen, dass die Spitze der Sonde in der gew...

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