Entwicklung eines Einseitig-läsionierten 6-OHDA Mausmodell der Parkinson-Krankheit

Zusammenfassung

Ein Protokoll zur Durchführung einseitige 6-OHDA Läsionen der mediale Vorderhirnbündel in Mäusen beschrieben. Dieses Verfahren hat eine niedrige Mortalitätsrate (13,3%) mit 89% der überlebenden Tiere mit> 95% Verlust von striatalen Dopamin und 90,63 ± -4,02% ipsiversive Drehvorspannung nach der Seite der Läsion.

Zusammenfassung

Die einseitig verletzten 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-Läsion Rattenmodell der Parkinson-Krankheit (PD) hat sich als zu einem besseren Verständnis der Mechanismen der Parkinson-Symptome von unschätzbarem Wert, da er rekapituliert die Veränderungen in den Basalganglien Schaltung und Pharmakologie in beobachtet Parkinson-Patienten ^1-4. Jedoch bleiben die genauen zellulären und molekularen Veränderungen bei kortiko-striatalen Synapsen der Ausgang Wege in das Striatum, das die wichtigen Input Region der Basalganglien ist schwer zu fassen, und dies wird angenommen, dass Ort, an dem zugrunde liegenden pathologischen Auffälligkeiten Parkinson-Symptome entstehen ³ sein ^{, 5.}

In PD, hat das Verständnis der Mechanismen, die Veränderungen in den Basalganglien Schaltung folgende Degeneration der nigro-striatalen Bahn wurde stark durch die Entwicklung von Bacterial Artificial Chromosome (BAC) Mäuse vorangetrieben überexprimierenden grün fluoreszierende Proteine ​​durch Förderung angetriebenRS spezifische für die beiden striatalen Bahnen Ausgang (direkter Weg: eGFP-D1; indirekten Weg: eGFP-D2 und eGFP-A2a) ^8, so dass sie in Isolation untersucht werden. Zum Beispiel haben neuere Studien nahelegen, dass es pathologische Veränderungen in der synaptischen Plastizität in Parkinson-Mäusen ^9,10. Diese Studien jungen Mäusen und akuten Modellen von Parkinsonismus verwendet. Es ist unklar, ob die Veränderungen bei erwachsenen Ratten, die mit stabilen 6-OHDA Läsionen beschrieben auch in diesen Modellen auftreten. Andere Gruppen haben versucht, eine stabile unilateral lädierten-6-OHDA erwachsenen Maus-Modell der PD durch Läsion des medialen Vorderhirnbündel (MFB) zu erzeugen, leider war die Mortalitätsrate in dieser Studie sehr hoch, mit nur 14% für die Operation überlebt 21 ¹¹ Tage oder länger. Neuere Studien haben intra-nigralen Läsionen sowohl mit einer niedrigen Sterblichkeitsrate generiert> 80% Verlust von dopaminergen Neuronen jedoch Ausdruck von L-DOPA-induzierte Dyskinesien ^11,12,13,14 war variabelIn diesen Studien. Eine andere gut etablierte Mausmodell der PD ist der MPTP-behandelten Maus ^15. Während dieses Modell hat sich bewährt, bei der Beurteilung der potenziellen neuroprotektive Mittel ¹⁶ ist es weniger geeignet für das Verständnis der Mechanismen, die Symptome der PD, wie dieses Modell oft nicht gelingt, motorische Defizite zu induzieren, und zeigt eine große Variabilität in der Ausdehnung der Läsion ^{17, 18} .

Hier haben wir eine stabile unilateralen 6-OHDA-lädierten Mausmodell der PD durch direkte Verabreichung von 6-OHDA in das MFB entwickelt, die konsequent verursacht> 95% Verlust von striatalen Dopamin (gemessen durch HPLC), sowie die Herstellung der Verhaltens- Ungleichgewichte beobachtet in der Vertiefung dadurch einseitige 6-OHDA-lädierte Ratten-Modell der Parkinson. Diese neu entwickelte Mausmodell der PD wird ein wertvolles Instrument für das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen Generation von Parkinson-Symptome.

Protokoll

1. Wohnungs-und Zubereitung von Mäusen

1. Achten Sie auf eine Kolonie von Bacterial Artificial Chromosome (BAC) angetrieben transgenen Mäusen ⁸ (Mutant Mouse Regional Resource Center (MMRRC) FVB in einem 12:12 h Licht-Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser. Diese Mäuse sind reine FVB-Mäusen und Es ist nicht erforderlich, diese Mäuse mit einem anderen Stamm zu überqueren, entweder zur Zucht oder für den Erfolg der 6-OHDA Läsion Verfahren zu gewährleisten.
2. Um eine Parkinson-Modell zu erzeugen, werden erwachsene Mäuse im Alter von 31 bis 42 postnatalen Tag (P31-42) für 6-OHDA-Läsion und Schein-Operationen erforderlich.
3. Um das Risiko einer Infektion zu verringern, die Verwaltung Baytril (Antibiotikum) in das Trinkwasser für 24 Stunden vor der Operation.

2. Herstellung von Medikamenten für die Chirurgie

Eine Prämedikation von Desipramin und Pargylin wird in der Regel zu Nagetieren vor der Injektion von 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) verabreicht, um die Selektivität zu erhöhen und efficacy von 6-OHDA-induzierten Läsionen. Die Noradrenalin / 5HT Hemmer, verringert Desipramin 6-OHDA induzierten Noradrenalin und 5HT Abreicherung ^22, während der Monoaminoxidase-Hemmer, erhöht die Empfindlichkeit des Pargylin dopaminergen Terminals 6-OHDA, indem extrasynaptischen Abbau von 6-Hydroxydopamin ^31.

1. Die Prämedikation (Desipramin Hydrochlorid (HCl) und Pargylin HCl) kann in großen Mengen hergestellt werden und bei -80 ° C bis zur Verwendung. Wiegen Sie die entsprechende Menge von Desipramin HCl an jede Maus mit 25 mg / kg für die Anzahl der Tiere, die Operation an diesem Tag erhalten zu versorgen. Das geringe Gewicht der Maus macht es schwierig, kleine Mengen genau zu liefern, deshalb bereiten Desipramin-Hydrochlorid in einer Konzentration von 2,5 mg / ml und verabreicht, um das Tier bei 10 ml / kg. Das Gewicht der Salz-Komponente der Verbindung muss, so dass die korrekte Konzentration erreicht wird berücksichtigt werden. Korrektur für das Gewicht derHCl-Salz in Desipramin-Hydrochlorid: Molekulargewicht (MW) von Desipramin HCl: 302,84 MW HCl: 36,46 MW an freier Base: 266,38 Korrekturfaktor: 302,84 / 266,38 = 1,137 für 10 ml Lösung: = 2.5mg/ml Desipramin x 10,0 ml x = Korrekturfaktor 2.5mg/ml x 1,137 = 10,0 ml x 28.43mg von Desipramin hydrochlorid
2. Abwiegen der entsprechenden Menge an HCl Pargylin an jede Maus mit 5mg/kg für die Anzahl der Tiere, die Operation an diesem Tag zu versorgen. Korrigieren der Salz-Komponente der Verbindung wie oben beschrieben. Das geringe Gewicht der Maus macht es schwierig, kleine Mengen genau zu liefern, deshalb bereiten Pargylin Hydrochlorid in einer Konzentration von 0,5 mg / ml und zu verwalten, um das Tier bei 10 ml / kg.
   Korrigieren des Gewichts des HCl-Salzes in Pargylin-Hydrochlorid:
   MW Pargylin HCl: 195,69 MW HCl: 36,46
   MW der freien Base: 159,23 Korrekturfaktor: 195,69 / 159,23 = 1,229
   Für 10 ml Lösung abwiegen:
   = 0,5 mg / ml Pargylin x 10,0 ml x Korrekturfaktor
   = 0,5 mg / ml x 10,0 ml x 1,229
   = 6.15mg von Pargylin Hydrochlorid
3. Kombinieren Sie 28.43mg Desipramin HCl und 6.15mg Pargylin HCl in ein 10 ml Glas-Messzylinder, und 8 ml steriler Kochsalzlösung (0,9%). Vortex und Wärme auf 45 ° C, bis das Gemisch gelöst wird. Der pH-Wert der Lösung wird nun rund 3 sein, was, wenn den Mäusen verabreicht wird, Beschwerden und postoperative Komplikationen mit Harn-und Magen-Darm-Funktion verursachen. In Tropfen NaOH (1 M), bis der pH-Wert beträgt 7,4. Füllen Sie das Volumen auf 10 ml mit steriler Kochsalzlösung (0,9%) und Wirbel. Label, Datum und Einfrieren bei ~ 80 ° C Da Pargylin HCl nicht löslich in Kochsalzlösung bei Raumtemperatur, während des gesamten chirurgischen Zeitraum speichern die Prämedikation Mischung in einem Wasserbad erwärmt auf 37 ° C im Operationssaal.
4. Lösungen von 6-OHDA unverzüglich vor Operationen hergestellt werden. Das Fahrzeug verwendet werden, um 6-OHDA-Hydrobromid (6 aufzulösenOHDA.Br-) Lösung ist steriler Kochsalzlösung (0,9%) Lösung mit Ascorbinsäure (0,2%). Ascorbinsäure benötigt wird, um 6-OHDA.Br zu stabilisieren, wie Oxidation von 6-OHDA.Br verhindert wird, dass einer inaktiven Form. Abwiegen 0,2 g Ascorbinsäure, fügen Sie dann auf eine leere 1 l-Meßzylinder, oben bis zu 1 L mit einer sterilen Kochsalzlösung (0,9%) und umrühren. Label-, Datums-und lagern bei ~ 80 ° C, bis sie benötigt.
5. Wiegen Sie die entsprechende Menge von 6-OHDA.HBr eine 15,0 mg / ml Lösung an jede Maus mit 3,0 pg liefern zu machen. Seit 6-OHDA.Br ist Licht und Wärme empfindlich Bestrahlung vermeiden, und auf Eis vor dem Wiegen.
   Korrigieren des Gewichts der HBr-Salz in 6-OHDA.HBr:
   MW von 6-OHDA.HBr: 250,09 MW HBr: 79,9 MW an freier Base: 170,19
   Korrekturfaktor: 250,09 / 170,19 = 1,47
   Für 0,5 ml Lösung abwiegen:
   = 15,0 mg / ml 6-OHDA x 0,5 ml x Korrekturfaktor
   = 15,0 mg / ml 6-OHDA x 0,5 x 1,47 ml
   = 11,03 mg 6-OHDA.HBr
6. Wiegen 6-OHDA.HBr in ein steriles 1,0 ml Röhrchen in Aluminiumfolie abgedeckt, und fügen Sie 0,5 ml Fahrzeug (sterile Kochsalzlösung (0,9%), Ascorbinsäure 0,02% pH 7,4). Vortex, bis die Mischung wird aufgelöst, die Beschriftung und Ort sofort auf Eis bis zum Gebrauch. Beachten Sie, dass die 6-OHDA-Lösung innerhalb von etwa 6 Stunden müssen nach der Herstellung verwendet werden. Wenn sich die Lösung dunkelbraun entweder direkt nach der Herstellung oder während der Operation, bedeutet dies, dass 6-OHDA.HBr geworden oxidiert, und ist nicht mehr eine wirksame Neurotoxin, so muss dieser wieder hergestellt.
7. Für Sham-Tieren, bilden eine gleichwertige Menge von Fahrzeug (sterile Kochsalzlösung (0,9%), Ascorbinsäure 0,02% pH 7,4) auf das, was die 6-OHDA-lädierten Tieren erhalten, und in ein 1,0 ml sterilen Röhrchen verpackt in Alufolie, Etikett und Ort sofort auf Eis bis zum Gebrauch.

3. Einrichten des Chirurgiegerät

Chirurgische Instrumente müssen sterilisiert unter Verwendung eines Autoklaven vor t werdeno Chirurgie. Zwischen jedem Betrieb muss chirurgische Instrumente in 95% Ethanol sterilisiert werden, gefolgt durch Erhitzen auf 250 ° C für 2 Minuten. Alle Experimente müssen in Übereinstimmung mit den Richtlinien der entsprechenden Animal Care Ausschüsse des angegliederten Institution und Land durchgeführt werden.

1. Reinigen Sie alle Flächen und Geräte mit Isopropylalkohol vor dem Einrichten der Geräte. Trage sterile Handschuhe beim Umgang mit sauberen chirurgischen Einrichtungen.
2. Set-up einer Maus Erholung Käfig mit Küchenpapier auf der Basis. Unter einer Wärmelampe oder auf einem Heizkissen.
3. Richten Sie die Narkosewagen, sicherzustellen, dass die Sauerstoff-Zufluss verbunden ist und offen, und die Isofluran-Reservoir vollständig gefüllt ist. Stellen Sie die Sauerstoffzufuhr zu 1 l / min, und Isofluran auf 2-4%. Idealerweise werden zwei Ausströmöffnungen aus dem Anästhesiegerät, um den Sauerstoff Isofluran Mischung zu einer Ansaugkammer zu liefern, sowie für Wartung, während sich das Tier in den stereotaktischen Rahmen.
4. CorRect Anordnung der Infusionsvorrichtung ist entscheidend für eine erfolgreiche Läsionen, eingeschlossene Luft oder blockiert Nadeln verringert die Lautstärke von 6-OHDA an der Läsionsstelle infundiert. Montieren Sie die Infusionsvorrichtung wie in Abbildung 1 gezeigt. Themen RN ein Metall Mutter auf der einen Seite der PEEK Kapillaren (RN Kompression Kit (Fitting 1/16 inch ^th)), von der Tasse PEEK Ferrule, so ist die kanonische PFA Zwinge gefolgt. Orient die Ferrulen so daß der Kegel auf der kanonischen PFA Hülse wird in das Gegenstück der PEEK-Tasse Hülse gleiten. Platz in den kleinen Dual-Hub RN Koppler (# 1), die die Verbindung dicht ist. Am anderen Ende des dualen kleinen Hub RN Koppler legen Sie die 33 Gauge Injektionsnadel. Schrauben Sie die Kanüle durch eine der RN Metallmuttern und festziehen. Sicherstellen, dass der 33-Gauge-Nadel ist mit einer 180 °-Winkel zur Dual kleinen Hub RN Koppler (# 1). Am anderen Ende des PEEK-Schlauch, Gewinde eines der RN Metallmuttern von einem PEEK Hülse gefolgt, dann wird die Ferrule PFA. Legen Sie ein Metall-MutterND Ferrulenmontage in einen zweiten kleinen Dual-Hub RN Koppler und ziehen Sie die Verbindung. Am anderen Ende von einem zweiten kleinen Dual RN-Hub Koppler (# 2) legen Sie die Luer zu kleinen Hub RN-Adapter (Luer-Adapter), und ziehen Sie die Verbindung.
5. Als nächstes wird das Infusionsgerät muss grundiert (siehe Abbildung 1). Füllen Sie den 250 ul und 1,0 ul Hamilton Spritzen mit sterilem Wasser, wodurch es gibt keine Luftblasen. Befestigen der 250 ul Spritze mit dem Luer-Adapter und drücken den Kolben der Spritze 250 ul, so dass Wasser durch die 33 Gauge Injektionsnadel an dem anderen Ende des Schlauchs wird freigegeben. Drücken Sie weiter Wasser durch das System, während Sie den 250 ul Spritze aus der Luer-Adapter, so dass eine kleine Wasser-Wulst am Ende des Luer-Adapter. Drücken Sie den Kolben der Spritze 1,0 ul bis eine kleine Perle Wasser ausgeworfen wird. Schieben Sie das 1,0 ul Spritze in den Luer-Adapter, achten Sie darauf, dass das Wasser Wulst an der 1,0 ul Spritze mit dem Wasser verbindet Wulst vorhanden on der Luer-Adapter, und stecken Sie den vollständig 1,0 ul Spritze in den Luer-Adapter. Stellen Sie sicher, keine Blasen in dem kleinen Dual RN-Hub-Koppler.
6. Nachdem das System vorbereitet wird, kann die Perfusion der stereotaktischen Rahmen und Infusionspumpe befestigt werden. Einspannen kleinen zwei RN-Hub-Koppler mit der 33 Gauge Injektionsnadel an dem Manipulatorarm des stereotaktischen Rahmen, klemmt dann die 1,0 ul Spritze mit dem Perfusionspumpe, so daß, wenn die Perfusion Pumpe beginnt die Spritze gegen die Klammer gedrückt und kann nicht zu bewegen. Programmieren Sie die Infusionspumpe eine Infusionsgeschwindigkeit von 0,1 ml / min erlauben.

4. Einseitige 6-OHDA Läsion Chirurgie

1. Dreißig Minuten vor Operationen, wiegen jedes Tier und das Gewicht aufgezeichnet. Systemisch verabreichen Desipramin Hydrochlorid (2,5 mg / ml, Sigma Aldrich) und Pargylin-Hydrochlorid (0,5 mg / ml, Sigma Aldrich) (0,9% iger steriler Kochsalzlösung, pH 7,4) bei 10 ml / kg durch intraperitoneale (ip) Injektion mit einer Mausmit einer 27G-Nadel an einer 1 ml-Spritze. Zum Beispiel würde ein 30,0 g Maus erhalten 300 pl Prämedikation. Wärmen Sie die Heiz-Disc und legen Sie diese unter dem Ohr und Schneidezahn bar. Die Heiz-Disc wird dazu beitragen, um die Temperatur des Tieres während der Operation zu bewahren und das Tier auf idealer Höhe für das Ohr und Schneidezahn Bars der stereotaktischen Rahmen passen.
2. Fünfzehn Minuten nach der Verabreichung des Desipramin HCl und Pargylin HCl-Lösung, platzieren Sie den Mauszeiger in einer geschlossenen Kammer Anästhesie und betäuben das Tier mittels Isofluran-Inhalation (2-3% in O _2). Das Tier ist ausreichend betäubt, wenn es keine Antwort auf Hinterbein und ohne Prise Lidschlussreflex zeigt.
3. Rasieren Sie die Oberseite der Maus den Kopf, und wenden Sie das aktuelles Analgetikum Lidocain direkt auf die Haut mit Watte. Fünf Minuten nach der Anwendung Lidocain, sterilisieren Sie den Kopf des Tieres mit Betadine Lösung.
4. Platzieren Sie das Tier in einem stereotaktischen Rahmen für Mäuse angepasst. Zunächst legen Sie das Tier in den Schneidezahn Bars (Schneidezahn bar Einstellung: -3,0 bis +2,0 mm) mit dem Anästhesie-Maske über das Gesicht des Tieres gelegt. Stellen Sie die Sauerstoffzufuhr zu 1 l / min, und Isofluran 1,5-2%. Der Schneidezahn bar sollte auf einem Niveau, relativ zu den Ohrmuscheln, so dass die Oberseite des Schädels Ebene ist. Legen Sie die Ohrmuscheln (Durchmesser 5,0 mm). Die Ohrmuscheln sind korrekt, wenn der Kopf ist völlig flach eingefügt und kann nicht in beide Richtungen bewegt werden.
5. Schneiden Sie entlang der Mittellinie der Haut auf der Oberseite des Kopfes von der Maus mit einem Skalpell, und Einfahren der Haut. Trocknen Sie die Oberfläche des Schädels mit Gaze.
6. Nach unten drücken Kolben der Spritze 1,0 ul, und legen Sie die 33 Gauge Injektionsnadel in die 1-ml-Tube in Alufolie mit 6-OHDA-Lösung (15 mg / ml) bedeckt. Malen langsam zurück auf den Kolben des 1,0 ul Spritze, während die 33 Gauge Injektionsnadel in der 6-OHDA-Lösung (15 mg / ml) eingetaucht.
7. Erstellen Sie eine 1 cm lange Inzision entlang der Mittedes Schädels. Advance die Spitze der Injektionsnadel in Richtung Bregma, verzichtet eine kleine Menge an 6-OHDA-Lösung von den 33 Gauge Injektionsnadel, um eine kleine Kugel zu bilden. Langsam senken die Injektionsnadel Spitze zu Bregma, wenn der Wulst berührt Bregma Vorschieben der Spitze der Nadel zu stoppen und notieren Sie diese Koordinaten. Einfahren der Injektionsnadel 2 mm in dorsaler Richtung, und bewegen sich entlang der sagittalen Naht in einer rostralen kaudalen Richtung Lambda. Cursor um eine kleine Menge an 6-OHDA-Lösung von den 33 Gauge Injektionsnadel, um eine kleine Kugel zu bilden. Langsam senken die Injektionsnadel Spitze zu Lambda, wenn der Wulst Kontakte Lambda Vorschieben der Spitze der Nadel zu stoppen und notieren Sie diese Koordinaten. Die mediale laterale (ML) und dorsal ventral (DV)-Koordinaten identisch sein sollte für Bregma und Lambda, wenn sie sich nicht, stellen Sie die Schneidezahn bar entsprechend für den AP-Koordinaten, und das Ohr Bars für den ML-Koordinaten. Bewegen Sie die Nadel, um koordiniert AP: -1,2 mm, ML: -1,1 mm relativ zur Bregma nach dem Maus-Brain Atlas der stereotaktischen Koordinaten ^25. Ziehen Sie die Nadel, und Burr ein Loch in den Schädel mit einem 25-Gauge-Nadel.
8. Bringen Sie die Injektionsnadel auf die obige Koordinaten, und führen Sie die Nadel auf DV:-5mm. Die Infusion 0,2 ul von 6-OHDA oder Vehikel einseitig in die mittlere Vorderhirnbündel mit einer Geschwindigkeit von 0,1 ml / min (3 ug insgesamt). Nach Abschluss der Verabreichung von 6-OHDA oder Fahrzeug, lassen Sie die Nadel an Ort und Stelle für weitere fünf Minuten, um die Diffusion zu ermöglichen weg von der Injektionsstelle.
9. Langsam zurückziehen der Nadel.
10. Schließen Sie den Schnitt auf die Kopfhaut mit drei Fäden, und liefern 1 ml Ringer-Lactat-Lösung subkutan (sc).
11. Entfernen Sie das Tier von stereotaktischen Rahmen, und in stabile Käfig, bis das Bewußtsein wiedererlangt.

5. Post-operative Betreuung der 6-OHDA-lädierten Tieren

1. Ort Tiere in Käfigen (3 Mäuse / Käfig) und erlauben den freien Zugang zu Nahrung und sugared Wasser (10 mM). Geben Nutra-Gel-und KMR (Kätzchen Milch Ersatz) in Lebensmitteln Container auf dem Boden des Käfigs, um den Appetit anzuregen und die gastrointestinale Motilität.
2. Untersuchen Mäuse täglich nach der Operation für 2 Wochen ^24. Bei jeder Inspektion sollte besonderes Augenmerk auf die Wachsamkeit des Tieres durch die Bewertung der Fähigkeit des Tieres, um rund um den Käfig zu bewegen bezahlt werden. Futter-und Wasseraufnahme aus der letzten Beobachtungsperiode, sowie das Vorhandensein und die Kohärenz der fäkal Angelegenheit sollte auch beachtet werden. Eine häufige postoperative Komplikation ist die Austrocknung dies ist offenkundig, durch langsames Zurückziehen der Haut nach Haut Prise. Wenn dies beobachtet wird, liefern 1 ml Ringer-Lactat-Lösung sc für 1 Woche oder bis die Symptome verbessern. Im Falle der männlichen Tiere, sollten die Genitalien sorgfältig für Penis Prolaps durch Rötung des Penis identifiziert beobachtet. In diesem Fall gelten mucol Gel auf den Penis des betroffenen Tieres, und liefern 1 ml Ringer-Lactat-Lösung sc für 1 Wocheoder, bis die Symptome verbessern.
3. Wiegen Tiere täglich auf Veränderungen des Körpergewichts zu überwachen.
4. In dem Fall, wo die ip-Injektion hat einen kleinen Riss in der Magen-Darm-System verursacht, kann abdominale Infektion führen. Daher wird für die prsence von Infektionen des Unterleibs, offensichtlich durch geschwollene aufgeblähten Bauch zu beurteilen. Gönnen durch die Gabe von Baytril im Tafelwasser für 3-4 Tage oder bis die Symptome verbessern.

6. Parkinson-Beurteilung

Um das Ausmaß der Läsion abzuschätzen, wurde Verhaltensbewertung durchgeführt 14-21 Tage nach 6-OHDA-Läsion Operation, wenn die Menge an Dopaminverarmung maximale und stabile ²⁶ ist.

1. Nach ip Injektion von 0,01 ml / g 0,9% iger steriler Kochsalzlösung, aufzeichnen Ort Mäuse in Glaszylinder (11 cm x 9,5 cm) und ihre Aktivität über eine Videokamera (CG9, Sanyo).
2. Gerade das Video, zählen die Anzahl der vollständigen 360 °-Drehungen sowohl im ipsiversive und contrav gemachtersive Richtung relativ zu der Läsion.
3. Je größer die Neigung zur ipsiversive Drehungen, desto Parkinson das Tier, so Berechnung des Anteils der ipsiversive Drehungen als Prozentsatz des Netzes (contraversiver und ipsiversive) Drehverhalten.

7. Bestimmung der striatalen Dopamin-Gehalt durch HPLC

1. Mindestens 21 Tage nach dem 6-OHDA Läsion Chirurgie, und nach Abschluss der Verhaltensstudien, opfern die Mäuse durch Über-Dosis von Anästhesie, und entfernen Sie vorsichtig das Gehirn. Bewahren Sie eine Scheibe Striatum (230 um) aus jeder Hemisphäre in jeder Maus an und rasten Sie frieren sofort nach dem Schneiden und Lagern bei -80 ° C bis Vorbereitung der Striatum-Proben.
2. Die HPLC-Probenpuffer (0,1 M PCA mit 2 mM Glutathion) verhindert, dass der Dopamin aus den Proben von striatalen Abbau extrahiert.
   Für 100 ml Probenpuffer:
   = 100 ml HPLC H ₂ O
   = 0,862 ml PCA (70%) (Sigma)
   = 61,5 mg Glutathion (reduziert)
   Messen Sie die HPLC-Qualität H ₂ O, fügen Sie die PCA, lösen sich die Glutathion in der Lösung, gut und Filter zu mischen. Der Probenpuffer bei 4 ° C für bis zu 1 Monat gelagert werden.
3. Auftauen striatalen Scheiben auf dem Eis, dann in 200 ul Probenpuffer mit einem Ultraschall-Zelle Disruptor (Fisher Sonic, USA) zu homogenisieren. Die Proben auf Eis zu allen Zeiten und Homogenisieren jeder Probe dreimal für jeweils 10 Sekunden sicherzustellen, dass die Proben dürfen abkühlen zwischen Homogenisierung Zeiträume.
4. Nehmen Sie sich 20 ul jeder homogenisierten Probe (Lagerung bei -80 ° C) für ein Protein Assay.
5. Zentrifugieren Sie die Proben (20.800 xg, 20 min (4 ° C, Eppendorf 58 - 04R, USA)), entfernen Sie dann die überstehende und durch ein 0,2 um PVDF-Membran (Pall, Kat. Nr.: 1935-28143-310) und frieren bei -80 ° C bis HPLC-Analyse. Bewahren Sie die Proteinpellet als Back-up für die Protein-Assay.
6. Herstellung der mobilen Phase HPLC ausgeführt through die HPLC-Säule.
   Für 1 l Laufmittel:
   60 mM NaH ₂ PO _4. H ₂ O (monobasisch) = 8,27 g
   30 mM Zitronensäure = 5,7 g
   0,13 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Dinatriumsalz dehydratisieren = 48 mg
   0,16 mM Natriumdodecylsulfat (SDS) = 45 mg
   850 ml HPLC-Wasser (Caledon, Kat. Nr.: 8801-7)
   15% v / v Acetonitril-190 (pH 3,35) = 150 ml HPLC (Caledon, Kat. Nr.: 1401-7)
   ~ 2 ul 10 M NaOH (in HPLC-H2O)
   Alle Reagenzien sollten ≥ 99,0% rein und von HPLC-Qualität, wo immer möglich. Das Wasser und Acetonitril HPLC-Qualität muss sein. Mobile Phase muss innerhalb einer Woche nach der Zubereitung verwendet werden. Haben gewidmet, saubere Gläser und rühren Bars ausschließlich für die Herstellung von mobilen Phase (a 1 L Glas-Messzylinder und mindestens 2 1 L Glaskolben). Vor der Herstellung der mobilen Phase haben zwei saubere 1 l Kolben hergestellt, bis man die Lösung in ein und machen es zu übertragen, während der Filtration und degassing. Lassen Sie die mobile Phase durch die HPLC über Nacht zirkulieren zu lassen und prüfen, ob die Grundlinie flach ist vor dem Gebrauch.
7. Messen Sie 700 ml HPLC-Wasser in ein Glas-Messzylinder und die Auflösung der NaH ₂ PO _4. H ₂ O, Citronensäure, EDTA und SDS in ihm. Füllen Sie das Wasser auf 850 ml.
8. PH-Wert auf 3,35 mit 10 M NaOH, fügen Sie dann die Acetonitril und mischen Sie die Lösung mit dem teflonbeschichteten Rührstäbchen.
9. Setzen Sie einen Rührstab in der zweiten sauber, leer 1 L Kolben und Nutsche die mobile Phase in sie durch eine 0,22 um HVLP Millipore-Filter: (Cat #: SLGP033RS). Befeuchten Sie den Filter in 85:15 H ₂ O / ACN vor der Filtration. Sobald die mobile vollständig filtriert, die mobile Phase entgast durch Rühren unter Vakuum für mindestens 10 min.
10. Bereiten Sie die Maßstäbe, an denen die Dopamin-Konzentration der striatalen Proben gemessen werden. Standards werden durch die HPLC zu Beginn und am Ende jeder Gruppe von striatalen Proben getestet. A 1mg / ml Stammlösung von Dopamin kann im Voraus gebucht werden und in 20 ul Aliquots bei -80 ° C Zur Herstellung der Stammlösung aufzulösen 5 mg Dopamin in 5 ml Probenpuffer (siehe oben) und mischen Sie es gründlich. Vorbereiten, indem sie die Standards 5 ul 1 mg / ml Stammlösung, Zugabe zu 2,5 ml Probenpuffer und Mischen Sie es gründlich, um eine 2 pg / ml Dopamin-Lösung zu erhalten.
11. Vier Standards werden durch die HPLC-Lauf, um eine Konzentration Kurve zu erzeugen. Für Dopamin die Konzentrationen: 100 ng / ml, 50 ng / ml, 25 ng / ml und 12,5 ng / ml. Zur Erzeugung von vier Konzentrationen von Dopamin nehmen 10 ul der 2 pg / ml Dopamin-Lösung in 7,10 vorbereitet). und fügen Sie es zu 190 ul Probe Puffer, um Ihnen eine 100 ng / ml Dopamin-Lösung. Im Anschluss an diese auszuführen eine 1:1 Verdünnung von dem 100 ng / ml Lösung mit Dopamin-Probenpuffer. Nehmen Sie einfach 100 ul 100 ng / ml Dopamin und fügen Sie 100 ul Probenpuffer zugeben und zu 50 ng / ml Dopamin produzieren, dann nehmen Sie 100ul 50 ng / ml Dopamin und fügen Sie 100 ul Probenpuffer zugeben und zu 25 ng / ml Dopamin und so weiter zu produzieren.
12. Um das HPLC-System, (Waters 1525μ Binäre Pumpe, 717plus Autosampler, Symmetry C-18-Reverse-Phase-Säule (15 cm x 4,6 mm ID, 5 &mgr; m Partikelgröße) (30 ° C), elektrochemischen Detektor (ESA Coulochem III) ausgestattet vorbereiten mit einem Dual-Elektrode analytischen Zelle (ESA 5011A) und durch Breeze-Software (Waters)) eine erste Spülung des Systems mit der mobilen Phase durch die die Säuberung Protokoll in der Computer-Software oder durch das Befolgen der Anweisungen des Herstellers. Dieses tauscht alle bisherigen Lösung in das HPLC-System mit frischen mobilen Phase.
13. Stellen Sie die elektrochemische Potentiale bei 400 mV und -300 mV für die ersten und zweiten Elektroden sind. Danach äquilibrieren dem System, indem es mindestens 2 Stunden und am besten über Nacht mit der mobilen Phase bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min. Während die Zellen Äquilibrierung sollte eingeschaltet werden und die Basislinie wiederading überwacht, wenn die Messwerte stabil das System bereit ist, verwendet werden. In der ersten Stunde des Gleichgewichts lassen, dass die mobile Phase verlässt das System in einen Behälter waster gehen, nach diesem können Sie erlauben die mobile Phase durch das HPLC-System, indem Sie den Ablaufschlauch in die mobile Phase Kolben zurückzuführen.
14. Auftauen striatalen Proben auf Eis, dann spritzen 20 ul jeder Dopamin-Standard, der von 2 x 20 ul jeder Probe und weitere 20 ul jeder Dopamin-Standard in das HPLC-System ins Gleichgewicht mit der Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase bei 1 ml / min.
15. Mit dem HPLC-System-Software, um den Bereich der Dopamin-Peaks von den Standards und Proben entstehen, zu analysieren. Vergleichen der Fläche der Dopamin-Signale, die in den Proben der striatalen Dopamin-Konzentration Standard-Kurve der Menge an Dopamin in 20 ul jeder striatalen Probe zu identifizieren. Skalieren Sie diese Zahl bis zum Gesamtbetrag Dopamin in der gesamten striatalen Scheibe zu finden.
16. Perform eine Standard-Protein-Assay auf dem 20 ul striatalen Homogenat, dass Sie beiseite legen in 7,4). Dieser misst die Menge des Proteins in den Proben Striatum in mg / ml. Daraus berechnen die Menge an Dopamin im Striatum der Proben als Wert in ng / mg in dem Sie Dopamin-Konzentrationen zwischen Hemisphären und zwischen Mäusen zu vergleichen.

8. Repräsentative Ergebnisse

Fünfzehn bis 21 Tage nach 6-OHDA-Läsion Operation, wenn die Menge des Zelltods durch das Neurotoxin verursacht hat completion26 erreicht, Messung von spontanen 360 ° Drehungen nach der Verabreichung von Kochsalzlösung (ip) ²⁸ verwendet, um den Erfolg von 6 zu beurteilen -OHDA-Läsion (Abb. 2). Diese Methode der Verhaltens-Beurteilung ist einfach und schnell, und vermeidet mögliche Priming-Effekte durch dopaminerge Substanzen wie Amphetamin oder Apomorphin Herausforderungen verursacht. Darüber hinaus ist spontane Drehung Einschätzung ein besseres Prädikatctor der Tiere mit <95% Dopaminverarmung zu Vordergliedmaße Pfote Einstufungstest ²⁷ verglichen. Durch die Korrelation Dopamintransporters Stufen von striatalen Proben (hergestellt nach Abschluss des Verhaltens Studien unter Verwendung von HPLC) mit prozentuale spontane ipsiversive Drehungen in jedem Tier, haben wir gefunden, dass Tiere, die 70% oder mehr Drehungen ipsiversive Richtung der 6-OHDA Läsion aufweisen verloren> 95% striatalen Dopamin (Abbildung 3) ^27. Im Anschluss an Teil-6-OHDA-induzierten Läsionen (59,44 ± 17,20) (Abbildung 3) der mediale Vorderhirnbündel, gab es keine Drehvorspannung zwischen ipsiversive gegen contraversiver Seiten bei der Messung von spontanen Drehungen (40,91 ± 8,01) (Abbildung 2). Somit wird, wie nach 6-OHDA Verabreichung an den MFB bei Ratten wurde gefunden, es möglich ist, einen schweren Verlust von dopaminergen Neuronen nigrostriatalen und Kochsalzlösung Verabreichung führen (ip) ist ein genaues Verfahren zum Screenen der Menge von 6-OHDA Läsion bei diesen Tieren.

1. Schematische Darstellung der Montage der Injektionsnadel Vorrichtung zum 6-OHDA-Läsion Operationen zeigen.

Abbildung 2. Beurteilung der Drehverhalten in Sham-und 6-OHDA lädierten Mäusen. Spontane Drehungen in Sham-und 6-OHDA-lädierten Mäusen. Die Daten sind als mittlere prozentuale ipsiversive Drehungen ± SEM, wobei Netto contraversiver und ipsiversive Drehungen zu 100% angegeben. Offene Balken: Sham-Tieren; Graue Balken: 6-OHDA-lädierten Tieren mit> 95% Verlust Dopamin; Schwarze Balken: Tiere, die 6-OHDA-Läsion Chirurgie, die teilweise lädierten wurden unterzog. *** P <0,001 im Vergleich zu schein-operierten Tieren. One-way ANOVA gefolgt von mehreren Vergleich Dunns Test (s Schinken-betriebenen: n = 17; 6-OHDA-Läsion (> 95%): n = 23; teilweise 6-OHDA-Läsion: n = 3).

Abbildung 3. Beurteilung der striatalen Dopamin-Spiegel in Sham-und 6-OHDA lädierten Mäusen mittels HPLC. Striatalen Dopamin-Gehalt wurde in der operierten und nicht operierten Hemisphäre von Schein-und 6-OHDA-lädierten Tieren ermittelt. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM Prozentsatz der striatalen Dopamin-Spiegel im Striatum unbetätigt vorgestellt. Offene Balken: Sham-Tieren; Graue Balken: 6-OHDA-lädierten Tieren mit> 95% Verlust Dopamin; Schwarze Balken: Tiere, die 6-OHDA-Läsion Chirurgie, die teilweise lädierten wurden unterzog. *** P <0,001, ** P <0,01 bis Sham-Tieren verglichen. One-way ANOVA gefolgt von mehreren Vergleich Dunn-Test (Sham-: n = 17, 6-OHDA-Läsion (> 95%): n = 23, teilweise 6-OHDA-Läsion: n = 3).

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Abbildung 4. Beurteilung der Tyrosin-Hydroxylase-Immunreaktivität in der SNC in Sham-und 6-OHDA lädierten Mäusen. Als Marker für die Dopamin-Zell-Verlust in der Substantia nigra pars compacta (SNC), Verlust der Tyrosin-Hydroxylase (TH) positive immunohistochemisty in der operierten und nicht operierten Hemisphäre von Schein-und 6-OHDA-lädierten Tieren wurde bestimmt, wie in Thiele et al. Im Druck. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM Anteil von TH positiven Zellen im Striatum unbetätigt dargestellt. Offene Balken: Sham-Tieren; Graue Balken: 6-OHDA-lädierten Tieren mit> 95% Verlust Dopamin; Schwarze Balken: Tiere, die 6-OHDA-Läsion Chirurgie, die teilweise lädierten wurden unterzog. *** P <0,001, ** P <0,01 bis Sham-Tieren verglichen. One-way ANOVA gefolgt von mehreren Unternehmen DunnsGleich-Test (Sham-: n = 17, 6-OHDA-Läsion (> 95%): n = 23, teilweise 6-OHDA-Läsion: n = 3).

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung eines stabilen einseitigen 6-OHDA-Läsion Maus-Modell der Parkinson-Krankheit, die extrem reproduzierbar, mit einer hohen Erfolgsrate Läsion und eine geringe Sterblichkeit ist. Der Erfolg von 6-OHDA Läsion Operation kann leicht durch die Messung von spontanen Drehverhalten werden mit> 70% ipsiversive Umdrehungen anzeigt> 95% Dopaminverarmung im Striatum Läsion ²⁷ veranschlagt. Die Quantifizierung der striatalen Dopamin-Spiegel ist die genaueste Mess...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Desipramin HCl	Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Kanada	D125	25mg/kg
Pargylin HCl	Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Kanada	P8013	5mg/kg
6-OHDA HBr	Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Kanada	H116	3 mg / Maus
Stereotaktischen Rahmen	Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	Modell 900
Maus Ohrmuscheln	Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	Modell 921 Zygoma Ohrenpolster
Maus Schneidezahn bar	Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	Modell 923B
Maus Narkosemaske	Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	Modell 923B
Priming-Kit (enthält 250ml Spritze)	Hamilton Company, Reno, NV, USA	PRMKIT 81120
RN Klemmverschraubung Kit (1 mm)	Hamilton Company, Reno, NV, USA	55750-01
PEEK Kapillaren aus RN Klemmverschraubung Kit< (1/16 Th Zoll)	Hamilton Company, Reno, NV, USA	55751-01
Dual kleinen Hub RN-Koppler	Hamilton Company, Reno, NV, USA	55752-01
Luer zu kleinen Hub RN-Adapter	Hamilton Company, Reno, NV, USA	55753-01
1ml Spritze Modell 25S 7001KH	Hamilton Company, Reno, NV, USA	80100
* 33G mit austauschbarer Nadel (RN) 6er Pack. . Custom 1 Zoll mit 45 <° Fase	Hamilton Company, Reno, NV, USA	7803-05
Scheren	Fine Science Tools, Vancouver, BC, Kanada.	14084-08
Skalpell	Fine Science Tools, Vancouver, BC, Kanada	10003-12
Skalpellklingen	Fine Science Tools, Vancouver, BC, Kanada	10035-20
Forcep	Fine Science Tools, Vancouver, BC, Kanada	11608-15
Hämostyptika	Fine Science Tools, Vancouver, BC, Kanada.	13004-14
Isofluran	Abt	02241315	2-3%
Suters (Vicryl 4,0)	Syneture	SS-683
Sterilisator	Fine Science Tools, Vancouver, BC, Kanada	18000-45
Infusionspumpe	Harvard Apparatus	PhD 22/2000
Nadeln (27G)	Becton Dickinson	305109
Nadeln (25G)	Becton Dickinson	305127
Spritzen (1 ml)	BD Spritze	309692
Anästhesie Trolley	LEI medizinische	M2000
Baytril	CDMV, St. Hyacinthe, QC	102207
Lidocain	CDMV, St. Hyacinthe, QC	3914
Betadine Lösung	CDMV, St. Hyacinthe, QC	19955