Transnasale Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen aus humanen Mikrogliazellen in das Gehirn der Maus

Zusammenfassung

Quelle: Parajuli, B., et.al. Transplantation von humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Mikroglia in immunkompetente Mäusegehirne über einen nicht-invasiven transnasalen Weg. J. Vis. Exp. (2022).

Dieses Video zeigt die transnasale Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSMG) in ein Mausgehirn. Hyaluronidase wird auf die Nasenlöcher einer Maus mit Mikroglia-Depletion aufgetragen, um die Durchlässigkeit zu erhöhen. Die iPSMG-Suspension wird intranasal verabreicht und die Maus kann sich erholen. Wachstumsfaktor-reiche Medien werden regelmäßig verabreicht, um das Überleben von iPSMG im Hirngewebe zu unterstützen.

Protokoll

Alle Verfahren, bei denen Tiermodelle zum Einsatz kommen, wurden von der örtlichen institutionellen Tierpflegekommission und der tierärztlichen Prüfstelle der JoVE überprüft.

1. Vorbereitung des Zellmediums, des Transplantationsmediums und der Anästhesiemischung

1. Bereiten Sie das Zellmedium vor, indem Sie 10 % fötales Rinderserum und 0,1 % Penicillin/Streptomycin in das modifizierte Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco geben.
2. Bereiten Sie das Transplantationsmedium vor, indem Sie dem Zellmedium den humanen koloniestimulierenden Faktor 1 oder hCSF1 (250 ng/ml) und den humanen transformierenden Wachstumsfaktor beta 1 oder hTGF-β1 (100 ng/ml) zugeben.
3. Bereiten Sie die Anästhesiemischung für die intraperitoneale Injektion vor, indem Sie 0,45 ml Medetomidinhydrochlorid, 1,2 ml Midazolam und 1,5 ml Butorphanoltartrat in 11,8 ml normaler Kochsalzlösung mischen.

2. Aufbereitung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus humanen Mikroglia (iPSMG)

HINWEIS: Gefrorene iPSMG (Table of Materials) wurden bis zur Verwendung bei -80 °C aufbewahrt.

1. Tauen Sie die gefrorenen Zellen zügig in einem 37 °C warmen Wasserbad auf. Schwenken Sie die Proben, bis das gesamte sichtbare Eis geschmolzen ist.
2. Geben Sie die aufgetauten induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen humanen Mikroglia (iPSMG) in das auf 37 °C erwärmte Kulturmedium. Geben Sie 1 ml aufgetaute Zellen, die Medium enthalten (1 × 10⁶ Zellen), zu 10 ml des Kulturmediums.
3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min, um ein Zellpellet zu erhalten.
4. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den gesamten Überstand, ohne das Küvettenpellet zu stören. Eine vollständige Entfernung des Überstands ist wünschenswert, um die Verdünnung der Zytokinkonzentration im Transplantationsmedium zu verringern.
5. Fügen Sie das Transplantationsmedium hinzu, um eine Zellkonzentration von 1 x 10⁵ Zellen/μl zu erhalten.
6. Legen Sie das iPSMG auf Eis und fahren Sie sofort mit der Transplantation fort.
   HINWEIS: Die Vorbereitung von iPSMG für die Transplantation erfolgt auf einer Reinbank, um eine Kontamination zu vermeiden.

3. Vorbereitung der Maus für die transnasale Transplantation (Tsn)

1. Füttern Sie die männlichen Wildtyp-Mäuse (C57BL/6J, 8 Wochen alt) 7 Tage lang mit einer PLX5622-haltigen Nahrung.
2. Am Ende des 7. Tages beenden Sie die PLX-Diät und füttern Sie die Mäuse bis zum Ende der Studie mit normaler Nahrung.
   HINWEIS: PLX5622 enthaltende Diät wird durch Zugabe von 1,2 g PLX5622 in 1 kg AIN-93G hergestellt (Materialtabelle).

4. Transnasale Transplantation von Zellen

1. 24 h nach Beendigung der PLX-Fütterung, Wiegen Sie die Mäuse und betäuben Sie sie mit einer intraperitonealen Injektion der Anästhesiemischung (0,2 mL/20 g).
2. Nachdem die Mäuse vollständig anästhesiert wurden, gemessen an der Unempfindlichkeit auf den Pedalentzugsreflex (festes Zehenklemmen), verabreichen Sie 2,5 μl Hyaluronidase in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (100 U/ml), 1 h vor der transnasalen Transplantation von iPSMG zweimal in jedes Nasenloch mit einer 10-μl-Pipettenspitze, um die Durchlässigkeit der Nasenschleimhaut zu erhöhen.
3. Setzen Sie die Mäuse nach der Anwendung von Hyaluronidase in Rückenlage.
4. Wiederholen Sie Schritt 4.2 10 min vor der transnasalen Transplantation von iPSMG.
5. Tragen Sie 2,5 μl Zellsuspension mit einer 10-μl-Pipettenspitze in ein Nasenloch der Maus auf.
6. Platzieren Sie die Maus 5 Minuten lang in Rückenlage, bevor Sie die Zellsuspension an das andere Nasenloch verabreichen.
7. Die Schritte 4.5 und 4.6 werden viermal mit einem Gesamtvolumen von 20 μl pro Tier wiederholt
.
8. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein 37 °C heißes Heizkissen, bis sie sich von der Narkose erholt hat.
9. 48 Stunden nach Beendigung der PLX-Fütterung wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.7 erneut an denselben Mäusen.
   HINWEIS: Es ist zu beachten, dass iPSMG-Zellen während der Transplantation auf Eis gelegt werden.

5. Applikation von Zytokinen

1. Anästhesie: Anästhesieren Sie die Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion einer Anästhesiemischung (0,2 ml/20 g).
2. Tragen Sie 2,5 μl des Transplantationsmediums mit einer 10-μl-Pipettenspitze in ein Nasenloch der Maus auf.
3. Platzieren Sie die Maus 5 Minuten lang in Rückenlage, bevor Sie das Transplantationsmedium in das andere Nasenloch verabreichen.
4. Wiederholen Sie die Schritte 5.2 und 5.3 viermal mit einem Gesamtvolumen von 20 μl pro Tier.
   HINWEIS: Es ist zu beachten, dass eine transnasale Verabreichung von Transplantationsmedium (humane Zytokine) alle 12 Stunden erforderlich ist, um die Lebensfähigkeit der transplantierten iPSMG bis zum Ende der Studie

zu gewährleisten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	10566
AIN 93G	Orientalische Hefe Co
Fötales Rinderserum	GE Healthcare Life Sciences	SH30070.03
Gefrorenes iPSMG	Shionogi & Co., Ltd		Labor für Arzneimittelforschung und Krankheitsforschung
Menschlicher Kolonie-stimulierender Faktor 1 (hCSF1)	PeproTech	300-25
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H-3506
Medetomidinhydrochlorid	Meiji Seika	VETLI5
Midazolam	Astellas	18005A2
Paraformaldehyd	Wako Pure Chemical Industries	162-16065
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Pipette	Eppendorf	3120000011
Pipettenspitze	Eppendorf	30076028
PLX5622	Amadis Chemical	A930097
Transforming Growth Factor-β1 (Tgf-b1)	PeproTech	100-21