Organotypischen Kulturen von embryonalen ventralen Mittelhirn: Ein System zur Dopaminerge Neuronale Development Study In-vitro-</em

Zusammenfassung

Eine Methode zur organotypischen Slices aus dem E12.5 murinen embryonalen Mittelhirns zu erzeugen, ist beschrieben. Die organotypischen Kulturen verwendet, um das Verhalten von dopaminergen Neuronen oder anderen ventralen Mittelhirn Nervenzellen zu beobachten.

Zusammenfassung

Die Maus ist ein ausgezeichnetes Modell Organismus von Säugetieren die Entwicklung des Gehirns aufgrund der Fülle von molekularen und genetischen Daten zu studieren. Allerdings ist die Entwicklung von Gehirn der Maus nicht für einfache Handhabung und Bildgebung in vivo geeignet, da die Maus-Embryo ist unzugänglich und undurchsichtig. Organotypischen Kulturen von embryonalen Gehirne sind daher häufig verwendet, um murine die Entwicklung des Gehirns in-vitro-Studie. Ex-vivo Manipulation oder die Verwendung von transgenen Mäusen ermöglicht die Änderung der Genexpression, so dass Subpopulationen von Neuronen oder Gliazellen mit fluoreszierenden Proteinen markiert werden können. Das Verhalten der markierten Zellen können dann beobachtet, wenn Zeitraffer-Bildgebung werden. Zeitraffer-Bildgebung hat sich besonders zur Untersuchung von Zell Verhaltensweisen, die die Entwicklung der Hirnrinde am späten embryonalen Stadien ^1-2 zugrunde liegen. Embryonale organotypischen Kultur-Systemen im Gehirn Regionen außerhalb des Vorderhirns sind weniger gut established. Daher ist der Reichtum der Zeitraffer-Imaging-Daten zur Beschreibung neuronaler Zellmigration auf das Vorderhirn ^3,4 beschränkt. Es ist noch nicht bekannt, ob die Grundsätze für die dorsale Gehirn entdeckt wahr halten ventralen Hirnbereiche. In der ventralen Gehirn sind Nervenzellen in neuronalen Clustern statt Schichten organisiert und sie haben oft zu kompliziert wandernde Bahnen zu unterziehen, um ihre endgültige Position zu erreichen. Die ventralen Mittelhirn ist nicht nur ein gutes Modell für ventrale Entwicklung des Gehirns, sondern enthält auch neuronale Populationen wie dopaminergen Neuronen, die relevant sind in Krankheitsprozesse. Während die Funktion und die Degeneration von dopaminergen Neuronen ist sehr detailliert in das erwachsene und alternde Gehirn untersucht worden, ist nur wenig über das Verhalten dieser Neuronen während ihrer Differenzierung und Migration Phase ⁵ bekannt. Wir beschreiben hier die Generation der Scheibe Kulturen aus dem embryonalen Tag (E) 12,5 Maus ventralen Mittelhirn. Diese Scheibe Kultnahmen sind potentiell geeignet für die Überwachung der dopaminergen Neuronen Entwicklung über mehrere Tage in vitro. Wir beleuchten die wichtigsten Schritte bei der Erzeugung von Hirnschnitten in diesen frühen Stadien der embryonalen Entwicklung und besprechen die notwendigen Voraussetzungen für die Aufrechterhaltung der normalen Entwicklung von dopaminergen Neuronen in vitro. Wir präsentieren auch Ergebnisse aus Zeitreihen Imaging Experimente. In diesen Experimenten wurden ventralen Mittelhirn Vorstufen (einschließlich dopaminerge Vorstufen) und ihre Nachkommen in einem Mosaik Weise unter Verwendung eines Cre / loxP Basis induzierbaren Schicksal Mapping-System ⁶ gekennzeichnet.

Protokoll

Teile dieses Protokolls werden von Daza et al modifiziert., 2007 ^7.

1. Die Vorbereitungen

1. Kann vorbereitet 1 Tag im Voraus
   1. Bereiten 1X Krebs-Puffer (1,5 L): 126 mm NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH ₂ PO _4: H ₂ O, 1,2 mM MgCl _2, 2,5 mM CaCl _2, 11 mM Glukose, 25 mM NaHCO _3, pH-Wert auf 7,4. Filter sterilisieren (0,22 um Porengröße) und lagern bei 4 ° C.
   2. Bereiten Sie das Kulturmedium (20 ml): 5 ml HBSS, 9 ml DMEM high glucose, 850 ul von 30% Glucose, 5 ml Pferdeserum (25%). Geben Sie 200 ul 100X Penicllin / Streptomycin. Lagerung bei 4 ° C.
2. Bereiten Sie vor Beginn der Dissektion
   1. Es werden 100 ml 4% niedrig schmelzender Agarose (LMP Agarose) in 1X Krebs-Puffer: Mikrowelle die Lösung, bis die Agarose vollständig gelöst ist und dann die Agarose in einem 45 ° C Wasserbad.
   2. Füllen Sie die Schwingungentome Pufferwanne mit eiskaltem 1X Krebs-Puffer und starten Sie das Kühlelement (halten bei 4 ° C). Fix einer Rasierklinge in den Messerträger und Set-up der Vibratom mit einem Skalpell, einem feinen Pinsel und eine Mini-perforierten Löffel zu holen die Scheiben. Bereiten Sie sterile Petrischalen (35 x 10 mm) mit 1x Krebs-Puffer zum Auffangen der Scheiben. Keep on ice.
   3. Set-up der Dissektion mit sterilen Petrischalen (100 x 15 mm) für die Präparation und kleinere sterile Petrischalen (35 x 10 mm) für die Einbettung, eine kleine Schere, zwei feinen Pinzetten (Dumont 5), ein Mini-perforierten Löffel, ein Glas Pasteurpipette Feuer mit einem runden polierten geschlossene Spitze und 1 L 1X Krebs-Puffer auf Eis. Wischen Sie alle Dissektion Werkzeuge mit 70% Ethanol.
   4. Add Kulturmedium in die Vertiefungen eines Sechs-Well-Platte (1,5 ml / well) und legen Sie sie in einem 37 ° C Inkubator.
   5. Bereiten Sie einen Sechs-Well-Platte mit 1,5 ml / well sterile 1X Krebs-Puffer und 15 ul Penicilin / Streptomycin (100X) / well. Unter sterilen Bedingungen statt Millicell Cell Culture Inserts in die Vertiefungen. Setzen Sie den Sechs-Well-Platte neben dem Vibratom so dass das Gehirn Scheiben auf den Filter-Membranen können sofort nach Schneiden übertragen werden.

2. Dissection und Einbettung von embryonalen Gehirnen

1. Anesthetize eine schwangere Frau Maus mit Isofluran und Opfer der Maus durch Genickbruch (Embryonen im Stadium E12.5 werden). Dissect aus der Gebärmutter der Maus durch Hochziehen der Gebärmutter mit einer Pinzette. Verwenden Sie andere Zange die Mesometrium weg getrennt von der Gebärmutter. Legen Sie die Gebärmutter in eiskaltem 1X Krebs-Puffer. Verwenden einer feinen Pinzette, um die muskuläre Wand der Gebärmutter, Reichert-Membran und die viszerale Dottersack aus dem Embryo zu trennen. Entfernen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter. Setzen Sie den sezierten Embryonen in einem separaten Petrischale mit sterilem 1X Krebs-Puffer.
2. Dissect das Gehirn unter einem Stereomikroskop. Um das Gehirn zu sezieren, zuerst den Kopf abzuschneiden des Embryos. Befestigen Sie den Kopfdurch Einstechen feiner Pinzette durch den Kopf (Augenhöhe). Verwenden Sie eine andere Zange zu entfernen Sie vorsichtig die Haut und Schädel. Verwenden einer Pinzette vorsichtig heben das Gehirn aus und übertragen sie in eine Petrischale mit einem sterilen 1X Krebs-Puffer. Es ist sehr wichtig, dass die Integrität des gesamten Gehirns bei der Präparation wird beibehalten, da Schäden an Hirngewebe wird Probleme (z. B. Gewebe Schreddern) während des Schneidens auf der Vibratom erstellen.
3. Waschen Sie den Kopf einmal in 4% niedriger Schmelzpunkt (LMP) Agarose. Embed 2-3 Gehirne in einer Zeit, in frischer 4% LMP-Agarose. Legen Sie die Einbettung Gerichte auf Eis so gleichmäßig wie möglich. Verwenden Sie eine Pasteurpipette mit einem feuerpolierte runde Spitze auf das Gehirn anheben, bis der Boden der Agarose verfestigt. Die Gehirne sollten in einer flachen Position horizontal auf dem Boden des Agaroseblock begleichen.
4. Nach der Agarose vollständig verfestigt hat (nach ca. 3 min), schneiden Sie die Agarose rund um das Gehirn und kleben Sie die Agarose Block auf den Objekttischder Vibratom. Beim Kleben der Blöcke, stellen Sie sicher, dass die Bauchseite des Gehirns parallel zu der Plattform ist, da das Gehirn in einer horizontalen Schnittebene geschnitten werden sollte.

3. Vibratom sectioning

1. Verwenden Sie eine Rasierklinge zum Schneiden. Um intakte Scheiben ist es sehr wichtig, um die Temperatur um 4 ° C zu halten während des Schneidens.
2. § 300 um dicke horizontale Scheiben mit einer Frequenz von 50 Hz, Klinge Amplitude von 1,1 mm und einer Geschwindigkeit von 25 mm / sec.
3. Verwenden Sie den feinen Pinsel, um die Scheibe in eine Mini-perforierten Löffel schieben den Hirnschnitten sammeln und übertragen Sie sie in eine Schale mit sterilem eiskaltem 1X Krebs-Puffer. Wählen Sie das Slice, das ventrale Mittelhirn Gewebe enthält (siehe Abbildung 1). In einem E12.5 Maushirn gibt es nur eine 300 um horizontale Scheibe, die ventralen Mittelhirn Gewebe enthält, einschließlich dopaminergen Neuronen.

4. Slice-Kultur

Steps 4,2-4,5 sind unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.

1. Übertragen Sie die Hirnschnitten auf eine Millicell Zellkultur Membran Insert in einem Sechs-Well-Platte mit 1x Krebs-Puffer (siehe Punkt 1.2.5). Zur Übertragung der Scheibe mit dem Mini-Schaumlöffel (Fine Science Tools) und einem feinen Pinsel. Bis zu 3 Scheiben können auf einer Membran platziert werden.
2. Übertragen Sie die Membran mit der Scheibe zu den Sechs-Well-Platte mit Kulturmedium (siehe Punkt 1.2.5). Der obere Teil der Membran sollte nicht durch Mittel bedeckt sein. Das Gehirn erhält Scheibe Medium von unten und in der Luft von oben.
3. Setzen Sie den Sechs-Well-Platte in einem Inkubator mit 5% CO ₂ bei 37 ° C. Es ist sehr wichtig, dass die Scheiben in den Inkubator sind innerhalb von 2 Stunden nach dem ersten Schritt der Präparation gelegt. Eine längere Vorbereitungszeit kann in schlechten Überlebensraten der Scheiben führen.
4. Slices können in vitro bis zu 3 Tage aufrechterhalten werden. Ändern Sie 50% des Kulturmediums am ^2. Tag.

5. Zeitraffer-Imaging

1. Lassen Sie die Scheiben in den Inkubator wieder für 4-5 Stunden vor Beginn der Zeitraffer-Bildgebung.
2. Für Zeitraffer-Imaging, halten Sie die Scheiben auf die Membran eingefügt und übertragen Sie die Einlage in ein 35 mm ibidi μ-Dish (der Boden der Schale besteht aus Material mit hoher optischer Qualität).
3. 1 ml Kulturmedium plus 1,5 ul Ascorbinsäure (200 mM) in die Schale. Ascorbinsäure schützt die Scheiben gegen Phototoxizität.
4. Inkubieren Scheiben in einer Klimakammer bei 37 ° C mit 5% CO2 bei Zeitraffer-Bildgebung.

6. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1 illustriert die Herstellung von organotypischen Kulturen von E12.5 Maus Gehirn. Abbildung 2 zeigt die horizontale organotypischen Slices (akuten und nach einigen Tagen in Kultur) erhalten Form E12.5 Gehirn der Maus. Zum Vergleich, gefroren Hirnschnitten bei den entsprechenden Entwicklungsstufengezeigt werden. Mittelhirn dopaminergen Neuronen visualisiert mit Immunhistochemie für Tyrosin-Hydroxylase (TH). Mittelhirn dopaminergen Neuronen Projekt, um Ziele im Vorderhirn. Diese Projektionen beginnen am E12.5 Form und erstrecken sich in Richtung Vorderhirn während der folgenden Tage. Wir betrachten die Entwicklung des Vorderhirns Projektionen als ein guter Indikator für die normale Entwicklung von dopaminergen Neuronen in Kultur. In der horizontalen Scheiben Mittelhirn dopaminergen Neuronen zu erweitern Projektionen auf ihre ordnungsgemäße Vorderhirn Zielgebiet. Nach 3 DIV (days in vitro) oder wenn das Vorderhirn Zielgebiete sind beschädigt, aberrante Projektionen in Richtung der dorsalen Mittelhirn zu verlängern. Beispiele für koronare Scheiben E12.5 Mittelhirn sind in Abbildung 3 dargestellt. Dopaminergen Neuronen visualisiert mit Immunfärbung für TH verlängern aberrante Projektionen zum dorsalen Mittelhirn. Abbildung 4 zeigt eine Analyse der proliferierenden, nekrotischen und apoptotischen Zellen in der organotypischen Kulturen. BrdU immunostaining zu proliferierenden Zellen visualisieren zeigt, dass Zellen unter Kulturbedingungen vermehren nach 1 DIV. Proliferation ist nach 4 DIV reduziert. Nach 3 DIV, durchlaufen viele Zellen im ventralen Mittelhirn Nekrose (Propidiumiodid-Färbung) und apotosis (Immunfärbung für gespaltene Caspase-3). Abbildung 5 zeigt Zugwege YFP-markierten Neuronen in einem Zeitraffer-Imaging-Experiments in einer akuten Scheibe überwacht .

Abbildung 1. Schematische Darstellung der Herstellung von organotypischen Kulturen. 300 um horizontale Hirnschnitten werden durch Schneiden ein E12.5 Gehirn mit einem Vibratom vorbereitet. (A) Schematische sagittale Ansicht eines E12.5 Gehirn der Maus. Levels von Abschnitten angegeben sind. Das Gebiet mit dopaminergen Neuronen in rosa dargestellt ist, sind Projektionen in blau angegeben. (B) Schematische Darstellung der drei Scheiben, die von dorsal nach ventral erhalten werden können und that enthalten sowohl Vorderhirn (Fb) und Mittelhirn (Mb). Beachten Sie, dass nur eine Scheibe dopaminergen Neuronen (slice b) enthält. Die entsprechenden Scheibe kann auf der Grundlage der Position der Kammern und die Kontinuität des Mittelhirns und Vorderhirns Gewebe (Pfeile, vgl. Abschnitt b § a und c) identifiziert werden. Das Gebiet mit dopaminergen Neuronen in rosa angezeigt wird, ist der Bereich mit dopaminergen Vorstufen in grüne, blaue Pfeile dargestellt zeigen die Entwicklung Projektionen. (C) Die Scheibe enthält dopaminergen Neuronen auf Membran-Einsätze kultiviert. Abkürzungen: VMB, ventralen Mittelhirn, DMB, dorsalen Mittelhirn; Hyp, Hypothalamus, Hb, Hinterhirn.

Abbildung 2. Projektionen des Mittelhirns dopaminergen Neuronen in organotypischen Kulturen sind abhängig von der Integrität des Vorderhirns. Immunhistochemie für Tyrosin-Hydroxylase (TH) zu dopaminergen Neuronen Etikett. (A) Akute slice (0 DIV)zeigt die normale Lage der dopaminergen Neuronen im ventralen Mittelhirn. Der weiße Pfeil zeigt das Gebiet, das in höherer Vergrößerung im Einschub gezeigt wird. Projektionen auf das Vorderhirn noch nicht entwickelt. Nach 1 DIV, starten Projektionen zum Vorderhirn zu bilden. Projektionen erstrecken sich in das Vorderhirn bei 2-3 DIV. Weiße Pfeile zeigen die Position der Zellkörper in höherer Vergrößerung in den Einschüben (weißer Rahmen) angezeigt. Gelbe Pfeile markieren den normalen Projektionen in intakten Scheiben in höherer Vergrößerung in den Einschüben (gelber Rahmen) dargestellt. Aberrant Projektionen entwickeln in Scheiben mit beschädigtem Vorderhirn. Rote Pfeile zeigen die aberrante Projektionen zum dorsalen Mittelhirn in höherer Vergrößerung in den Einschüben (roter Rahmen) dargestellt. Der Schaden wird mit roten Sternchen gekennzeichnet. Nach 3 DIV, die meisten Scheiben (n = 7.5) hatte aberrante Projektionen in Richtung der dorsalen Mittelhirn. (B) TH Immunfärbung auf horizontalen eingefroren Hirnschnitten in verschiedenen Entwicklungsstadien zeigen die Entwicklungdopaminerger Projektionen in vivo. Weiße Pfeile zeigen die Position der Zellkörper in höherer Vergrößerung in den Einschüben (weißer Rahmen) angezeigt. Gelbe Pfeile markieren die Position der Projektionen in hoher Vergrößerung in den Einschüben (gelber Rahmen) dargestellt. Die Höhe der Gefrierschnitte wurde gewählt, um genau das Niveau der organotypischen Kulturen. Beachten Sie, dass eine einzige Gefrierschnitten (12 um) repräsentiert nicht die gesamte organotypischen (300 um). Deshalb waren die Prognosen bei E13.5 und E14.5 gezeigt auf § § 120 um mehr ventral als der Abschnitt mit dem Zellkörper (gelb Sternchen) beobachtet.

Abbildung 3. Mittelhirn koronalen Schnitt Kulturen für Tyrosin-Hydroxylase (TH) als Marker für dopaminerge Neuronen gefärbt. (AC) Scheiben nach 1, 2 oder 3 DIV. Dopaminergen Neuronen entwickeln aberrante Projektionen in Richtung der dorsalen Mittelhirn (red Pfeile). Pfeilspitzen zeigen die Lage der dopaminergen Zellkörper.

Abbildung 4. Zellproliferation und Zellvitalität in Mittelhirn organotypischen Kulturen. (A) Proliferierende Zellen wurden durch die Zugabe von BrdU (50 ng / mL, Sigma) in das Kulturmedium für 18 h beschriftet Scheiben wurden anschließend für BrdU immungefärbt. Nach 1 DIV sind BrdU-markierte Zellen in der ventrikulären Zonen (rote Pfeile) entfernt. Nach 4 DIV, sind proliferierenden Zellen mehr zerstreut und eine ausgeprägte ventrikuläre Zone wird nicht mehr gepflegt. (B) nekrotische Zellen wurden durch Zugabe von Propidiumiodid (1μg/μL, Sigma) in das Kulturmedium für 2 Stunden markiert und mit Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Nach 1 DIV ist der ventralen Mittelhirn (VMB) nicht nekrotisch, aber viele Propidiumjodid markierten Zellen können in der dorsalen Mittelhirn und Vorderhirn zu sehen. Nach 3 DIV die Lebensfähigkeit der Zellen verringert sich in der ventralen midbrain. Maßstabsbalken: 500 pm (C) Immunostaing für gespaltene Caspase-3 um apoptotische Zellen sichtbar zu machen. Auf 1 oder 2 DIV, sind nur wenige dopaminergen Neuronen (TH) apoptotisch. Nach 3 DIV, starten dopaminergen Neuronen zur Apoptose. Panels in der Mitte und auf der rechten Seite sind höhere Vergrößerungen der eingerahmten Bereich in der linken Panels. Die höheren Vergrößerungen Bilder sind Maximum Intensity Projections der z-Stacks von 14-16 Frames. Die Bilder wurden alle 0,5 mu m mit einem Zeiss Apotome Set-up übernommen.

Abbildung 5. Zugweg von YFP-markierten Neuronen in einer akuten Scheibe. (A) Horizontal-Slice für Zeitraffer-Aufnahme von YFP-markierten Neuronen verwendet. Die Scheibe wurde für 5 Stunden vor der Bildgebung inkubiert. Die Zellen wurden beschriftet mit einem induzierbaren Cre / loxP-System ^6. Shh ^Creer Mäusen ⁸ und ROSA ^{loxP-STOP-loxP-EYFP} Reporter Mäusen ^{9 haben} wirre eingesetzt. Die Rekombination der ROSA-Reporter-Allels (und EYFP Ausdruck) ist in Zellen induziert, die ausdrückliche Creer (Shh-exprimierenden Zellen), aber nur bei Verabreichung von Tamoxifen (Sigma). In diesem Beispiel wurde Tamoxifen (3 mg/40 g Körpergewicht) an trächtige Mäuse an E8.5 verwaltet. Dieser experimentelle Aufbau resultiert in erster Linie in der Etikettierung von Vorstufen von dopaminergen Neuronen und ihre Nachkommen in der ventralen Mittelhirn ^10,11. Maßstab: 500 um. (B) Auf den Spuren der Zugweg von YFP-markierten Neuronen in einer akuten Scheibe. Zeitraffer-Bilder von YFP-markierten Schicksal abgebildet Neuronen wurden alle 30 min für eine Gesamtzeit von 5 Stunden und 30 min auf einem Zeiss Axio Observer-Mikroskop (Objektiv EC PlnN 10x / 0,3) erworben. Scheiben wurden in einer Klimakammer (Inkubator XLS1 Pecon) bei 37 ° C bebrütet und geliefert mit 5% CO ₂ während der Bildgebung. Die Ausgangslage der Zellen ist mit roten Pfeilen markiert, Migration Positionen sind mit roten Sternchen gekennzeichnet.

Diskussion

Die organotypischen Kultur hier vorgestellte Methode stellt ein System für die kurzfristige In-vitro-Analyse der Entwicklung von dopaminergen Neuronen und ihre Migrations-und Projektions-Strecken in der embryonalen ventralen Mittelhirn. Wir fanden, dass es eine Reihe von kritischen Schritte in das Protokoll, das sorgfältig gepflegt werden sollte, um Scheiben, die die normale Entwicklung des ventralen Mittelhirn dopaminergen Neuronen ermöglichen zu erhalten. Der wichtigste Schritt ist die Zerlegung des embryonal...

Materialien

Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
Glucose 30%	Sigma-Aldrich	G7528-250
Pferdeserum	Invitrogen	26050-088
DMEM (4,5 g / L Glc., Mit L-Gln, Na Pyr, NaHCO3)	Sigma-Aldrich	D6429-500
Penicillin / Streptomycin 100x	Sigma-Aldrich	P4333-20
L-Ascorbinsäure	Sigma-Aldrich	A4403	Vorbereitung 200mM Lager und bei -20 ° C
UltraPure LMP-Agarose	Invitrogen	15517-022
Millicel Einsätze	Millipore	PICMORG50
μ-Dish 35 mm, niedrige	Ibidi	80136
Vibratom	Microm	HM 650V
Rasierklinge	Plano GmbH	121-6
Histoacryl Kleber	BRAU9381104	Braun Aesculap
Perforierte Löffel Dia Durchmesser 15 mm	Feine Science Tools	10370 -18
Pinzetten 5 Dumoxel	Feine Science Tools	11252 bis 30

Name des Antikörpers	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Rabbit anti-Tyrosin-Hydroxylase	Millipore	AB152	Verdünnung 1:500
Maus anti-Tyrosin-Hydroxylase	Millipore	MAB318	Verdünnung 1:500
Maus anti-BrdU	BD Pharmingen	555627	Verdünnung 1:200
Kaninchen-anti-Caspase-3 gespalten	Cell Signaling Technology	9661	Verdünnung 1:200
Donkey anti-Kaninchen-IgG-Alexa 488	Invitrogen	A21206	Verdünnung 1:500
Donkey anti-Maus-IgG-Cy3	Jackson ImmunoResearch	715-165-150	Verdünnung 1:200