Methodenartikel

Cellular Lipidextraktion für Targeted Stable Isotope Dilution Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Analyse

DOI:

10.3791/3399

⸱

17. November 2011

 ,  , 
1Centers for Cancer Pharmacology and Excellence in Environmental Toxicology, University of Pennsylvania , 2Department of Pharmacology, University of Pennsylvania

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll demonstriert die Extraktion und Analyse von freien und veresterten bioaktiven Fettsäuren aus Zellen. Fettsäuren werden mittels stabiler Isotopenverdünnung, chiraler Flüssigkeitschromatographie und Elektroneneinfang der atmosphärischen chemischen Ionisation, Mehrfachreaktionsüberwachung, Massenspektrometrie (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS) genau quantifiziert.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Stoffwechsel von Fettsäuren, wie Arachidonsäure (AA) und Linolsäure (LA), führt zur Bildung oxidierter bioaktiver Lipide, einschließlich zahlreicher Stereoisomere1,2. Diese Metaboliten können aus freien oder veresterten Fettsäuren gebildet werden. Viele dieser oxidierten Metaboliten haben eine biologische Aktivität und wurden mit verschiedenen Krankheiten wie Herz-Kreislauf- und neurodegenerativen Erkrankungen, Asthma und Krebs in Verbindung gebracht3-7. Oxidierte bioaktive Lipide können enzymatisch oder durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) gebildet werden. Zu den Enzymen, die Fettsäuren metabolisieren, gehören Cyclooxygenase (COX), Lipoxygenase (LO) und Cytochrome P450 (CYPs)1,8. Der enzymatische Metabolismus führt zur enantioselektiven Bildung, während die ROS-Oxidation zur racemischen Bildung von Produkten führt.

Obwohl sich dieses Protokoll hauptsächlich auf die Analyse von AA- und einigen LA-abgeleiteten bioaktiven Metaboliten konzentriert, könnte es leicht auf Metaboliten anderer Fettsäuren angewendet werden. Bioaktive Lipide werden aus Zelllysat oder -medien mittels Flüssig-Flüssig-Extraktion (l-l) extrahiert. Zu Beginn des l-l-Extraktionsprozesses werden interne Standards für stabile Isotope hinzugefügt, um Fehler bei der Probenvorbereitung zu berücksichtigen. Die Verdünnung stabiler Isotope (SID) berücksichtigt auch alle Unterschiede, wie z. B. die Ionensuppression, die Metaboliten während der Massenspektrometrie (MS)-Analyse erfahren können9. Nach der Extraktion wird eine Derivatisierung mit einem Elektroneneinfangreagenz (EC), Pentafluorylbenzylbromid (PFB), eingesetzt, um die Nachweisempfindlichkeitzu erhöhen 10,11. Das Multiple Reaction Monitoring (MRM) wird eingesetzt, um die Selektivität der MS-Analyse zu erhöhen. Vor der MS-Analyse werden die Lipide mittels chiraler Normalphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) getrennt. Die HPLC-Bedingungen sind so optimiert, dass die Enantiomere und verschiedene Stereoisomere der überwachten Lipide getrenntwerden 12. Diese spezifische LC-MS-Methode überwacht Prostaglandine (PGs), Isoprostane (isoPs), Hydroxyeicosatetraensäuren (HETEs), Hydroxyoctadecadiensäuren (HODEs), Oxoeicosatetraensäuren (oxoETEs) und Oxooctadecadiensäuren (oxoODEs); Die HPLC- und MS-Parameter können jedoch so optimiert werden, dass sie beliebige Fettsäuremetaboliten einbeziehen13.

Die meisten der derzeit verfügbaren bioanalytischen Methoden berücksichtigen nicht die getrennte Quantifizierung von Enantiomeren. Dies ist äußerst wichtig, wenn man ableiten kann, ob die Metaboliten enzymatisch oder durch ROS gebildet wurden oder nicht. Darüber hinaus können die Verhältnisse der Enantiomere Hinweise auf einen spezifischen enzymatischen Bildungsweg liefern. Die Verwendung von SID ermöglicht eine genaue Quantifizierung der Metaboliten und berücksichtigt eventuelle Probenverluste während der Präparation sowie die Unterschiede während der Ionisation. Die Verwendung des PFB-Elektroneneinfangreagenzes erhöht die Empfindlichkeit der Detektion um zwei Größenordnungen im Vergleich zu herkömmlichen APCI-Methoden. Insgesamt ist diese Methode, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, eine der empfindlichsten, selektivsten und genauesten Methoden zur Quantifizierung von bioaktiven Lipiden.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Standard- und interne Standardmischungen

  1. Vor der Lipidextraktion muss man eine Standardmischung (SM) und eine interne Standardmischung (ISM) herstellen. Für die SM aliquotiert das äquivalente Volumen von 1 μg jedes Standards (insgesamt 25), das in der nachstehenden Reagenzientabelle aufgeführt ist, unter Verwendung einer kalibrierten Spritze in einen 10-ml-Messkolben. Die Standards werden unter Stickstoff getrocknet und in 10 ml Acetonitril (ACN) rekonstituiert. Die Endkonzentration der Standardmischung beträgt 100 pg/μl. In 1 mL Aliquot aufteilen und bis zur Verwendung bei -80 °C lagern.
  2. Aus dieser Standardmischung können 6 Standardverdünnungen für insgesamt 7 Kalibrierstandards (1 pg/μL, 2 pg/μL, 5 pg/μL, 10 pg/μL, 20 pg/μL, 50 pg/μL und 100 pg/μL) hergestellt werden. Diese Standards sind mit jeder Probencharge durchzuführen, die vorbereitet wurde, um die Kalibrierkurve zu entwickeln, die in der quantitativen Analyse verwendet wird.
  3. Für die ISM aliquotieren Sie das äquivalente Volumen von 1 μg jedes IS (14 insgesamt), das in der nachstehenden Reagenzientabelle aufgeführt ist, unter Verwendung einer kalibrierten Spritze in einen 10-ml-Messkolben und trocknen Sie es unter Stickstoff ab. Rekonstituieren Sie das ISM in 10 mL ACN und teilen Sie es in 1 mL Aliquote. Die Endkonzentration des ISM sollte 100 pg/μL betragen. Es ist genug ISM vorhanden, um 1000 Proben zu verarbeiten.
  4. Lagern Sie SM und ISM bei -80 °C.

2. Sammlung von Medien und Zelllysat

  1. Für jede 10 cm große Platte mit adhärenten Zellen (~ 1 x 107) werden 3 ml Medium in einem 10-ml-Glaszentrifugenröhrchen gesammelt. Als nächstes waschen Sie die Zellen 2 Mal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Geben Sie 1 ml PBS in die Platte, kratzen Sie die Zellen von der Platte ab und pipettieren Sie sie in ein zweites 10-ml-Glaszentrifugenröhrchen. Zu diesem Zeitpunkt können Zellen und Medien gespeichert werden, wenn der Vorgang zu diesem Zeitpunkt nicht fortgesetzt wird. Lagern Sie die Proben für die Langzeitlagerung bei -80 °C oder weniger als eine Woche bei -20 °C.

3. Extraktion von Lipiden aus Medien

  1. Freie bioaktive Lipide befinden sich in den Zellmedien und lassen sich mit einem einstufigen l-l-Extraktionsverfahren leicht extrahieren. Zu den gesammelten Medien (2.1) werden 10 μl ISM zugegeben. Zu diesem Zeitpunkt sollten 8 weitere 10-ml-Glaszentrifugenröhrchen für die Kalibrierstandards mit #0-7 gekennzeichnet werden. Geben Sie 3 mL PBS in jedes dieser Röhrchen und geben Sie dann 10 μl des entsprechenden SM in die Röhrchen 1-7 (1-7 von 1,1).
  2. Lassen Sie das ISM in jedem Kalibrierstandard und jeder Probe 10 Minuten lang äquilibrieren und fügen Sie dann 5 mL Diethylether hinzu. Die Proben und Kalibrierstandards werden dann bei niedriger Geschwindigkeit für 30 Minuten bei Raumtemperatur in den Schüttler gegeben.
  3. Nach dem Schütteln werden alle Kalibrierstandards und Proben 10 Minuten lang bei 1935 x g zentrifugiert. Anschließend wird die obere Phase (organisch) mit einer Pasteurpipette in ein neues 10-ml-Glaszentrifugenröhrchen überführt und unter Stickstoff getrocknet.

4. Extraktion von Lipiden aus Zelllysat

  1. Die Zellproben werden in den Glaszentrifugenröhrchen bei 1935 X g 5 Minuten lang heruntergeschleudert. Entsorgen Sie den Überstand; Geben Sie 2 ml PBS in jedes Röhrchen und wirbeln Sie es kurz auf. Entnehmen Sie 25 μl der Probe für die Proteinquantifizierung. Das Gesamtprotein wird für die Normalisierung des Zelllysats verwendet.
  2. Übertragen Sie anschließend die Hälfte des Lysat/PBS-Gemisches in ein separates 10-ml-Glaszentrifugenröhrchen. Fügen Sie jeder Probe weitere 2 mL PBS zusammen mit 10 μl ISM hinzu. Befolgen Sie den für Medien in 3.2 und 3.3 beschriebenen l-l-Extraktionsprozess. Dieses Aliquot wird verwendet, um freie Lipide in den Zellen zu messen und einen alkalischen Abbau von Lipiden, wie z.B. den Prostaglandinen, zu vermeiden. Dieses Aliquot wird den unten beschriebenen Schritten 4.3 und 4.4 nicht unterzogen.
  3. Der erste Schritt des Extraktionsprozesses für verestertes Lipid l-l erfordert die Zugabe von 5 mL CHCl3/MeOH (2:1) zu jeder der Proben. Die Proben werden in einem Shaker bei niedriger Geschwindigkeit für 30 Minuten eingestellt. Nach dem Schütteln werden die Proben bei 1935 x g für 10 Minuten zentrifugiert. Anschließend übertragen Sie mit einer Pasteurpipette die untere (organische) Schicht der l-l-Extraktion in ein neues 10-ml-Glaszentrifugenröhrchen und trocknen die Probe unter Stickstoff.
  4. Veresterte Lipide müssen vor der Quantifizierung verseift werden. Sobald die Proben trocken sind, geben Sie 0,5 mL 0,4 N KOH in 80 % MeOH in jedes Röhrchen. Die Proben werden dann 1 h lang bei 60°C inkubiert. Fügen Sie nach der Inkubation 2 ml PBS hinzu. Stellen Sie den pH-Wert mit konzentrierter HCl-Säure (~30 μL) auf 6 ein. Geben Sie 10 μl ISM zu jeder Probe. Der Rest des Verfahrens ist der gleiche wie bei der Lipidextraktion aus Medien und kann in 3.2 und 3.3 nachvollzogen werden.
  5. Werden diese Extraktionen gleichzeitig mit den Medienproben durchgeführt, können die gleichen Kalibrierstandards zur Erstellung einer Kalibrierkurve verwendet werden; werden diese Proben jedoch zu einem anderen Zeitpunkt durchgeführt, müssen auch die Kalibrierstandards wie in 3.1-3.3 beschrieben verarbeitet werden.

5. Derivatisierung von Pentafluorylbenzylbromid (PFB)

  1. Zu den getrockneten Proben und Kalibrierstandards werden 100 μl wasserfreies Dichlormethan (CH2Cl2) gegeben, gefolgt von 100 μl 20 % (v/v) N,N-Diisopropylethylamin in wasserfreiem CH2Cl2 und schließlich 100 μl 20 % (v/v) PFB in wasserfreiem CH2Cl2.
  2. Nach der Zugabe von Derivatisierungsreagenzien werden die Proben vortexed, 1 h bei 60°C inkubiert und unter Stickstoff getrocknet. Die Proben und Kalibrierstandards können bei -80 °C gelagert werden, wenn sie nicht sofort analysiert werden, oder bei -20 °C für bis zu einer Woche.

6. Analyse der stabilen Isotopenverdünnung Chirale Flüssigkeitschromatographie Elektroneneinfang Atmosphärendruck Chemische Ionisations-Massenspektrometrie (SID-LC-ECAPCI-MS)

  1. Die getrockneten Proben und Kalibrierstandards werden in 100 μl Hexan/Ethanol (97:3) rekonstituiert. Die gesamte Probe kann dann in das HPLC-Fläschchen mit Insert überführt werden. Geben Sie die Proben in den gekühlten Autosampler (4 °C) und erstellen Sie eine Probenliste für die Analyse.
  2. Richten Sie als Nächstes die HPLC- und MS-Methoden mit den in Tabelle 1 und Tabelle 2 beschriebenen Parametern ein. Tabelle 3 enthält spezifische Informationen zu Verbindungen, einschließlich der MRM-Übergangs- und Kollisionsenergie (CE) für jedes Lipid sowie der geschätzten Retentionszeit aus der Waters 2695/Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra-Analyse. Die CE wird bestimmt, indem jedes einzelne Lipid während der Methodenentwicklung abgestimmt wird.
  3. Für die normale Phasentrennung wird eine auf 30°C beheizte Chiralpak AD-H Säule (4,6 x 250 mm, 5 μ) verwendet. Die mobile Ausgangsphase besteht zu 98 % aus Hexan und zu 2 % aus Methanol/Isopropanol (1:1). Nach der HPLC-Trennung wird Methanol nach der Säule (0,75 mL/min) zugegeben, um eine Ablagerung auf der Corona-Nadel zu vermeiden, die zu einer Abnahme der Empfindlichkeit führen würde. Der MS wird mit Hilfe der APCI-Quelle in den negativen Ionenmodus versetzt. Wenn die Quelle von ESI auf APCI umgestellt werden muss, stellen Sie sicher, dass Sie eine Corona-Nadel einführen.
  4. Die erste Probe, die ausgeführt werden sollte, ist immer ein Hexanrohling. Dadurch wird die Säule ausgeglichen und es wird auch festgestellt, ob sich auf der Säule Verunreinigungen befinden, die den Kalibrierstandard und die Probenanalyse beeinträchtigen könnten.
  5. Der nächste Probenlauf sollte die Kalibrierstandardproben in der Reihenfolge 0-7 sein (Erhöhung der SM-Konzentration). Diese Standards werden verwendet, um eine Kalibrierkurve zu erstellen, die das Verhältnis von Standardfläche/IS-Fläche auf der y-Achse und Standardkonzentration bzw. -masse auf der x-Achse enthält. Aus der aus diesem Diagramm abgeleiteten Gleichung y = mx + b kann das Verhältnis von Probenfläche/IS-Fläche (y) verwendet werden, um die Menge oder Konzentration (x) der Probe (unbekannt) zu bestimmen.
  6. Die Menge an bioaktiven Lipiden, die in den Medien gefunden wird, kann auf das Gesamtvolumen der Medien normiert werden, und die Menge an Lipiden, die im Zelllysat gefunden wird, kann entweder auf die Gesamtzahl der Zellen/Platte oder auf die Menge des Gesamtproteins/der Platte normalisiert werden. Während des Abschnitts 4.1 des Protokolls sollten Maßnahmen ergriffen werden, um sicherzustellen, dass die Zellen gezählt oder das Protein quantifiziert wird.

7. Repräsentative Ergebnisse:

Die Chromatogramme in Abbildung 1 sind repräsentativ für ein gezieltes Lipidomik-Profil. Das erste Bild (Abbildung 1A) zeigt 13- und 9-HODE zusammen mit dem entsprechenden 13- und 9-OxoODE, das von Linolsäure abgeleitet ist. Darüber hinaus ist 15-OxoETE, der oxidierte Metabolit von 15-HETE, im zweiten Panel ebenfalls dargestellt. Die unteren beiden Felder zeigen 20-HETE und das 20-HETE-IS, [2H6]-20-HETE. Abbildung 1B zeigt die Trennung und die eindeutigen Übergänge, die für die HETE-Stereoisomere bestimmt wurden und aus der enzymatischen Oxidation von AA oder durch ROS resultieren. Abbildung 1C ist eine Darstellung von PGs, isoPs und LTB4. Für einige der Standards ist kein deuteriertes IS im Handel erhältlich; Daher wird ein IS verwendet, der in der Retentionszeit ähnlich ist, zur Quantifizierung. Zum Beispiel wird [2H8]-12(S)-HETE verwendet, um 11-HETE- und 8-HETE-Spezies zusätzlich zu 12(R)-HETE und 12(S)-HETE zu quantifizieren.

Aus den repräsentativen Chromatogrammen geht hervor, dass es eine kleine Verschiebung in der Retention des deuterierten IS im Vergleich zum unmarkierten Standard gibt. Diese Verschiebung zu einer späteren Retentionszeit ist ein Ergebnis der Deuterium-Wechselwirkung mit der Normalphasensäule. Deuterium ist polarer als Wasserstoff; Daher kommt es zu einer stärkeren Wechselwirkung mit der Normalphase der Säule. Wenn diese Trennung mit einer umgekehrten Phasensäule stattfinden würde, würde die Verschiebung zu einer früheren Retentionszeit erfolgen, da eine polarere Einheit eine schwächere Wechselwirkung mit der umgekehrten Phase hätte.

figure-protocol-1
Abbildung 1. Diese Abbildung ist ein repräsentatives Beispiel für eine gezielte Lipidomik-Analyse. Abbildung 1A zeigt die Gesamtionenchromatogramme (TIC) für mehrere oxidierte LA- und AA-Metaboliten, darunter 13-OxoODE und 9-OxoODE im ersten Feld, 15-OxoETE im zweiten Feld, 13-HODE und 9-HODE (Felder 3 und 5) und 20-HETE (Feld 7). Die HODEs und 20-HETE haben einen entsprechenden deuterierten IS im Panel darunter (4, 6 und 8). Die TICs in Abbildung 2B zeigen die Trennung und die einzigartigen Übergänge der von AA abgeleiteten HETE-Stereoisomere. Abbildung 2C zeigt eine Darstellung von PGs, isoPs und LTs. Die Kollisionsenergie (CE), die MRM-Übergänge und die Retentionszeit (RT, min) wurden mit einem Waters 2695 LC optimiert, der mit einem Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra gekoppelt ist, und sind in Tabelle 3 für jede Verbindung aufgeführt.

kg kg
Zeit (min)% A% B
098arabische Ziffer
398arabische Ziffer
1196,43,6
Nr. 15928
27928
30Nr. 50Nr. 50
38Nr. 50Nr. 50
3998arabische Ziffer
4598arabische Ziffer

Tabelle 1. HPLC-Gradientenbedingungen für die chirale Normalphasen-Lipidomik-Trennung. Lösungsmittel A besteht zu 100 % aus Hexanen und Lösungsmittel B aus Methanol/Isopropanol (1:1).

Parameter der MassenspektrometrieEinstellung
QuelleAPCI
ModusNegatives Ion
Länge der Methodeca. 40 Minuten
MRM-Scan-Breite0,002 m/z
MRM-Scan-Zeit0,15 Sek.
MRM Peak Breite0,70 FWHM
Tubus-Linse164 V
Quelle CID10 eV
Q2 Kollisionsgas1,5 Stück
Temperatur des Verdampfers450°C
Kapillar-Temperatur250°C
Entladestrom0 μA
Mantel Gasdruck25 Stück
Ionen-Sweep-Druck3 Stück
Hilfsgasdruck5 Stück

Tabelle 2. Oben aufgeführt sind die optimierten massenspektrometrischen Parameter für die Messung von bioaktiven Lipiden. Diese Parameter wurden von einem Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra übernommen.

kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg
VerbindungÜbergangCE (eV)RT (min)
13-OxoODE293,03 → 113,10219,9
9-OxoODE293,03 → 113,102117,9
15-OxoETE317.05 → 113.18188,1
13(R)-HODE295,03 → 195,121812,5
13(S)-HODE295,03 → 195,121814,8
[2H4]-13(S)-HODE299,03 → 198,121814,9
9(R)-HODE295,03 → 171,101813,7
9(S)-HODE295,03 → 171,101821,2
[2H4]-9(S)-HODE299,03 → 172,121821,2
20-HETE319.03 → 289.101812,4
[2H6]-20-HETE325.03 → 295.101812,4
5(R)-HETE319.04 → 115.041615,7
5(S)-HETE319.04 → 115.041616,2
[2H8]-5(S)-HETE327.04 → 116.041616,4
12(R)-HETE319.04 → 179.111411,7
12(S)-HETE319.04 → 179.111412.3
[2H8]-12(S)-HETE327.13 → 184.111412,5
15(R)-HETE319.04 → 219.121312,4
15(S)-HETE319.04 → 219.121315,9
[2H8]-15(S)-HETE327.03 → 226.121316.1
11(R)-HETE319.04 → 167.111611.1
11(S)-HETE319.04 → 167.111612,5
8(R)-HETE319.04 → 155.091611,7
8(S)-HETE319.04 → 155.091612,6
LTB4335,03 → 195,101832,0
[2H4]-LTB4339,03 → 197,101832,0
PGE2351,03 → 271,151831,2
[2H4]-PGE2355,03 → 275,151831,2
PID2351,03 → 271,152532,5
[2H4]-PID2355,03 → 275,152532,5
8-iso-PGE2351,03 → 271,151837,4
11β-PGF2353,03 → 193,112527,6
[2H4]-11β-PGF2357,03 → 197,112527,6
PGF2α353,03 → 193,112533,1
[2H4]-PGF2α357,03 → 197,112533,1
8-Iso-PGF2α353,03 → 193,112534,4
[2H4]-8-iso-PGF 2α357,03 → 197,112534,4

Tabelle 3. In dieser Tabelle sind die Verbindungen aufgeführt, die in den Gesamtionenchromatogrammen in Abbildung 1A-C nachgewiesen wurden. Die zweite Spalte enthält den für MRM/MS verwendeten Übergang, die dritte Spalte die Kollisionsenergie (CE, eV) und die letzte Spalte die Verweilzeit (RT, min). Die Parameter wurden mit einem Waters 2695 Trennmodul optimiert, das mit einem Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra gekoppelt war.

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die in diesem Protokoll verwendeten Standards und internen Standards stellen eine Darstellung einer zielgerichteten Lipidomik-Methode dar. Für die LC-MS-Analyse wurden ein Waters 2695 Trennmodul und ein Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra verwendet, die optimalen Parametereinstellungen sind in den Tabellen 1 und 2 zu finden. Darüber hinaus wurde dieses Extraktionsprotokoll für adhärente Zellen entwickelt, kann aber auch für andere Zelltypen sowie andere biologische Matrizen wie Urin, Blut un...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die meisten derzeit verfügbaren bioanalytischen Methoden zur Messung bioaktiver Lipide sind nicht so umfangreich, da sie keine chirale Normalphasenchromatographie oder SID beinhalten. Die chirale Normalphasen-LC ist entscheidend für die Trennung von Enantiomeren und für die Unterscheidung zwischen Enzym- und ROS-vermitteltem Metabolismus. Die Verwendung von SID stellt sicher, dass menschliches Versagen oder Komplikationen, die bei der Extraktion oder Analyse auftreten, bei der Quantifizierung berücksichtigt werden. Diese zusätzlichen Komponenten machen sie zusammen mit ECAPCI-MRM zur empfindlichsten und selektivsten Methode für die Analyse bioaktiver Lipide.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
5-Oxo-6E,,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic-6,8,9,11,12,14,15-d7säure Cayman Chemical334250[2H7]-5-ox–TE Interner Standard
5S-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 säureCayman Chemical334230[2H8]-5(S)-HETE Interner Standard
12S-Hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoic-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 SäureCayman Chemical334570[2H8]-12(S)-HETE Interner Standard
15S-hydroxy-5Z,8Z,11Z,13E-eicosatetraenoic-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 säureCayman Chemical334720[2H8]-15(S)-HETE Interner Standard
20-hydroxy-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic-16,16,17,17,18,18-d6 säureCayman Chemical390030[2H6]-20-HETE Interner Standard
9S-hydroxy-10E,12Z-octadecadienoic-9,10,12,13-d4 säureCayman Chemical338410[2H4]-9(S)-HODE Interner Standard
13S-hydroxy-9Z,11E-octadecadieno-9,10,12,13-d4 säureCayman Chemical338610[2H4]-13(S)-HODE Internal Standard
9α,11α,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,18,18,19,19,20,20,20-d4 säureCayman Chemical316010[2H4]-PGF2α Interner Standard
9α,11α,15S-trihydroxy-(8β)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 acidCayman Chemical316350[2H4]-8-iso-PGF2a Internal Standard
9α,11β.,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 acidCayman Chemical10008989[2H4]-11β-PGF2 Interne Norm
9α,15S-dihydroxy-11-oxo-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 SäureCayman Chemical312010[2H4]-PGD2 Interner Standard
9-oxo-11α,15S-dien-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 säureCayman Chemical314010[2H4]-PGE< sub>2 Interner Standard
5S,12R-dihydroxy-6Z,8E,10E,14Z-eicosatetraenoic-6,7,14,15-d4 säureCayman Chemical320110[2H4]-LTB4 Interner Standard
9α,11,15S-trihydroxy-thromba-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 säureCayman Chemical319030[2H4]-TxB2 Interner Standard
5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraensäureCayman Chemical342505-ox–TE Standard
12-oxo-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraensäureCayman Chemical3458012-ox–TE Standard
15-oxo-5Z, 8Z,11Z,13E-EicosatetraensäureCayman Chemical3473015-ox–TE Standard
5R-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraensäureCayman Chemical342255(R)-HETE Standard
5S-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraensäureCayman Chemical342305(S)-HETE Standard
8R-hydroxy-5Z,9E,11Z, 14Z-EicosatetraensäureCayman Chemical343508(R)-HETE Standard
8S-hydroxy-5Z,9E,11Z,14Z-eicosatetraensäureCayman Chemical343608(S)-HETE Standard
11R-hydroxy-5Z,8Z,12E,14Z-eicosatetraensäureCayman Chemical3450511(R)-HETE Standard
11S-hydroxy-5Z,8Z,12E, 14Z-EicosatetraensäureCayman Chemical3451011(S)-HETE Standard
12R-hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraensäureCayman Chemical3456012(R)-HETE Standard
12S-hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoic acidCayman Chemical3457012(S)-HETE Standard
15R-hydroxy-5Z,8Z,11Z, 13E-EicosatetraensäureCayman Chemical3471015(R)-HETE Standard
15S-hydroxy-5Z,8Z,11Z,13E-eicosatetraensäureCayman Chemical3472015(S)-HETE Standard
20-hydroxy-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraensäureCayman Chemical9003020-HETE Standard
9R-hydroxy-10E,12Z-octadecadiensäureCayman Chemical384059(R)-HODE Standard
9S-hydroxy-10E,12Z-octadecadenensäureCayman Chemical384109(S)-HODE Standard
13R-hydroxy-9Z,11E-octadecadiensäureCayman Chemical3860513(R)-HODE Standard
13S-hydroxy-9Z,11E-octadecadiensäureCayman Chemical3861013(S)-HODE Standard
9α,11α,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oicacid Cayman Chemical16010PGF2α Standard
9α,11α,15S-trihydroxy-(8β)-prosta-5Z,13E-dien-1-oicacid Cayman Chemical163508-iso-PGF2α Standard
9α,11β,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oicacid Cayman Chemical1652011β-PGF2 Standard
9α,15S-dihydroxy-11-oxo-prosta-5Z,13E-dien-1-oicacid Cayman Chemical12010PGD2 Standard
9-oxo-11α,15S-dihydroxy-(8β)-prosta-5Z,13E-dien-1-oicacid Cayman Chemical143508-iso-PGE2 Standard
9-oxo-11α,15S-dihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acidCayman Chemical14010PGE2 Standard
5S,12R-dihydroxy-6Z,8E,10E,14Z-eicosatetraensäureCayman Chemical20110LTB4 Standard
9α,11,15S-trihydroxythromba-5Z,13E-dien-1-oicacid Cayman Chemical19030TxB2 Standard
Phosphat gepufferte KochsalzlösungGIBCO, von Life Technologies14190
DiethyletherSigma-Aldrich346136
DichlormethanAcros Organics61030-1000wasserfrei
N,N-DiisopropylethylaminSigma-Aldrich387649
PentafluorylbenzylbromidSigma-Aldrich101052
SalzsäureSigma-Aldrich320331
KaliumhydroxidFluka00650
AcetonitrilFisher ScientificA996-4
MethanolFisher ScientificA454-4
ChloroformFisher Scientific366927
HexanFisher ScientificH303-4
IsopropanolFisherScientific A464-4
EthanolDecon Laboratories2716
WasserFisher ScientificW7-4
PasteurpipettenFisher Scientific13-678-200
10 mL GlaszentrifugenröhrchenKimble Chase73785-10Schraubverschluss
Phenol SchraubverschlüsseKimble Chase73802-13415
Chiralcel ADH SäuleChiral Technologies19325
HPLC-FläschchenWasser60000751CV
HPLC-EinsätzeWasserWAT094171

Referenzen

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