Isolating LacZ-exprimierenden Zellen aus Maus Innenohrgeweben mittels Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Durchflusszytometrie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die Isolierung und Untersuchung spezifischer Zellpopulationen ermöglicht. Dieses Protokoll beschreibt Schritte zur Isolierung von LacZ-exprimierenden Zellen aus Cochlea-Gewebe von neonatalen transgenen Mäusen. Dissoziierte Cochlea-Zellen wurden vor der Trennung mittels Durchflusszytometrie mit fluoreszenzkonjugierten Substraten der β-Galactosidase markiert.

Zusammenfassung

Die Isolierung spezifischer Zelltypen ermöglicht die Analyse seltener Zellpopulationen wie Stamm-/Vorläuferzellen. Ein solcher Ansatz zur Untersuchung von Innenohrgewebe stellt aufgrund des Mangels an interessierenden Zellen und der wenigen transgenen Reportermausmodelle eine einzigartige Herausforderung dar. Hier beschreiben wir ein Protokoll, bei dem fluoreszenzkonjugierte Sonden verwendet werden, um selektiv LacZ-positive Zellen aus der neonatalen Cochleae zu markieren.

Die häufigste zugrundeliegende Pathologie des sensorineuralen Hörverlusts ist die irreversible Schädigung und der Verlust von sensorischen Haarzellen der Cochlea, die benötigt werden, um Schallwellen in neuronale Impulse umzuwandeln. Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die murinen Hör- und Vestibularorgane Stamm-/Vorläuferzellen beherbergen, die ein regeneratives Potenzial haben könnten^1,2. Diese Ergebnisse rechtfertigen weitere Untersuchungen, einschließlich der Identifizierung spezifischer Zelltypen mit Stamm-/Vorläuferzelleigenschaften. Es wurde gezeigt, dass der Wnt-Signalweg eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung von Stamm-/Vorläuferzellpopulationen in mehreren Organsystemen spielt^3-7. Wir haben kürzlich Wnt-responsive Axin2-exprimierende Zellen in der neonatalen Cochlea identifiziert, aber ihre Funktion ist weitgehend unbekannt⁸.

Um das Verhalten dieser Wnt-responsiven Zellen in vitro besser zu verstehen, haben wir eine Methode zur Isolierung von Axin2-exprimierenden Zellen aus Cochleae von Axin2-LacZ-Reportermäusen^{entwickelt 9}. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie zur Isolierung von Axin2-LacZ-positiven Zellen aus der neonatalen Cochleae konnten wir wiederum eine Vielzahl von Experimenten an lebenden Zellen durchführen, um ihr Verhalten als Stamm-/Vorläuferzellen zu untersuchen. Im Folgenden werden die Schritte für die Mikrodissektion der neonatalen Cochlea, die Dissoziation dieser Gewebe, die Markierung der LacZ-positiven Zellen mit einem fluorogenen Substrat und die Zellsortierung detailliert beschrieben. Techniken zur Dissoziation von Cochleae in Einzelzellen und zur Isolierung von Cochleazellen mittels Durchflusszytometrie wurden beschrieben^2,10-12. Wir haben Modifikationen an diesen Techniken vorgenommen, um ein neuartiges Protokoll zur Isolierung von LacZ-exprimierenden Zellen aus der neonatalen Cochlea zu etablieren.

Protokoll

1. Mikrodissektion der Cochlea

1. Bereiten Sie das Präpariermikroskop unter der Haube vor, indem Sie die Oberflächen mit 70 % Ethanol abwischen und Eisblöcke auslegen.
2. Bereiten Sie 10-15 35 mm Petrischalen unter sterilem Zustand vor und füllen Sie sie zur Hälfte (~2 ml) mit steriler Hank's Balanced Salt Solution with Calcium (HBSS).
3. Bereiten Sie zwei 35 mm Petrischalen unter sterilen Bedingungen vor und füllen Sie sie zur Hälfte (~2 ml) mit steriler 1x Phosphat-Pufferlösung (PBS).
4. Sterilisieren Sie die Mikrozange in einem konischen 50 ml Falcon-Röhrchen mit 70% Ethanol.
5. Verwenden Sie in einem von der sterilen Haube getrennten Raum eine Irisschere, um 12-15 postnatale (P) 0-3 Tage alte Axin2^LacZ/+ Reportermäuse zu enthaupten, und legen Sie die Köpfe auf eine 60 mm Petrischale auf einem Eisblock.
6. Mit der Dumont-Pinzette #5 und der Irisschere den Unterkiefer und die Zunge herausschneiden und die Schädelbasis auf Höhe des Gaumens durchschneiden.
7. Entfernen Sie die darüber liegende Haut der Schädelvaria und durchschneiden Sie die Schädelbasis, indem Sie die Schere am unteren Teil des Foramen magnum in die Mitte des Gaumens einführen.
8. Machen Sie auf beiden Seiten einen weiteren Schnitt mit einer Irisschere von der Schnittkante des Gaumens bis zum oberen Aspekt der Schädeldecke, wobei Sie darauf achten sollten, die Kapsel der Ilikasse nicht zu beschädigen.
9. Vollständige Isolierung des Schläfenbeins durch zwei um 45 Grad abgewinkelte Schnitte, beginnend mit dem oberen Aspekt des Foramen magnum, der sich bis zum koronalen Schnitt am harten Gaumen erstreckt.
10. Platzieren Sie isolierte Schläfenknochen in 35-mm-Petrischalen mit HBSS auf einem Eisblock.
11. Sammle Schläfenknochen von etwa 12-15 Tieren, die geopfert wurden, also insgesamt 24-30 Schläfenknochen.
12. Petrischale mit isolierten Schläfenknochen in eine zuvor vorbereitete sterile Dissektionshaube (1.1) überführen.
13. Übertragen Sie vier Schläfenknochen in jede vorbereitete 35-mm-Petrischale, die HBSS (1.2) enthält, und legen Sie sie auf einen Eisblock.
14. Beginnen Sie die Mikrodissektion mit zwei Pinzetten #55, um die Hirnrinde, den Hirnstamm und das Kleinhirn im Schläfenbein über der Kapsel otocis vorsichtig zu entfernen.
15. Ohne die Kapsel zu entfernen, schneiden Sie Teile der Cochlea-Kapsel ab, beginnend am Eingang des Nervus vestibulocochlearis in die Nervus oticus.
16. Ziehen Sie nach Freilegung der Cochlea-Basis die Cochlea und das umgebende Gewebe vorsichtig heraus. Entfernen Sie das verbleibende Ganglion spiralförmig und die Stria vascularis, beginnend an der Basis.
17. Übertragen Sie die Cochlea in eine 35 mm Petrischale, die PBS auf einem Eisblock enthält.
18. Für eine optimale Lebensfähigkeit des Gewebes sollte die Gesamtzeit der Dissektion weniger als 60 Minuten betragen.
19. Wiederholen Sie die obigen Schritte für 3-5 Wildtyp-Mäuse (WT) P0-P3 als Kontrollen für Axin2-LacZ-Mäuse.

2. Zelldissoziation (modifiziert von zuvor beschriebenen Methoden)^2,10

1. 50 μl steriles PBS in der Mitte einer Vertiefung in eine unbeschichtete 6-Well-Kulturschale geben.
2. Übertragen Sie bis zu 20 Axin2^LacZ/+ Cochleae in jedes 50 μl Tröpfchen PBS. Ein neues 50-μl-Tröpfchen PBS sollte für mehr als 20 Cochleae verwendet werden.
3. 50 μl Aliquots mit 0,125 % Trypsin ~2 Minuten in einem 37 °C warmen Wasserbad vorwärmen.
4. Geben Sie 50 μl vorgewärmtes 0,125%iges Trypsin zu PBS, das die Cochleae enthält.
5. Die 6-Well-Form 8 Minuten lang bei 37 °C erhitzen und dabei darauf achten, dass die Form nicht geschüttelt wird.
6. Um die Trypsinisierung zu beenden, fügen Sie 50 μl Soja-Trypsin-Inhibitor zu jedem 100-μl-Tröpfchen hinzu.
7. Fügen Sie weitere 50 μl Full Media (FM) hinzu (IGF-1, EGF, bFGF, HS, Ampicillin in DMEM/F12)²
8. Mit einer stumpfen Pipettenspitze von 300 μl und einer p200-Pipette mit einer auf 125 μl eingestellten Pipettenspitze werden die Zellen 80 Mal sanft zerrieben, wobei darauf zu achten ist, dass keine Blasen entstehen.
9. Nach der Verreibung jedes Tröpfchens werden weitere 200 μl FM in jede Vertiefung gegeben.
10. Geben Sie die Zellen durch ein blaues 40 μm großes Falcon-Zellsieb in eine neue Vertiefung.
11. Übertragen Sie die Zellen in Standard-Falcon FACS-Röhrchen (nach der Verreibung und Filtration verbleiben ca. 300 μl).
    1. Teilen Sie die Zellen aus Wildtyp-Cochleae in drei Röhrchen auf und verdünnen Sie in jedem Röhrchen 100 μl mit 300 μl FM. Ein Röhrchen wird als Blindkontrolle verwendet, eines wird nur mit Propidiumiodid (PI, 1 μg/ml) gefärbt (darf in diesem Schritt nicht hinzugefügt werden), während das letzte Röhrchen mit 3-Carboxyumbelliferyl β-D-Galactopyranosid (CUG, siehe 2.15) gefärbt wird, um die Hintergrundfluoreszenz zu detektieren.
    2. Geben Sie 400 μl dissoziierte Zellen aus Axin2-LacZ-Cochleae in jedes FACS-Röhrchen. Als reine CUG-Kontrolle werden 10 μl Zellen in 390 μl FM verdünnt (siehe Röhrchen F in Schritt 2.15). Das Volumen der verbleibenden Röhrchen auf 400 μl erhöhen.
12. Inkubieren Sie die Zellen in einem 37°C befeuchteten Inkubator für 10 Minuten.
13. Vorbereiten der CUG-Lösung:
    1. Bereiten Sie 200 μl CUG für jedes FACS-Röhrchen vor, das gefärbt werden muss.
    2. CUG in FM 1:50 in einer dunklen Haube mit minimaler Lichteinwirkung verdünnen.
    3. Verdünntes CUG bei 37°C 3-5 Minuten vorwärmen.
14. Geben Sie anschließend 200 μl verdünntes CUG in jedes geeignete FACS-Röhrchen. Bei Röhren, die nicht für CUG vorgesehen sind, wird nur FM hinzugefügt (siehe 2.15).
15. An dieser Stelle sollte es fünf Kategorien von Röhrchen mit folgendem Inhalt geben (fügen Sie in diesem Schritt kein PI hinzu):
    1. Wildtype - ohne CUG oder PI (zur Kompensation siehe Schritt 3.5-6)
    2. Wildtype - nur mit PI (zur Kompensation)
    3. Wildtype - mit CUG und PI (zur Kontrolle gegen Axin2-LacZ-Zellen)
    4. Axin2-LacZ - nur mit CUG (gegen Ausgleich)
    5. Axin2-LacZ - mit CUG und PI (für die eigentliche Zellsortierung)
    6. Axin2-LacZ - mit CUG und PI (für die Ereignisanalyse)
16. Schützen Sie alle Röhrchen vor Licht und inkubieren Sie sie 25 Minuten lang in einem 37°C befeuchteten Inkubator.
17. Bereiten Sie frische HEPES + Fetales Rinderserum (FBS) Lösung vor, um die Reaktion nach der Inkubation zu stoppen:
    1. 400 μl frisch aufgetautes FBS in 10 ml sterilem 10 mM HEPES (in PBS) in einem 15 ml Falcon-Röhrchen verdünnen.
    2. Tube bis zur Vollendung von 2.16 Uhr auf Eis legen.
18. Geben Sie 1,8 ml eiskalte HEPES-Lösung in jedes FACS-Röhrchen unter einer sterilen Haube bei ausgeschaltetem Licht, um die Lichteinwirkung zu minimieren.
19. Zellen 5 Minuten lang bei 1200 U/min zentrifugieren.
20. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 300 μl FM, poolen Sie alle Aliquoten für die Sortierprobe (Axin2-LacZ mit CUG und PI gefärbt).
21. Geben Sie PI in jedes Röhrchen, um eine Endkonzentration von 1 μg/ml zu erreichen.
22. Zellen auf Eis legen und vor Licht schützen.

3. Durchflusszytometrie

1. Wir verwenden eine BD Aria II, die mit 488-nm-, 633-nm- und 407-nm-Lasern ausgestattet ist. Die Detektion von CUG erfolgte mit dem 407-nm-violetten Laser und PI mit dem blauen 488-nm-Laser in der Stanford Shared FACS Facility.
2. Ein geschulter Bediener des Durchflusszytometers ist erforderlich. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, nachdem Sie die Laser aufgewärmt, die Zytometerdetektoren gemäß den Anweisungen des Herstellers kalibriert und die optimalen Sortierparameter eingestellt haben. Nach unserer Erfahrung haben wir festgestellt, dass die Verwendung einer 100-μm-Düse die Lebensfähigkeit der Zellen für nachfolgende Experimente optimiert.
3. Folgende Parameter wurden verwendet: Schwellenwert bei 5.000 Ereignissen, Flussrate weniger als 3.000 Ereignisse/Sekunde, Vorwärtsstreuung (FSC) bei 125 Volt und Seitenstreuung (SSC) bei 250 Volt, PE-Cy5-Kanal wurde für PI und Kaskadenblau für CUG verwendet.
4. Spülen Sie die Zytometerkammer zweimal in dieser Reihenfolge mit 70 % Ethanol und PBS.
5. Beginnen Sie die Analyse mit ungefärbten Wildtyp-Zellen (Röhrchen A in Schritt 2.15). Erfassen Sie 1.000 Ereignisse, um die Zellverteilung im Diagramm FSC vs. SSC zu bestimmen. Wenn Streuung nicht gewünscht ist, passen Sie die FSC- und SSC-Parameter an.
6. Führen Sie die Kompensation mit ungefärbten WT-Zellen (Röhrchen A), PI-gefärbten WT-Zellen (Röhrchen B) und CUG-gefärbten Axin2-LacZ-Zellen (Röhrchen D) durch. Die Kompensation ermöglicht eine genauere Signalunterscheidung zwischen den verschiedenen Laserwellenlängen.
7. Starten Sie die Analyse mit Wildtyp-PI- und CUG-gefärbten Zellen (Röhrchen C) und stellen Sie Gating-Parameter ein für:
   1. Ausschluss von Schutt basierend auf FSC- und SSC-Diagramm.
   2. Ausschluss von Dubletten und Klumpen unter Verwendung der Parzelle mit FSC-Höhe im Vergleich zur FSC-Fläche.
   3. Ausschluss abgestorbener Zellen basierend auf dem FSC-Area- versus PE-Cy5-Area-Plot.
   4. Richten Sie den Plot des FSC-Bereichs im Vergleich zum Kaskadenblau-Bereich mit beliebiger Torplatzierung ein.
8. Analysieren Sie als Nächstes 10.000 Ereignisse aus dem Sortierprobenröhrchen, das Axin2-LacZ, PI- und CUG-gefärbte Zellen (Röhrchen F) enthält.
   1. Alle Gatter, die mit Wildtype-Zellen gesetzt wurden, sollten hier angewendet werden.
   2. Erstellen Sie mithilfe von Diagrammen für die Wildtypzellen Gates für Cascade Blue-high-Zellen, die weniger als 1 % der Gesamtzahl der Ereignisse ausmachen.
   3. Dieselben Gates von Cascade Blue-high umfassen nun etwa 15-20% der Zellen in der Axin2-LacZ-Probe, was diese Axin2-hohen Zellen ausmacht.
   4. Erstellen Sie unter Verwendung des Analysediagramms der Axin2-LacZ-Zellen ein Gate für die am wenigsten fluorogenen 15-20% der Zellen, von nun an Axin2-niedrige Zellen.
9. Basierend auf der oben genannten Gating-Strategie sortieren Sie die Zellen in FACS-Röhrchen mit 500 μl FM, ein Röhrchen für Axin2-hohe und das andere für Axin2-niedrige Zellen. Stellen Sie sicher, dass sich die Sammelröhrchen während der Sortierung in einer Kammer befinden, die auf 4 °C gekühlt wird.
10. Rekordanzahl von Zellen, die mit dem Durchflusszytometer für jede Population gezählt werden.

4. Repräsentative Ergebnisse (siehe Abbildung 2):

Mit dem obigen Protokoll gewinnen wir typischerweise 40-45% trümmerfreie Zellen sowohl aus dem Wildtyp als auch aus Axin2^LacZ/+ Cochleae (Abbildungen 2A und B), wobei etwa 70% von ihnen frei von Dubletten sind (siehe Abbildungen 2A' und B'). Die meisten sortierten Zellen sind lebensfähig und haben PI nicht aufgenommen (~95%) (Abbildungen 2A'' und B''). Im Durchschnitt gelten die besten ~20% CUG-positiven Zellen als Axin2-LacZ-positive Zellen (Abbildung 2B''') und korrelieren mit etwa 15.000 Axin2-LacZ-hohen Zellen pro 10-12 Tiere.

Durchflusszytometrische Neusortierungsanalyse von Axin2-High-Zellen ergab eine Reinheit von mehr als 93% im Cascade Blue-Kanal. Um die Identität dieser Zellen weiter zu bestätigen, führten wir eine Post-Sort-Immunfärbung sowohl von Axin2-High- als auch von Axin2-Low-Zellen mit Anti-β-Galactosidase-Antikörpern durch und fanden heraus, dass die Axin2-High-Zellen ~93,4% β-Galactosidase-positive Zellen (mehr als 1.500 analysierte Zellen) und dass Axin2-Low-Zellen ~4,8% β-Galactosidase-positive Zellen enthielten.

Abbildungen und Tabellen:

Abbildung 1.Experimentelles Paradigma. Die obige Abbildung zeigt die gesamte experimentelle Strategie und die Techniken, wie sie im Protokollabschnitt beschrieben werden. Cochleae von Wildtyp- und Axin2^LacZ/+ Mäusen werden geerntet und in Einzelzellen dissoziiert, die dann mit CUG, einem fluoreszierenden Substrat für β-Galactosidase, behandelt wurden. Axin2-LacZ-hohe und -niedrige Zellen wurden dann mittels Durchflusszytometrie getrennt. Klicken Sie hier, um eine Version dieses Bildes in voller Größe anzuzeigen.

Abbildung 2.Gating-Strategien. Diese Abbildung veranschaulicht die verwendeten Gating-Strategien der Durchflusszytometrie. A) Dissoziierte Wildtyp-Zellen, die die gleiche Behandlung wie Axin2-LacZ-Zellen durchlaufen haben, werden hier anhand von insgesamt 10.000 Ereignissen analysiert. Das erste Bild zeigt die seitliche Streufläche (SSC-A) im Vergleich zur vorderen Streufläche (FSC-A). Hier ist eine bestimmte Gruppe von Ereignissen viel größer als die Ereignisse, die näher an der Y-Achse liegen. Diese Ereignisse werden als "Debris Negative" bezeichnet. Das nächste Gate, A', analysiert die "Debris Negative"-Zellen aus Panel A, was 43,8 % der Gesamtzahl der Ereignisse ausmacht (siehe Tabelle unten). In diesem Panel wird die Streuhöhe nach vorne (FSC-H) im Vergleich zum FSC-A verwendet, um Dubletten auszuschließen. Ereignisse, die von der erwarteten linearen Natur des Diagramms abweichen, werden ausgeschlossen. Diese Präparation liefert typischerweise ~70% Ereignisse innerhalb des vorgesehenen Gates, und die verbleibenden Zellen werden ausgeschlossen. In Panel A wird Propidiumiodid (PI), wie es über den PE-Cy5-Kanal nachgewiesen wird, zur Markierung toter Zellen verwendet (5,3 %). Im nächsten Panel (A''') wird der Cascade Blue Channel verwendet, um das Fluoreszenzsubstrat CUG zu detektieren. Hier umfassen die LacZ-High-Gates weniger als 1% der gesamten Veranstaltungen. B) Dissoziierte Zellen von Axin2-LacZ-Mäusen, die mit CUG und PI behandelt wurden, werden hier anhand von insgesamt 10.000 Ereignissen analysiert. Hier kommen identische Tore aus Panel A zum Einsatz. B' zeigt, dass 29,5 % der Zellen als Dubletten ausgeschlossen werden, während B'' zeigt, dass 5,4 % nicht lebensfähig sind. Die anfänglichen Gates für LacZ-high- und -low-Zellen werden unter Verwendung von Panel B''' gezeichnet, wobei LacZ-high ursprünglich auf 19,7 % und LacZ-low auf 20,4 % festgelegt wurde. Klicken Sie hier, um eine Version dieses Bildes in voller Größe anzuzeigen.

kg

		Nummer der Veranstaltung	Prozentsatz
ein	Wildtyp-Analyse	10.000
A'	Schmutz negativ	4.381	43,80 %
A''	Dublett negativ	3.116	71,10 %
A'''	PI Negativ	2.951	94,70 %
	LacZ-hoch	16	0,54 %
	LacZ-niedrig	2.790	94,50 %
Vgl.	Axin2-LacZ-Analyse	10.000
B'	Schmutz negativ	4.218	42,2 %
B''	Dublett negativ	2.973	70,50 %
B'''	PI Negativ	2.813	94,6 %
	LacZ-hoch	Nr. 553	19,70 %
	LacZ-niedrig	573	20,40 %

Tabelle 1. Quantitative Analysen von Gating-Strategien in Abbildung 2.

Diskussion

Unabhängige Forschungsstudien haben eine eingeschränkte Regenerationsfähigkeit der neonatalen Cochleae charakterisiert^2,10,12,13. Mit Hilfe einer GFP-Reportermäuse und Durchflusszytometrie isolierten White und Kollegen spezifische Cochlea-Stützzellen und fanden heraus, dass sie Vorläuferzelleigenschaften aufweisen¹².

Es wurde gezeigt, dass der kanonische Wnt-Signalweg Stamm-/Vorläuferzellpopulationen in mehreren Organsystemen markiert, einschließlich des Gehirns, der Brus...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Petrischale, Polystyrol, steril Geriner Bio-one 35 x 10 mm	VWR international	82050-540
BD Falcon Cell Strainers, steril, BD Biosciences, blau, 40 μ m	VWR international	21008-949
Hanks" Ausgewogene Salzlösung (HBSS). Lösung mit Calcium, Magnesium und ohne Phenolrot, steril	VWR international	45000-456
Cellstar Zentrifugenröhrchen, Polypropylen, steril, greiner bio-one, 50 ml	VWR international	82050-346
Cellstar Zentrifugenröhrchen, Polypropylen, steril, greiner bio-one, 15 ml	VWR international	82050-278
B-27 serumfreies Supplement (50x), flüssig	Invitrogen	17504-044
N-2 Supplement (100x), flüssig	Invitrogen	17502-048
bFGF, Fibroblasten-Wachstumsfaktor-basisch humanes	Sigma-Aldrich	F0291
IGF-1, insulinähnlicher Wachstumsfaktor-1 aus Maus	Sigma-Aldrich	I8779
EGF, epidermaler Wachstumsfaktor human	Sigma-Aldrich	E9644
Dulbecco" s Modifizierter Adler" s Medium/Schinken" s F-12 50/50 Mix: 1X, mit L-Glutamin und 15 mM HEPES	VWR	international 45000-350
BD Falcon Rundbodenröhrchen, Einweg, Polystyrol, 12x75	VWR international	60819-295
Trypsin, 0,25% (1X) mit EDTA 4Na, flüssig	Invitrogen	25200-056
ep Dualfilter TIPS 300uL, 960 TIPS	Eppendorf	22491245 Trypsin-Inhibitor
, Sojabohne, gereinigt	Worthington Biochemical	LS003570
BD Falcon 40um Zellsiebe	BD Biosciences	21008-949
Multiwell-Platten, Polystyrol, Greiner Bio-One, unbehandelte Platten, 6 Wells	VWR international	82050-846
Marker Gene FACS Blue LacZ beta-Galactosidase Detection Kit	Marker Gene Technologies	M0255