Methodenartikel

Electric Field-gesteuerte gerichtete Wanderung von neuralen Vorläuferzellen in 2D-und 3D-Umgebungen

DOI:

10.3791/3453

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16. Februar 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Dentistry, Cardiff Institute of Tissue Engineering & Repair, Cardiff University , 2Shandong Qianfoshan Hospital, Shandong University School of Medicine, 3Dermatology and Ophthalmology Research, Institute for Regenerative Cures, University of California at Davis

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll zeigt Methoden verwendet werden, um 2D-und 3D-Umgebungen in speziell angefertigten electrotactic Kammern einzurichten, die Zellen verfolgen können In vivo / ex vivo Verwendung von Zeitraffer-Aufnahme an der Ebene einzelner Zellen, um Galvanotaxis / electrotaxis und andere zelluläre Reaktionen untersuchen zu Gleichstrom (DC) elektrische Felder (EF) zu lenken.

Zusammenfassung

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Endogene elektrische Felder (EF) kommen natürlicherweise in vivo und spielen eine entscheidende Rolle bei der Gewebe / Organ Entwicklung und Regeneration, einschließlich der des zentralen Nervensystems 1,2. Diese endogenen EF durch zellulären Regulation der Ionentransport mit dem elektrischen Widerstand von Zellen und Geweben kombiniert erzeugt. Es wurde berichtet, dass EF angewandte Behandlung kann der funktionellen Wiederherstellung von Verletzungen des Rückenmarks bei Tieren und Menschen 3,4 zu fördern. Insbesondere hat EF-gerichtete Wanderung in einer Vielzahl von Zelltypen 5,6, einschließlich neuralen Vorläuferzellen (NPC) 7,8 nachgewiesen. Anlegen eines Gleichstroms (DC) EF ist nicht eine allgemein verfügbare Technik in den meisten Laboratorien. Wir haben detaillierte Protokolle für die Anwendung von DC EFs beschrieben, um Zell-und Gewebekulturen zuvor 5,11. Hier präsentieren wir eine Video-Demonstration der Standard-Methoden auf einem berechneten Feldstärke einzurichten 2D-Basis eind 3D-Umgebungen für NPCs und zu zellulären Reaktionen auf EF Stimulation in beiden einzigen Zelle Wachstumsbedingungen in 2D, und der organotypischen Rückenmark Scheibe in 3D untersuchen. Die Wirbelsäule ist ein idealer cordslice Empfänger Gewebe zum Studium NPC ex vivo Verhalten, nach der Transplantation, weil die zytoarchitektonischen Gewebeorganisation wird auch in diesen Kulturen 9,10 erhalten. Darüber hinaus ist diese ex vivo-Modell ermöglicht auch Verfahren, die derzeit technisch nicht möglich, Zellen in vivo mittels Zeitraffer-Aufnahme auf der Ebene einzelner Zellen zu verfolgen. Es ist von entscheidender Zelle muss auf das Verhalten nicht nur in einer 2D-Umgebung zu bewerten, sondern auch in einer 3D-organotypischen Bedingung, die die in vivo-Umgebung imitiert. Dieses System ermöglicht hochauflösende Bildgebung mit Deckglas-basierte Gerichte im Gewebe oder Organ Kultur mit 3D-Tracking einzelner Zellmigration in vitro und ex vivo und kann ein Zwischenschritt, bevor sie auf in sein vivo Paradigmen.

Protokoll

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1. Neurale Vorläuferzellen Zellisolation

  1. Sezieren ganze Gehirne von E14-16-Mäusen und in kaltem DMEM/F12 Basismedium. Entfernen Sie alle Meningen unter einem Mikroskop anatomischen und Transfer Gehirne in eine 35 mm Petrischale.
  2. Verwenden feinen Pinzette mechanisch zu distanzieren Gehirne in Gewebefragmente und übertragen Sie sie auf einem 15 ml-Tube, dann zentrifugieren Proben bei 800 rpm für 3 Minuten, um Verschmutzungen zu entfernen.
  3. Add DMEM/F12 mit bFGF und EGF und verreiben mit einer 1 ml Pipette.
  4. Übergeben Sie die Zellsuspension durch ein Sieb, um Zelle eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten.
  5. Platte Zellen....

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Diskussion

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Die Protokolle verwenden wir auf der Basis früherer Studien 5,11. Mit Hilfe dieser Methoden stabilen Kultur und elektrischer Strom Bedingungen aufrecht erhalten, während ein EF-Agar über Brücken, Steinberg-Lösung und Ag / AgCl-Elektroden, um Zellen oder in Scheiben individuell gestaltet electrotactic Kammern von standardisierten und präzise Abmessungen kultiviert werden. Die Tiefe der Kammern kann eingestellt werden, um Platz für verschiedene Dicken Probe 11 zu, und im Falle von Zellen, Kammergröße.......

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Offenlegungen

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von der Royal Society URF Zuschuss UF051616, Großbritannien und den European Research Council StG Zuschuss 243261 BS unterstützt. Die Arbeit im Labor MZ wird auch durch eine California Institute of Regenerative Medicine Zuschuss RB1-01417 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Name des Reagenzes Firma Katalog-Nummer Kommentare
FGF-basic Rekombinantes humanes Invitrogen PHG0026 20 ng / ml
Rekombinantes humanes EGF Invitrogen PHG0311 20 ng / ml
N2-Supplement (100X) Flüssigkeit Invitrogen 02048
DMEM/F12-Medium (high Glucose) Invitrogen 31330-095
Poly-D-Lysin Millipore A-003-E
Natürliche Mauslaminin Invitrogen 23017-015
Wachstumsfaktor reduziert Basalmembran-Matrix (Matrigel) BD Biosciences 354230
HEPES-Puffer Gibco 15630
McIlwain Gewebe Chopper Die Mickle Laboratory Engineering Co Ltd TC752-PD
Dow Corning Hochvakuum-Silikonfett Sigma-Aldrich Z273554

Referenzen

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  1. Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Wound healing with electric potential. N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).
  2. McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).
  3. B....

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