Immunfärbung von Dissected Zebrafisch embryonale Herz

Zusammenfassung

Eine schnelle Weg zur Immunfärbung von Zebrafisch-Embryonen Herzen Verhalten beschrieben wird. Im Vergleich zu der ganze Berg Immunfärbung Ansatz, diese Methode drastisch erhöht die Penetration der Antikörper, die die Erzielung einer hohen Auflösung, dass zelluläre / subzelluläre Strukturen offenbaren sich im Herzen innerhalb von einer deutlich reduzierten Bearbeitungszeit ermöglicht.

Zusammenfassung

Zebrafisch-Embryo wird zu einem beliebten In-vivo-Modell zum Studium der Wirbeltiere kardiale Entwicklung und menschlichen Herzerkrankungen aufgrund seiner vorteilhaften Embryologie und Genetik ^1,2. Etwa 100-200 Embryonen sind leicht zugänglich jede Woche von einem einzigen Paar von erwachsenen Fischen. Die transparente Embryonen, die ex utero entwickeln eignen sie sich ideal für die Beurteilung der Herzfehler ^3. Der Ausdruck eines beliebigen Gens kann über Morpholino Technologie-oder RNA-Injektion ⁴ manipuliert werden. Darüber hinaus freuen genetische Screens haben bereits eine Liste von Mutanten, die unterschiedlichen Perspektiven der Kardiogenese ⁵ berühren generiert.

Whole mount Immunfärbung ist eine wichtige Technik in diesem Tiermodell die Expressionsmuster des Zielproteins zu einem bestimmten Gewebe ⁶ offenbaren. Allerdings haben Bilder mit hoher Auflösung, dass zelluläre oder subzelluläre Strukturen offenbaren kann schwierig gewesen, vor allem aufgrund der physikalischen location des Herzens und der schlechten Penetration der Antikörper.

Hier stellen wir eine Methode, um diese Engpässe durch Sezieren Herz zuerst und dann die Durchführung der Färbung auf der Oberfläche eines Objektträgers Adresse. Um den Verlust von kleinen Herzen Proben zu verhindern und die Lösung Handhabung zu erleichtern, haben wir eingeschränkt Herzen Proben innerhalb eines Kreises auf der Oberfläche der Objektträger durch eine immEdge Stift gezeichnet. Nach der Färbung kann die Fluoreszenz-Signale direkt von einem zusammengesetzten Mikroskop beobachtet werden.

Unsere neue Methode verbessert das Eindringen von Antikörpern, da ein Herz aus einem embryonalen Fisch besteht nur aus wenigen Zellschichten. Qualitativ hochwertige Bilder von intakten Herzen kann innerhalb eines stark reduzierten Prozession Zeit für Zebrafischembryonen im Alter von Tag 2 bis Tag 6 gewonnen werden. Unsere Methode kann möglicherweise ausgeweitet werden auf andere Organe entweder von Zebrafisch oder andere kleine Tiere seziert Fleck.

Protokoll

1. Vorbereitung von Dias und Feuchtekammer

1. Die befeuchteten Kammer kann aus einer Kiste wie ein geleert tip box erfolgen. Wrap sowohl der Kammer und der mit Alufolie abdecken, um die Proben vor Licht zu schützen.
2. Im Inneren der Kammer, legte einen Haufen nasse Papiertücher, um die Feuchtigkeit in der Kammer, die das Herz Proben vor dem Austrocknen wird verhindert, aufrecht zu erhalten. Setzen Sie einen kleinen Microplatte auf der Oberseite des Papiertuch als Ablage für die Folien.
3. Zeichnen Sie Linien oder Kreise auf der Oberfläche eines Objektträgers mit dem immEdge Stift Brunnen für Herz-Proben mit einer Größe ca. 5x5 mm zu machen. Las....

Diskussion

Im Vergleich zu klassischen whole mount Immunfärbung Methoden, hat unsere Methode folgende Vorteile. Erstens kann viel stärkere Fluoreszenzsignale konsequent erreicht werden durch die verbesserte Penetration. In der ganze Berg Immunfärbung Methode, die dichten Haut umgebende Gewebe des Herzens deutlich reduziert das Eindringen von vielen Antikörper, was zu hohen Hintergrund in den ganzen Körper. Dieses Problem ist besonders gravierend für Embryonen älter als 3-Tages-post-Fertilisation (DPF). Im Gegensatz dazu seziert He.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer
Tricaine	Research Organics	3007T
Formaldehyd	Polysciences	04018
Insulin Spritze	Becton Dickinson	329461
Triton-X-100	Sigma	T8532
Anti-β-Catenin-Antikörper	Sigma	C7207
Anti-Mef2c Antikörper	Santa Cruz Biotech	SC313
F59	Zfin
Anti-α-Antikörper actinin	Sigma	A7811
Anti-Ilk Antikörper	Zelluläre Signale	# 3862
Alexa Fluor 568 Ziege anti-Kaninchen IgG td>	Invitrogen	A11011
Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus IgG1	Invitrogen	A21121
Eindeckmedium für die Fluoreszenz-	Vektor	H-1200
ImmEdge Stift	Vektor	H-4000
Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger	Electron Microscopy Sciences	63410-01
Mikroskop Deckglas	Fischer	12 bis 543-D
Konkave Objektträger	Fischer	7-1305-8
Dissektionsmikroskop	Leica MZ95
Zusammengesetztes Mikroskop	Zeiss	Axioplan2
ApoTome	Zeiss

PBST:
1 x PBS
0,5% Triton-X 100

ENT "> 25X Tricaine:
400 mg Tricaine
97,9 mL ddH ₂ O
2,1 ml (1M Tris pH 9)
Der pH-Wert auf 7,0