Mess-Peptide Translokation in große unilamellare Vesikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll Details eine Methode zur quantitativen Messung von Peptid-Translokation in große unilamellare Lipidvesikel. Diese Methode liefert auch Informationen über die Geschwindigkeit der Membran-Translokation und kann verwendet werden, um Peptide, die effizient und spontan Kreuz Lipid-Doppelschichten zu identifizieren.

Zusammenfassung

Es gibt ein aktives Interesse an Peptiden, die leicht Zellmembranen ohne die Hilfe von Zellmembran-Rezeptoren ^1. Viele von ihnen sind als Zell-penetrierende Peptide, die häufig auf ihr Potenzial als Drug-Delivery-Vektoren ^1-3 sind vermerkt bezeichnet. Darüber hinaus gibt es zunehmendes Interesse an antimikrobiellen Peptiden, die über nicht-Membran lytische Mechanismen ^4,5, insbesondere jene, die bakteriellen Membranen voraussichtlich nicht durchdringt, ohne dass Zell-Lyse und töten Zellen durch Eingriffe in intrazellulären Prozessen ^6,7 betreiben. In der Tat haben Autoren zunehmend die Beziehung zwischen zellpenetrierendes und antimikrobielle Peptide ^1,8 hingewiesen. Ein tiefgehendes Verständnis des Prozesses der Membran-Translokation und die Beziehung zwischen Peptid-Struktur und seine Fähigkeit, translozieren erfordert eine effektive und reproduzierbare Tests für die Translokation. Mehrere Gruppen haben Methoden zur Translokation in großen unilamel vorgeschlagene Maßnahmelar Lipidvesikel (LUVs) ^9-13. LUVs dienen als nützliche Modelle für bakterielle und eukaryontische Zellmembranen und sind häufig in der Peptid-Fluoreszenz-Studien ^14,15 verwendet. Hier beschreiben wir unsere Anwendung der Methode zuerst von Matsuzaki und Mitarbeiter entwickelt, um antimikrobielle Peptide, wie Magainin und Buforin II ^16,17 berücksichtigen. Neben der Bereitstellung von unserem Protokoll für diese Methode, stellen wir auch eine einfache Ansatz zur Datenanalyse, die Translokation Fähigkeit mit diesem Assay quantifiziert. Die Vorteile dieser Translokation Assay im Vergleich zu anderen sind, dass sie das Potenzial, um Informationen über die Rate der Membran Translokation bieten und erfordert nicht die Zugabe eines fluoreszierenden Markierung, die verändern Peptid Eigenschaften können ^18, an Tryptophan-haltige Peptide hat. Kurz gesagt, ist die Translokation Fähigkeit in Lipidvesikel als Funktion der Foster Resonance Energy Transfer (FRET) zwischen einheimischen Tryptophan und d gemessenansyl Phosphatidylethanolamin, wenn die Proteine ​​mit der externen assoziiert sind LUV-Membran (Abbildung 1). Cell-penetrierende Peptide gespalten werden, wie sie hemmungslos Trypsin mit dem LUVs gekapselt Begegnung führt zu Entfremdung von der LUV-Membran und einem Rückgang der FRET-Signals. Der Rückgang der FRET-Signals für eine Translokation Peptid beobachtet wird deutlich größer als die für das gleiche Peptid, wenn die LUVs sowohl Trypsin und Trypsin-Inhibitor, oder wenn ein Peptid, das nicht spontan funktioniert cross Lipidmembranen ist Trypsin-haltigen LUVs ausgesetzt enthalten beobachtet. Diese Änderung in der Fluoreszenz bietet eine direkte Quantifizierung der Peptid-Translokation über die Zeit.

Protokoll

1. Vorbereitung der große unilamellare Lipidvesikeln (LUVs)

1. Bereiten LUVs zu dienen als Zellmembran imitiert für den Test ^19.
2. Mix Phosphatidylcholin (POPC, 760,10 g / mol), Phosphatidylglycerin (POPG. 770,99 g / mol), 5-Dimethylamino-1-sulfonyl Phosphatidylethanolamin (DNS-PAPST, 994,350 g / mol) (Avanti Polar Lipids) in Chloroform in einem 50 aufgelöst : 45:5-Verhältnis. Wie in jedem Test erfordert die separate Herstellung der beiden Experimental-und Kontrollgruppe LUVs, sollten zwei Lipid-Kuchen Durchstechflaschen hergestellt werden. 0,376 mg Gesamt-Lipid (0,188 mg POPC, 0,169 mg POPG, und 0,019 mg DNS-PAPST) ist in der Regel ausreicht, um genügend Vesikel für eine einzelne Translokation Versuch zu machen.
3. Abdampfen Chloroform mit einem N ₂ Gasstrom.
4. Trocknen Sie die Lipid-Kuchen 9-14 Stunden in einem Vakuum-Exsikkator.
5. Bereiten Sie ein Lager 10 mM HEPES-Puffer-Lösung (10 mM HEPES, 238,3 g / mol, 45 mM NaCl, 58,44 g / mol, 1 mM EDTA, 372,24 g / mol pH 7,4). HEPES Puffer stZe bei 4 ° C.
6. Bereiten Sie eine Stammlösung von 0,4 mM Schwein Trypsin (23,3 kg / mol) in 10 mM HEPES-Puffer über. Trypsin wird bei -20 ° C gelagert und in unserer Praxis, in der Regel nicht unterziehen mehr als 2 Frost-Tau-Zyklen vor dem Gebrauch.
7. Bereiten Sie eine Stammlösung von 4,0 mM Bowman-Birk-Trypsin-Inhibitor (8 kg / mol) in 10 mM HEPES-Puffer-Lösung und bei -20 ° C. In unserer Anwendung ist dieses Lager wieder aufgefüllt monatlich und in der Regel nicht unterziehen mehr als 3 Frost / Tau-Zyklen, bevor es wieder hergestellt wird.
8. Rekonstituieren experimentellen multilamellare Vesikel (MLV) in einer 0,2 mM Trypsin-Lösung durch Zugabe eines gleichen Volumens von 0,4 mM Trypsin Lager und 10 mM HEPES-Puffer-Lösung auf die getrocknete Lipid Kuchen. Für eine einzelne Probe von 0,376 mg Gesamt-Lipid, ist eine Mischung aus 150 ul Trypsin-Lösung und 150 ul HEPES-Puffer ausreichen.
9. Rekonstituieren Kontrolle MLVs in einer Lösung mit 0,2 mM Trypsin und 2,0 mM Bowman-Birk-Trypsin-Inhibitor durch Zugabe eines gleichen Volumens von 0.4 mM Trypsin Lager und 4,0 mm-Trypsin-Inhibitor auf die getrocknete Lipid Kuchen. Für eine einzelne Probe von 0,376 mg Gesamt-Lipid, ist eine Mischung aus 150 ul Trypsin-Lösung und 150 &mgr; l Trypsin Inhibitor ausreichend.
10. Transfer-MLV-Lösungen von Glasflaschen auf 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
11. Subject MLV-Lösungen bis 5 Frost / Tau-Zyklen in flüssigem Stickstoff.
12. Bereiten Lipid Extruder (Avanti Polar Lipids), indem man zwei Filter unterstützt angefeuchtet in HEPES-Puffer auf jedem Teflon Extruder Stück. Legen Sie eine Nuclepore track geätzten Membran mit 0,1 um Poren (Whatman, United Kingdom) zwischen den beiden Teflon Extruder Stücke, und statt der Extruder Stücke in der Metall-Extruder Kanister. Setzen Sie den Donut spacer über die beiden Extruder Stücke vor dem Anziehen der Metall-Spitze des Extruders Kanister und stellen Sie es in die Halterung ein.
13. Füllen Sie das Hohlraumvolumen innerhalb des Extruders mit 500 ul 10 mM HEPES-Puffer mit einer 250 ul Glasspritze zum Verlust der Vesikel Probe zu verhindern.
14. Legen Sie jedes MLV Probe in den Extruder und drücken Sie die Probe durch die Membran mindestens 21 Mal, um eine einheitliche unilamellare Vesikelgröße gewährleisten. LUVs aus dem MLV-Lösung nach der Extrusion erhalten.
15. Shop LUVs bei 4 ° C lagern und innerhalb von 48 Stunden.

2. Die Quantifizierung der LUV Konzentration

1. LUV-Konzentration wurde durch die Bestimmung der Gesamt-Phosphor-Gehalt in der Probe ²⁰ quantifiziert.
2. Bereiten 8,9 NH ₂ SO ₄ in Nanopure Wasser und bei Raumtemperatur lagern.
3. Bereiten Sie eine 2,5% w / v Ammoniummolybdat VI (588,04 g / mol)-Lösung in Nanopure Wasser. Bereiten Sie eine 10% w / v Ascorbinsäure (176,1 g / mol)-Lösung in Nanopure Wasser. Schützen Sie die Ascorbinsäure-Lösung von Belichtung durch Abdecken des Rohres mit einer Folie. Shop-Lösungen sowohl bei 4 ° C für bis zu 2 Monate.
4. Bereiten 0,65 mM Phosphat-Puffer-Lösung (einbasischen wasserfreien Natriumphosphat, 120 g / mol).
5. Bereiten Sie sechs Standard-tuBes. Standards enthalten sollte 0,0 ul, 50 ul (0,0325 umol), 100 ul (0,065 umol), 175 ul (0,114 umol), 250 ul (0,163 umol), oder 350 ul (0,228 umol) von Phosphor-Lösung.
6. Bereiten Sie LUV Probenröhrchen in dreifacher Ausfertigung. Jedes Probenröhrchen enthalten sollte ungefähr 0,1 umol LUVs. Experimental-und Kontrollgruppe LUV Konzentrationen muss separat gemessen werden.
7. Zur Korrektur einer getrockneten Phosphor-Salzen in der Bowman-Birk-Inhibitor Pulver, LUV ein Steuerelement leer vorbereitet werden müssen. Der Rohling sollte das gleiche Volumen der 0,2 mM trypsin/2.0 mM Bowman-Birk-Inhibitor-Lösung wie in der Kontrolle gestellt Probenröhrchen LUV.
8. Legen Sie 450 ul von 8,9 NH ₂ SO ₄ in jeder der Probe, Standard und leere Röhrchen.
9. Hitze-Proben, Standards und Rohlinge für 25 Minuten bei 175-210 ° C in einem Ofen.
10. Entfernen Sie alle Schläuche und abkühlen lassen. Add 150 ul 30% H ₂ O ₂ zu jedem der tuBes.
11. Hitze-Proben, Standards und Rohlinge für 30 Minuten bei 175-210 ° C.
12. Entfernen Sie die Proben, Standards und Blindproben vor Hitze. Wenn eine der Lösungen noch nicht farblos, mit 50 ul H ₂ O _2, das alle Rohre und Wärme für weitere 15 Minuten bei 175-210 ° C.
13. Add 3.9 mL Nanopure H ₂ O, 0,5 ml Ammoniummolybdat-Lösung und 0,5 ml Ascorbinsäure-Lösung in jedes Röhrchen.
14. Hitze alle Rohre für 5-7 Minuten in ein kochendes Wasserbad.
15. Messen Sie die Absorption der einzelnen Standard-und Probe bei 820 nm mit Hilfe eines Agilent 8453 UV-VIS Spektralphotometer. Die Röhrchen mit 0,0 mmol Phosphor sollte als Rohling für alle Standards und experimentelle verwendet werden LUV Proben. Das Rohr mit dem 0,2 mM trypsin/2.0 mM Bowman-Birk-Inhibitor-Lösung sollte als Rohling für die Steuerung verwendet werden LUV Probe.
16. Eine lineare Absorption vs Phosphorgehalt Standardkurve erzeugt und verwendet werden, um die gesamte phosph berechnenorus Inhalt und LUV-Konzentration der Proben.

3. Vorbereitung Peptide Lösungen

1. Lösen Peptid in Nanopure H ₂ O. Peptide in diesem Test verwendet, wie beschrieben muss einen Tryptophan-Rest.
2. Messen Sie die Absorption der Peptid-Lösung bei 282 nm in dreifacher Ausfertigung. Berechnen Peptidkonzentration unter Verwendung des molaren Extinktionskoeffizienten für Tryptophan von 5700 M ^-1 cm ^-1.
3. Verdünnen Peptid in Nanopure Wasser bis zu einer Endkonzentration von 30 uM. Lagerung bei -20 ° C

4. Translokation Quantifizierung

1. Bereiten Experimental-und Kontrollgruppe Proben in 1,7 ml Reaktionsgefäße. Fügen Sie genug LUVs jeder Lösung für eine endgültige Konzentration von 250 uM. Fügen Sie genug Bowman-Birk-Inhibitor-Lösung, so dass Inhibitor ist ein Endkonzentration 10x größer als die Trypsin-Konzentration. Fügen Sie genug 10 mM HEPES-Puffer für die endgültige Lösung Volumen von 450 ul zu bringen.
2. Platz 50 ul Peptid-Lösung in eine Starna micro Quarz Fluorometer Zelle. Das Verhältnis zwischen LUVs und Peptid ist hoch genug, um sicherzustellen, dass praktisch alle intakten Peptide in nahe genug Nähe zu einem Dansyl-Gruppe zu geben, ein FRET-Signal, auch wenn keiner in die Vesikel haben transloziert. Dies steht im Einklang mit dem ähnlichen FRET in der Steuerung für Peptide, und sie nicht in Vesikeln translozieren beobachtet.
3. Fügen Sie die experimentelle oder Kontrollprobe, die Peptid-Lösung in der Küvette. Dies sollte die endgültige Peptid-Konzentration bis 3 um.
4. Beginnen Sie eine 25-minütige fluoreszierende Kinetik Experiment sofort nach Zugabe von experimentellen oder Kontrolle LUV Lösung unter einem Fluoreszenz-Lektüre mindestens einmal pro Sekunde. Stellen Sie die Anregungswellenlänge bei 280 nm, die Emissionswellenlänge bei 525 nm, und die Temperatur auf 25 ° C. Mit einem Cary-Eclipse-Fluoreszenz-Spektralphotometer, setzen wir die PMT-Empfindlichkeit zu hoch.

5. Generieren eines Quantitative Translokation Verhältnis

1. Definieren Sie zunächst Fluoreszenz (F _o) wie die Fluoreszenz-Anzeige nach 15 Sekunden der Datenerhebung. In unserem Instrument Setup haben wir festgestellt, dass die ersten 15 Sekunden der Fluoreszenz gesammelten Daten unzuverlässig sind durch Mischen, Schließen der Probenkammer und andere Störungen auf das System nach Zugabe der Probe. Teilen Sie jede weitere Lesung von F _o die relative Fluoreszenz (F / F ₀₎ zu jedem Zeitpunkt zu erhalten.
2. Durchschnitt aller relativen Fluoreszenz Lesungen aus der letzten Minute des Experiments auf eine endgültige durchschnittliche relative Fluoreszenz .
3. Teilen Sie die für die Kontrollproben von der für experimentelle Proben zu erhalten, eine korrigierte endgültige Fluoreszenz-Wert.

le "> 6. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse dieses Tests für eine repräsentative Peptid, das robust Translokation zeigte. Das Signal in diesem Experiment (schwarze Kurve) zeigt einen deutlichen Rückgang in FRET-Signals über die Zeit. Allerdings ist es wichtig, für den potenziellen Verlust von FRET-Signals aufgrund unvollständiger Trypsin-Hemmung oder andere Faktoren, die nicht die Translokation Fähigkeit zu kontrollieren. Zu diesem Zweck haben wir immer auch die Messung der FRET-Signals zwischen Peptid und LUVs, die sowohl Trypsin und Bowman-Birk-Trypsin-Inhibitor (graue Kurve, Abbildung 2). In unseren Händen hat es wichtig, diese Kontrolle für jeden Peptids führen jedes Mal ein Experiment ausgeführt wird. Dies ermöglicht es uns, klar für Änderungen in Signal wegen etwaiger Differenzen zwischen Lipidvesikel Zubereitungen oder Instrument Lärm, die erheblich sein können für die relativ schwache Fluoreszenzsignale typischerweise bei diesen Konzentrationen beobachtet zu korrigieren.

Die Bedeutung der Kontrolle Erfahrungenriment mit LUVs mit Trypsin-Inhibitor wird durch die Daten in Abbildung 3 dargestellt hervorgehoben. In diesem Fall verringert das Peptid-Signal eine ähnliche Menge wie in Abbildung 2 in der experimentellen Probe (schwarze Kurve). Doch der Kontrollprobe eine schnelle Abnahme für dieses Peptid zeigt, so die Netto-Translokation ist geringer.

Abschnitt 5 unserer Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Quantifizierung Translokation aus diesem Experiment. Höhere Translokation Verhältnisse sind bezeichnend für Peptide, die effizient transloziert, die Translokation Verhältnis für die Zelle eindringende Peptid in Abbildung 2 dargestellt ist 1,16, während schwach transportiert Peptide Translokation Verhältnisse haben näher an 1. Nach unserer Erfahrung ist der Standardfehler für drei unabhängigen Experimenten mit unterschiedlichen Vesikel Vorbereitungen durchgeführt im Bereich von 0,01 bis 0,06.

Abbildung 1. Schematische Darstellung der translocatIonen-Assay. Experimental LUV Proben (A) sind mit fluoreszierenden Dansyl PAPST (schwarze Balken) dotiert und gekapselt Trypsin (Schere) enthalten. Trypsin-Inhibitor (roter Kreis) wird verwendet, um Trypsin außerhalb der LUVs hemmen. Die LUVs sind Peptid (lila) ausgesetzt. Peptide gemeinsam mit LUV Membranen ergibt sich ein FRET-Signal (grün), die als translocting Peptide Begegnung ungehemmten internen Trypsin abnimmt. Sowohl Trypsin und Trypsin-Inhibitor sind in der Steuerung gekapselt LUV Proben (B) zu einer Abnahme in FRET-Signals in keinem Zusammenhang mit Translokation zu messen.

Abbildung 2. Repräsentative Daten für eine zellpenetrierendes Peptid. Ein Vertreter translozierenden antimikrobielle pepide zeigt einen deutlichen Rückgang bei FRET-Signals im Vergleich zu ihrer Kontrolle.

Abbildung3. Repräsentative Daten unterstreichen die Bedeutung der Kontrolle. Unvollständige Hemmung der tryptischen Verdau eines nicht-translozierenden Peptid führt zu einem Rückgang der FRET-Signals über die Zeit in beiden Versuchs-und Kontrollgruppen LUV-Lösungen. Da der Unterschied zwischen der Steuerung und experimentellen Spuren relativ klein ist, ist diese Mutante als schwach translozierenden Peptid charakterisiert.

Diskussion

Das Protokoll hier vorgestellten verwendet werden, um die relative Veränderung der Konzentration von Peptiden innerhalb und außerhalb von Lipidvesikeln beurteilen. Diese Änderungen werden Translokation Fähigkeit verbunden. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Zell-penetrierende Peptide mit Potenzial als Drug-Delivery-Vektoren zu identifizieren. Da das Interesse in Zell-penetrierende Peptide wächst, wird es interessant sein zu sehen, wie Methoden, die direkt die Translokation entwickelt und in einer quantitativen A...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer
16.00 bis 18.01 Uhr PG	Avanti Polar Lipids	840457C
01.18 Dansyl PE	Avanti Polar Lipids	810330C
16.00 bis 18.01 Uhr PC	Avanti Polar Lipids	850457C
Porcine Trypsin	Sigma	T-0303
Bowman-Birk Trypsin / Chymotrypsin-Inhibitor	Sigma	T-9777
Mini-Extruder	Avanti Polar Lipids	610000
Ammoniummolybdat (para)	Alfa Aesar	10811
L-Ascorbinsäure	Sigma	A1417
Wasserstoffperoxid, 30% ige Lösung	Mallinckrodt Chemikalien	5240-05
HEPES	Sigma	H-3375
NaCl	Sigma	S-9625
EDTA	Sigma	E5134
NaH 2 PO 4	Sigma	S-0751