Mess-Peptide Translokation in große unilamellare Vesikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll Details eine Methode zur quantitativen Messung von Peptid-Translokation in große unilamellare Lipidvesikel. Diese Methode liefert auch Informationen über die Geschwindigkeit der Membran-Translokation und kann verwendet werden, um Peptide, die effizient und spontan Kreuz Lipid-Doppelschichten zu identifizieren.

Zusammenfassung

Es gibt ein aktives Interesse an Peptiden, die leicht Zellmembranen ohne die Hilfe von Zellmembran-Rezeptoren ^1. Viele von ihnen sind als Zell-penetrierende Peptide, die häufig auf ihr Potenzial als Drug-Delivery-Vektoren ^1-3 sind vermerkt bezeichnet. Darüber hinaus gibt es zunehmendes Interesse an antimikrobiellen Peptiden, die über nicht-Membran lytische Mechanismen ^4,5, insbesondere jene, die bakteriellen Membranen voraussichtlich nicht durchdringt, ohne dass Zell-Lyse und töten Zellen durch Eingriffe in intrazellulären Prozessen ^6,7 betreiben. In der Tat haben Autoren zunehmend die Beziehung zwischen zellpenetrierendes und antimikrobielle Peptide ^1,8 hingewiesen. Ein tiefgehendes Verständnis des Prozesses der Membran-Translokation und die Beziehung zwischen Peptid-Struktur und seine Fähigkeit, translozieren erfordert eine effektive und reproduzierbare Tests für die Translokation. Mehrere Gruppen haben Methoden zur Translokation in großen unilamel vorgeschlagene Maßnahmelar Lipidvesikel (LUVs) ^9-13. LUVs dienen als nützliche Modelle für bakterielle und eukaryontische Zellmembranen und sind häufig in der Peptid-Fluoreszenz-Studien ^14,15 verwendet. Hier beschreiben wir unsere Anwendung der Methode zuerst von Matsuzaki und Mitarbeiter entwickelt, um antimikrobielle Peptide, wie Magainin und Buforin II ^16,17 berücksichtigen. Neben der Bereitstellung von unserem Protokoll für diese Methode, stellen wir auch eine einfache Ansatz zur Datenanalyse, die Translokation Fähigkeit mit diesem Assay quantifiziert. Die Vorteile dieser Translokation Assay im Vergleich zu anderen sind, dass sie das Potenzial, um Informationen über die Rate der Membran Translokation bieten und erfordert nicht die Zugabe eines fluoreszierenden Markierung, die verändern Peptid Eigenschaften können ^18, an Tryptophan-haltige Peptide hat. Kurz gesagt, ist die Translokation Fähigkeit in Lipidvesikel als Funktion der Foster Resonance Energy Transfer (FRET) zwischen einheimischen Tryptophan und d gemessenansyl Phosphatidylethanolamin, wenn die Proteine ​​mit der externen assoziiert sind LUV-Membran (Abbildung 1). Cell-penetrierende Peptide gespalten werden, wie sie hemmungslos Trypsin mit dem LUVs gekapselt Begegnung führt zu Entfremdung von der LUV-Membran und einem Rückgang der FRET-Signals. Der Rückgang der FRET-Signals für eine Translokation Peptid beobachtet wird deutlich größer als die für das gleiche Peptid, wenn die LUVs sowohl Trypsin und Trypsin-Inhibitor, oder wenn ein Peptid, das nicht spontan funktioniert cross Lipidmembranen ist Trypsin-haltigen LUVs ausgesetzt enthalten beobachtet. Diese Änderung in der Fluoreszenz bietet eine direkte Quantifizierung der Peptid-Translokation über die Zeit.

Protokoll

1. Vorbereitung der große unilamellare Lipidvesikeln (LUVs)

1. Bereiten LUVs zu dienen als Zellmembran imitiert für den Test ^19.
2. Mix Phosphatidylcholin (POPC, 760,10 g / mol), Phosphatidylglycerin (POPG. 770,99 g / mol), 5-Dimethylamino-1-sulfonyl Phosphatidylethanolamin (DNS-PAPST, 994,350 g / mol) (Avanti Polar Lipids) in Chloroform in einem 50 aufgelöst : 45:5-Verhältnis. Wie in jedem Test erfordert die separate Herstellung der beiden Experimental-und Kontrollgruppe LUVs, sollten zwei Lipid-Kuchen Durchstechflaschen hergestellt werden. 0,376 mg Gesamt-Lipid (0,188 mg POPC, 0,169 mg POPG, und 0,019 mg DNS-PAPST) ist in der Regel ausreic....

Diskussion

Das Protokoll hier vorgestellten verwendet werden, um die relative Veränderung der Konzentration von Peptiden innerhalb und außerhalb von Lipidvesikeln beurteilen. Diese Änderungen werden Translokation Fähigkeit verbunden. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Zell-penetrierende Peptide mit Potenzial als Drug-Delivery-Vektoren zu identifizieren. Da das Interesse in Zell-penetrierende Peptide wächst, wird es interessant sein zu sehen, wie Methoden, die direkt die Translokation entwickelt und in einer quantitativen A.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer
16.00 bis 18.01 Uhr PG	Avanti Polar Lipids	840457C
01.18 Dansyl PE	Avanti Polar Lipids	810330C
16.00 bis 18.01 Uhr PC	Avanti Polar Lipids	850457C
Porcine Trypsin	Sigma	T-0303
Bowman-Birk Trypsin / Chymotrypsin-Inhibitor	Sigma	T-9777
Mini-Extruder	Avanti Polar Lipids	610000
Ammoniummolybdat (para)	Alfa Aesar	10811
L-Ascorbinsäure	Sigma	A1417
Wasserstoffperoxid, 30% ige Lösung	Mallinckrodt Chemikalien	5240-05
HEPES	Sigma	H-3375
NaCl	Sigma	S-9625
EDTA	Sigma	E5134
NaH 2 PO 4	Sigma	S-0751