Ein Verfahren zur Zellfusion in lebenden Organismen im Laufe der Zeit verfolgen wird beschrieben. Der Ansatz nutzt Cre- LoxP Rekombination Luciferaseexpression auf Zellfusion induzieren. Die Lumineszenz-Signal erzeugt wird, kann in lebenden Organismen mit biophotonischen Imaging-Systeme mit einer Nachweisempfindlichkeit von ~ 1.000 Zellen im peripheren Gewebe nachgewiesen werden.
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Methodenartikel
Ein Cre-Lox P Rekombination Ansatz für den Nachweis von Cell Fusion In Vivo
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Fähigkeit von zwei oder mehr Zellen des gleichen Typs zu verschmelzen hat in Metazoen im Laufe der Evolution verwendet worden, um viele komplexe Organe, einschließlich der Skelettmuskulatur, Knochen-und Plazenta bilden. Zeitgenössische Studien zeigen Fusion von Zellen des gleichen Typs verleiht erweiterte Funktion. Zum Beispiel, wenn die Trophoblastzellen der Plazenta Sicherung der Synzytiotrophoblasten Form ist die Synzytiotrophoblasten besser in der Lage, Nährstoffe und Hormone in der mütterlichen und fötalen Barriere als ungesichert Trophoblasten 1-4 transportieren. Neuere Studien zeigen, Verschmelzung von Zellen verschiedener Typen können Zellschicksal lenken. Die "Rückkehr" oder Modifikation von Zellen Schicksal durch die Fusion war einst als begrenzt an Zellkulturen. Aber das Aufkommen der Stammzelltransplantation führte zur Entdeckung von uns und anderen, dass Stammzellen mit somatischen Zellen in vivo Sicherung und dass die Fusion erleichtert Stammzell-Differenzierung 5-7. So ist Zellfusion einem geregelten Prozess capable fördern das Überleben der Zelle und die Differenzierung und somit könnte von zentraler Bedeutung für die Entwicklung, die Reparatur von Gewebe und auch die Pathogenese der Krankheit zu sein.
Die Begrenzung der Untersuchung von Zell-Fusion, ist der Mangel an geeigneten Technologien zu 1) genau zu identifizieren Fusion Produkten und zu 2) verfolgen Fusion Produkte im Laufe der Zeit. Hier präsentieren wir einen neuen Ansatz für beide Einschränkungen über die Induktion von Biolumineszenz auf Fusion (Abbildung 1)-Adresse,. Biolumineszenz mit hoher Empfindlichkeit in vivo 8-15 erkannt werden wir nutzen ein Konstrukt, das die Firefly-Luciferase (Photinus pyralis)-Gen benachbart zu ein Stop-Codon durch loxP-Sequenzen flankiert. Wenn Zellen Expression dieses Gens Sicherung mit Zellen, die Cre-Rekombinase-Protein, das loxP-Stellen gespalten werden und das Stopp-Signal wird herausgeschnitten ermöglicht die Transkription von Luciferase. Da das Signal induciBLE, ist die Inzidenz von falsch-positive Signale sehr gering. Im Gegensatz zu bestehenden Verfahren, die die Cre / loxP-Systems 16, 17 zu nutzen, haben wir eine "lebende" Erfassungssignals integriert und damit zum ersten Mal die Gelegenheit, um die Kinetik der Zellfusion in vivo verfolgen leisten.
Zur Demonstration der Vorgehensweise, Mäuse ubiquitär exprimiert die Cre-Rekombinase als Empfänger von Stammzellen mit einem Konstrukt zu Luciferase hinter einem floxed Stop-Codon ausdrückliche transfizierten serviert. Stammzellen wurden über intramyokardialen Injektion transplantiert und nach der Transplantation intravital Bildanalyse wurde durchgeführt, um die Anwesenheit von track Fusion-Produkte in das Herz und die umgebenden Gewebe im Laufe der Zeit. Dieser Ansatz könnte angepasst Zellfusion in jedem Gewebetyp analysieren in jedem Stadium der Entwicklung, Krankheit oder adultem Gewebe zu reparieren.
Protokoll
1. Donor Zelltransfektion
- Ernte-mesenchymale Stammzellen (MSCs aus H1 embryonalen Stammzellen freundlicherweise von Dr. Peyman Hematti gespendet abgeleitet, alternativ jeden Zelltyp jeder Art angenommen, dass sie in vivo-Sicherung eingesetzt werden könnten), wenn 70 bis 80% konfluent mit 1X Trypsin (Mediatech, Manassas VA) für 5 min. inaktivieren Trypsin mit α-MEM Vollmedium (Antibiotikum frei, Invitrogen, Carlsbad CA) 18. Zentrifuge bei 300 xg für 5 min.
- Sorgfältig Überstand absaugen und resuspendieren Pellet in 1 ml 1X PBS und Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers.
- Transfer 1,5 x ....
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Diskussion
Die hier beschriebene Methode ermöglicht es, zum ersten Mal, diskrete Identifikation und zeitliche Analyse von Zell-Fusion in Organismen, einschließlich der kleinen Tiere. Der Ansatz kombiniert Cre-loxP Rekombination mit anschließender biophotonischen Bildanalyse. Der Ansatz ist offen für Tracking nicht nur Zell-Zell-Fusion, sondern auch Virus-Zell-Fusion und so könnte sich als nützlich erweisen für die Verfolgung von viralen Infektionen. Die Bildanalyse ist schnell und es ist möglich, Bild mehrere kleine Tiere gleichze.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Die Autoren bedanken sich bei Dr. Peyman Hemmati (Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison) für die großzügige Bereitstellung der H1 MSCs und Dr. Tim Hacker, Dr. Gouqing Song und Frau Jill Koch von der University of Wisconsin Kardiovaskuläre Physiologie danken Core Facility für die Durchführung von Operationen mit der Maus. Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation durch eine Graduate Research Fellowship an Brian Freeman und NIH R21 HL089679 unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenz | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare |
| Neon Transfektionssystem | Invitrogen, Carlsbad, CA | MPK5000 | |
| Neon 100 ul Kit | Invitrogen, Carlsbad, CA | MPK10025 | Enthält R und E Buffer |
| a-MEM-Pulver | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12000-022 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone, Logan UT | SH30070.03 | |
| B6.C-Tg (CMV-cre) 1CGN / J | Jackson Laboratory in Bar Harbor, ME | 006054 | |
| Trypsin 10X | Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ | MT-25 bis 054-Cl | |
| L-Glutamin | Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ | 25030-081 | |
| D-Luciferin | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA | 122796 | |
| Xenogen Biophotonic Imaging System | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA | IVIS Spectrum | |
| Sodium Biocarbonate | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | S6014-500G | |
| Nicht-essentielle Aminosäuren | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11140-050 |
Referenzen
- Bernirschke, K. K. P. Pathology of the Human Placenta. , Springer. New York. (2000).
- Hoshina, M., Boothby, M., Boime, I. Cytological localization of chorionic gonadotropin alpha and placental lactogen mRNAs during development of the human placenta. J. Cell. Biol.
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Nachdrucke und Genehmigungen
