Wir haben eine Mikroverkapselung Technik als eine effektive Plattform für 3D-Vermehrung und Differenzierung embryonaler Stammzellen zu Endoderm und dopaminerge (DA) Neurone optimiert. Es bietet auch eine Chance für Immun-Isolierung von Zellen aus dem Wirt während der Transplantation. Diese Plattform kann für andere Zelltypen angepasst werden.
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Methodenartikel
Alginat-Mikrokapseln als 3D-Plattform für die Vermehrung und Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) auf verschiedenen Linien
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Menschliche embryonale Stammzellen (hES) werden als attraktive Alternative Quelle für Zellersatztherapie Schwellenländern, da sie in der Kultur erweitert werden kann, auf unbestimmte Zeit und unterschieden werden, um alle Zelltypen des Körpers. Verschiedene Arten von Biomaterialien wurden auch in Stammzellkulturen verwendet worden, um eine Mikroumgebung imitiert die Stammzellnische 1-3 bereitzustellen. Letzteres ist für die Förderung von Zelle-zu-Zell-Wechselwirkung, Zell-Proliferation und Differenzierung in spezifische Linien als auch Gewebe, unter Angabe eines dreidimensionalen (3D) Umgebung 4 wie Kapselung wichtig. Das Prinzip der Verkapselung von Zellen umfasst Einfangen von lebenden Zellen innerhalb der Grenzen der semipermeablen Membranen in 3D-Kulturen 2. Diese Membranen können für den Austausch von Nährstoffen, Sauerstoff und Impulse über die Membranen, während Antikörper und Immun-Zellen aus dem Wirt, der größer als der Kapsel Porengröße 5 sind ausgeschlossen. Hier vorab wirschickte einen Ansatz zur Kultur und zu differenzieren hESC DA-Neuronen in einer 3D-Mikroumgebung mit Alginat-Mikrokapseln. Wir haben uns verändert den Kulturbedingungen 2, um die Lebensfähigkeit der verkapselten hESC verbessern. Wir haben zuvor gezeigt, dass die Zugabe von p160-Rho-assoziierte Coiled-Coil-Kinase (ROCK)-Inhibitor, Y-27632 und menschliche fetale Fibroblast-konditionierten Mediums Serumersatz (HFF-CM) an die 3D-Plattform signifikant erhöht die Lebensfähigkeit der eingekapselten HES in dem die Zellen exprimiert endgültigen Endoderm Markergene 1. Wir haben nun diese 3D-Plattform für die Vermehrung von menschlichen embryonalen Stammzellen und effiziente Differenzierung zu DA-Neuronen verwendet. Protein-und Genexpressionsanalysen nach der letzten Stufe der DA neuronalen Differenzierung zeigte eine erhöhte Expression von Tyrosin-Hydroxylase (TH), ein Marker für die DA-Neuronen,> 100 Falten nach 2 Wochen. Wir stellten die Hypothese, dass unsere 3D-Plattform mit Alginat-Mikrokapseln kann nützlich sein, um die Proliferation zu studieren und gerichtete Differenzierungvon HES auf verschiedenen Linien. Das 3D-System erlaubt auch die Trennung von Feeder-Zellen aus hES während des Prozesses der Differenzierung und hat auch Potenzial für Immun-Isolierung während der Transplantation in der Zukunft.
Protokoll
Alle der unten beschriebenen Verfahren werden unter aseptischen Bedingungen in einer Klasse II Biosicherheitswerkbank durchgeführt. Reagenzien und Geräte verwendet werden in der untenstehenden Tabelle aufgelistet.
1. Herstellung von 1,1% Alginat (w / v)
- In 0,275 g gereinigtes Natriumalginat (high Glucuronsäure-Gehalt ≥ 60%, Viskosität> 200 mPa · s, und Endotoxin ≤ 100 EU / g) in einem sterilen 50 ml-Röhrchen und 25 ml sterilem 0,1% Gelatinelösung früheren (0,5 g hergestellt gelatin/500 ml Milli-Q-H 2 O gelöst und durch Autoklavieren).
- Vortex das Rohr für ca. 30 Sekunden, um die teilweise aufzulösen Alginatp....
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Diskussion
Mehrere Studien mit embryonalen Stammzellen der Maus und menschlichen embryonalen Stammzellen haben die Vorteile der 3D-Kultur-System in den Bereichen Biomaterialien und Tissue Engineering 2,3 demonstriert. Wir verwendeten Kalzium-Alginat-Mikrokapseln als eine geeignete Plattform, um 3D-Vermehrung und Differenzierung embryonaler Stammzellen im Vergleich zu Barium-Alginat studieren seit hESC zeigten signifikant höhere Rentabilität als in Calciumalginat als Barium-Alginat verkapselt. Diese Kultur System ermögli.......
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Offenlegungen
Wir haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Arbeit wird durch NHMRC Programm Grant # 568969 (PSS) und der Medizinischen Fakultät der University of New South Wales, Stem Cell Initiative (KSS) unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Hinweise |
| Alginat (Pronova UP MVG) | NovoMatrix | 4200101 | hohe Glucuronsäure Gehalt ≥ 60%, Viskosität> 200 mPa s, und Endotoxin <100 EU / g |
| Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| 0,9% NaCl | Baxter Healthcare | AHF7123 | |
| Typ J1 Wulst Generator | Nisco Engineering Inc | SPA-0447 | |
| Multi-Phaser Spritzenpumpe | New Era Pump Systems Inc | Modell NE-1000 | |
| Ezi-Flow-Medical-Durchflussmesser | Gascon-Systeme | G0149 | |
| Y-27632 | Merck | 688000 | |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4327-1G | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| 14G x 2 "IV-Katheter | Terumo | SR-OX1451C | |
| Knockout-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | Für SR mittel (basal) |
| Glutamax-I | Invitrogen | 35050-061 | Für SR Medium (2 mM) |
| Knockout Serumersatz | Invitrogen | 10828-028 | Für SR-Medium (20%) |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | Für SR-Medium (2,5 U / ml) |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400045 | Für SR Medium (1x) |
| β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | Für SR-Medium (0,1 mM) |
| MEM NEAA Lösung | Invitrogen | 11140-050 | Für SR Medium (5 mM) |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11710035 | Für DA neuronalen Differenzierung mittel (basal) |
| Knockout Serumersatz | Invitrogen | 10828-028 | Für DA neuronalen Differenzierung Medium (10%) |
| Natriumpyruvat | Invitrogen | 11360070 | Für DA neuronalen Differenzierung Medium (1 mM) |
| MEM NEAA Lösung | Invitrogen | 11140-050 | Für DA nEURAL Differenzierungsmedium (0,1 mM) |
| β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | Für DA neuronalen Differenzierung Medium (0,1 mM) |
| Sonic Hedgehog (SHH) | R & D Systems | 1314-SH-025/CF | Für DA neuronalen Differenzierung (100 ng / ml) |
| Fibroblasten-Wachstumsfaktor 8a (FGF8a) | R & D Systems | 4745-F8-050 | Für DA neuronalen Differenzierung (100 ng / ml) |
Referenzen
- Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm. Biomaterials. 31, 505-514 (2010).
- Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. Diffe....
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Nachdrucke und Genehmigungen
