Cultured Muskelzellen sind ein unzureichendes Modell zu rekapitulieren innervierten Muskel In-vivo-. Eine funktionale Motoreinheit reproduziert werden kann In-vitro- Durch Innervation der differenzierten humanen primären Muskelzellen mit Rattenembryo Rückenmark Explantate. Dieser Artikel beschreibt die Co-Kulturen von Rückenmark und Muskelzellen Explantate etabliert werden.
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Methodenartikel
Ein Functional Motor Unit in der Kulturschale: Co-Kultur von Spinal Cord Explantate und Muskelzellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Humane primäre Muskelzellen aneurally in Monoschicht kultiviert sich selten spontan, weil, in Abwesenheit eines Nerven-Komponente, Zelldifferenzierung begrenzt ist und Motorneuronen Stimulation fehlt 1. Diese Einschränkungen erschweren die in vitro-Studie von vielen neuromuskulären Erkrankungen in kultivierten Muskelzellen. Wichtig ist, dass die experimentellen Randbedingungen von einschichtigen, kultivierten Muskelzellen durch funktionelle Innervation der Muskelfasern mit Rückenmark Explantate in Co-Kulturen überwunden werden.
Hier zeigen wir die verschiedenen Schritte, um eine effiziente, ordnungsgemäße Innervation von humanen primären Muskelzellen erzielen, was zu Differenzierung und Kontraktion Faser nach dem Verfahren von Askanas 2 entwickelt abzuschließen. Dazu werden Muskelzellen mit Rückenmark Explantate von Rattenembryonen bei ED 13,5 co-kultiviert, mit der Spinalganglien noch an das Rückenmark Scheiben befestigt. Nach ein paar Tagen, fi der MuskelMitglieder starten zu kontrahieren und schließlich zu quergestreiften durch Innervation durch funktionelle Neuriten Projektion aus dem Rückenmark Explantate, dass zu den Muskelzellen verbinden. Diese Struktur kann für viele Monate aufrechterhalten werden, einfach durch einen regelmäßigen Austausch des Kulturmediums.
Die Anwendungen dieser sehr wertvolles Werkzeug sind zahlreich, wie es ein funktionierendes Modell für multidisziplinäre Analysen der menschlichen Entwicklung der Muskulatur und Innervation darstellt. In der Tat tritt eine komplette De-novo-neuromuskulären Synapse Installation in einer Kulturschale, so dass eine einfache Messung vieler Parameter bei jedem Schritt in einer grundlegenden und physiologischen Kontext.
Nur um ein paar Beispiele, genomische und / oder Proteom-Studien zitieren kann direkt auf die Co-Kulturen durchgeführt werden. Darüber hinaus können Vor-und postsynaptischen Effekte gezielt und separat an der neuromuskulären Synapse beurteilt werden, da beide Komponenten aus verschiedenen Spezies stammen,Ratte und Mensch, beziehungsweise. Der Nerv-Muskel-Co-Kultur kann auch mit menschlichen Muskelzellen von Patienten mit Muskel-oder neuromuskuläre Erkrankungen 3 isoliert durchgeführt werden, und kann somit als Screening-Instrument für Wirkstoffkandidaten eingesetzt werden. Schließlich wird keine spezielle Ausrüstung, sondern eine regelmäßige BSL2 erforderliche Hilfe zu einer funktionellen Einheit Motor in der Kulturschale zu reproduzieren. Diese Methode ist somit sowohl für den Muskelaufbau sowie die neuromuskuläre Forschungsgemeinschaften für physiologische und mechanistische Studien der neuromuskulären Funktion wertvoll, in einem normalen Rahmen und Krankheit.
Protokoll
1. Vorbereitung des Primary Human Muscle Cell Culture
- Stellen Sie die menschliche Muskelkraft Zellkulturen gemäß der Explantation-Re-Explantation Technik 4. Entfernen Sie zunächst nicht Muskelgewebe aus den Biopsien. Dann betten 1 mm 3 Muskel Explantate in einem Koagulum von Plasma, das Fibroblasten aus den Explantaten entstehen können.
- Die eingebetteten Explantate werden auf einem Plasma-Gelatine beschichtete Schale überführt und lassen Sie sie in normalen Nährmedium wachsen (MEM mit 25% Medium 199, 10% fötalem Rinderserum [FBS], 1% Penicillin / Streptomycin, 10 pg / ml Insulin, ergänzt 10 ng / ml humanen epidermalen Wachstumsfaktor [EGF], 12,5 ng / ml menschlichen Fibroblasten-Wachstumsfaktor [FGF]) in einer Monoschicht. Die Zellen, die aus den Explantaten entstehen unter diesen Bedingungen sind Muskelzellen. Diese Zellen werden weiter in einer Monoschicht nach dem Entfernen der Explantate wachsen.
- Kultivieren der Zellen aneurally auf 0,1% Gelatine-beschichteten Platten in normalem Wachstumsmedium. Die Zellen könnenaneurally kultiviert und verstärkt nach Bedarf. Es ist besser, Muskelzellen mit einer Passage zwischen 3 und 8 verwenden, um die Co-Kulturen durchzuführen. Es ist wichtig, junge Myotuben innervieren; nach diesem Punkt haben die Co-Kulturen ein hohes Risiko des Scheiterns. Darüber hinaus sollte Myotuben nicht zu groß und zu dick.
- Zwei Tage vor der Innervation vorgesehen ist, die Platte Muskelzellen auf 35 mm-Gewebekulturschalen (oder 6-Well-Platten) in einer Dichte von 500.000 Zellen pro Schale in normalem Wachstumsmedium. Bei dieser Dichte sind die Zellen in der richtigen Konfluenz, um die Fusion am folgenden Tag zu beginnen, und anschließende Innervation am Tag nach. Mit Hilfe dieser Voraussetzungen sind die Myotuben zum richtigen Zeitpunkt für eine optimale Innervation und damit spätere Faser Kontraktion.
- Am nächsten Tag, ersetzen Sie den normalen Nährmedium mit einer Fusion Medium MEM komponierte mit 25% Medium 199, 5% FBS, 10 pg / ml Insulin und 1% Penicillin / Streptomycin ergänzt.
2. Isolati auf der Ratte Embryonale Spinal Cord Explantate
Das gesamte Verfahren, um die Wirbelsäule zu isolieren Explantate wird unter einem binokularen Mikroskop durchgeführt, in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, Gibco / Invitrogen ref 14170) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS).
- Es ist entscheidend, dass die Ratte Embryonen sind zwischen ED 13 und 14 als eine andere Entwicklungsstufe würde das gesamte Verfahren zu gefährden. Opfere eine schwangere Frau mit CO 2 und das gesamte Embryo-Kette in HBSS Medium. Isolieren Sie jedes Embryo und enthaupten sie für Euthanasie.
- Präparieren Sie den Embryo Rückenmark vom Rest des Körpers in einem Stück zu entfernen und umliegenden Muskel-und Bindegewebe. Seien Sie sehr vorsichtig, um die hintere Wurzel Ganglien (DRGs), die an der Wirbelsäule, funktionelle Innervation gewährleisten zu halten.
- Schneiden jedes Rückenmark quer in einer Weise, dass jeder Explantat mindestens 2 DRG gebunden ist (Explantate von 1 mm 3).
- Entfernen Sie das Medium Fusion auf den Muskel-Zellkultur, so dass eine feine Schicht von Medium auf der Monoschicht.
- Legen Sie die Explantate vorsichtig auf die Muskelzelle Schicht, fünf gleichmäßig verteilte Explantate pro 35 mm Schale.
- In sehr langsam, tropfenweise, Fusion Medium auf jede Explantat. Es ist notwendig, Medium für den Muskelzellen hinzu, um zu überleben, aber nicht zu viel, damit die Explantate auf erste haften und Kontakt mit den Zellen. Wenn das Medium nicht richtig aufgenommen wird (zu stark oder zu viel Medium) werden die Explantate zu schweben und wird scheitern, die Muskelzellen zu innervieren.
- Sobald die Explantate zu haften beginnen, ganz oben auf der Fusion mittel-bis 2 ml pro 35 mm Schale, und stellte das Geschirr sehr sorgfältig zurück in den Inkubator.
4. Wartung der heterologen Nerv-Muskel-Co-Kulturen
- Ändern Sie die Fusion Medium zweimal pro Woche.
Sobald zwei Tage nach der Innervation, ist es möglich, die Neuriten, die aus jedem Explantat und der Herstellung von Kontakten mit den Muskelzellen, die von den Button-ähnliche Strukturen (Abb. 1) dargestellt zu sehen.
Bereits 4-6 Tage nach der Innervation, ein paar einzelne Fasern zur Kontraktion zu starten.
Die Wehen bestehen seit vielen Monaten, gewartet indem Sie einfach den Nährboden zweimal pro Woche.
Nach ca. 2 Wochen, degeneriert das Rückenmark Explantat selbst, sondern die Innervation konserviert ist. Das ist normal. Eine feine Schicht von Nervenzellen Komponente bleibt auf der Oberfläche der Muskelzelle Schicht. Diese Nervennetzwerk ausreichend ist, um die Funktionalität der Motoreinheit zu halten.
Wenn die Explantate im Medium der Tag nach der Innervation schweben, werden sie nie einhalten. Dies geschieht, wenn die Muskelzelle Schichtnicht ausreichend konfluent, oder wenn das Medium zu grob zugegeben. Manchmal werden die Explantat hält aber keine Neuriten hervor. Dies ist wahrscheinlich auf das Fehlen von DRG-ähnliches enthalten. In diesem Fall ebenso wird die Innervation nicht hergestellt werden. Manipulieren Sie das Geschirr sehr sorgfältig in der ersten Woche, als die Explantate noch leicht zu lösen. Um die Fusion Media tauschen, fügen Sie die Flüssigkeit tropfenweise mit einer minimalen Geschwindigkeit zu Zellablösung zu vermeiden.
Abbildung 1. Rückenmark Explantate-Muskelzelle Co-Kulturen von Tag 1 bis Tag 15.
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Diskussion
Eine physiologische In-vitro-Werkzeug, um Muskel-Zell-Funktion in normalen und pathologischen Kontext zu studieren, ist von höchstem Interesse für die myologists, weil Muskel-Zellkulturen in der Regel nicht rekapitulieren die Bedeutung der mehrere Zellen und Zell-Typ-Verbindungen. Die Zugabe von gereinigtem motorischen Neuronen zu Muskelzellen ist nicht genug, um eine funktionelle Einheit Motors zu erreichen, da die Anwesenheit von Schwann-Zellen für die Innervation effizient zu sein 5 erforderlich i...
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Offenlegungen
Wir haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Unsere Arbeit wird durch den Schweizerischen Nationalfonds (SNF), die Schweizer Initiative in Systembiologie (SystemsX.ch), der Gesellschaft für Muskelkranke USA (MDA), die Association Française contre les Myopathien (AFM), das Vereinigte Mitochondriopathie Stiftung unterstützt (UMDF), die Gebert-Rüf-Stiftung Seltene Erkrankungen Programm (GRF), der Schweizerischen Gesellschaft für Forschung der Muskelerkrankungen (SSEM / FSRMM), die Swiss Life "Jubiläumsstiftung für Volksgesundheit und medizinische Forschung", der Roche Research Foundation und der Universität Basel.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenz | Firma | Katalog-Zahl | |
| HBSS | Gibco / Invitrogen | 14170 | |
| MEM | Gibco / Invitrogen | 31095 | |
| Medium 199 | Gibco / Invitrogen | 31153 | |
| Fötalem Rinderserum | Fetal Clone Perbio | SH30066.03 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Human-EGF | Sigma | E9644 | |
| Humanen FGF | Sigma | F0291 | |
| Penicillin / Streptomycin-Lösung | Gibco | 15140 |
Referenzen
- Delaporte, C., Dautreaux, B., Fardeau, M. Human myotube differentiation in vitro in different culture conditions. Biol. Cell. 57, 17-22 (1986).
- Kobayashi, T., Askanas, V., Engel, W. K. Human muscle cultured in monolayer and cocultured with fetal rat spinal cord: importance of dorsal root ganglia for achieving successful functional innervation. J. Neurosci. 7, 3131-3141 (1987).
- Braun, S., Croizat, B., Lagrange, M. C., Warter, J. M., Poindron, P. Constitutive muscular abnormalities in culture in spinal muscular atrophy. Lancet. 345, 694-695 (1995).
- Askanas, V., Engel, W. K. A new program for investigating adult human skeletal muscle grown aneurally in tissue culture. Neurology. 25, 58-67 (1975).
- Guettier-Sigrist, S., Coupin, G., Warter, J. M., Poindron, P. Cell types required to efficiently innervate human muscle cells in vitro. Exp. Cell Res. 259, 204-212 (2000).
- Lefebvre, S. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell. 80, 155-165 (1995).
- Schrank, B. Inactivation of the survival motor neuron gene, a candidate gene for human spinal muscular atrophy, leads to massive cell death in early mouse embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 9920-9925 (1997).
- Hsieh-Li, H. M. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24, 66-70 (2000).
- Monani, U. R. The human centromeric survival motor neuron gene (SMN2) rescues embryonic lethality in Smn(-/-) mice and results in a mouse with spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 9, 333-339 (2000).
- Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Dis. Model. Mech. 4, 457-467 (2011).
- Durbeej, M., Campbell, K. P. Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models. 12, 349-361 (2002).
- Schnabel, J. Neuroscience: Standard model. Nature. 454, 682-685 (2008).
- Benatar, M. Lost in translation: treatment trials in the SOD1 mouse and in human ALS. Neurobiol. Dis. 26, 1-13 (2007).
- Dorchies, O. M. Normal innervation and differentiation of X-linked myotubular myopathy muscle cells in a nerve-muscle coculture system. Neuromuscul. Disord. 11, 736-746 (2001).
- McFerrin, J., Engel, W. K., Askanas, V. Impaired innervation of cultured human muscle overexpressing betaAPP experimentally and genetically: relevance to inclusion-body myopathies. Neuroreport. 9, 3201-3205 (1998).
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