High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Summary

Diese Methode beschreibt die Verwendung von Infrarot-Farbstoff basierende Imaging-System für den Nachweis von H1N1 in bronchioalveolar Lavage (BAL) Flüssigkeit von infizierten Mäuse mit einer hohen Empfindlichkeit. Diese Methodik in einem 96 durchgeführt werden kann - oder 384-Well-Platte, erfordert <10 ul Volumen von Testmaterial und hat das Potenzial für die gleichzeitige Screening von mehreren Erregern.

Abstract

Influenza-Virus ist ein Krankheitserreger, der Atemwege ein hohes Maß an Morbidität und Mortalität in jedem Jahr in verschiedenen Teilen der Welt verursacht. Daher ist eine genaue Diagnose des infizierenden Stammes und schnelle Hochdurchsatz-Screening einer großen Zahl von klinischen Proben ausschlaggebend für die Ausbreitung der Pandemie-Infektionen zu kontrollieren. Aktuelle klinische Diagnose von Influenza-Infektionen sind auf serologische Tests, Polymerase-Kettenreaktion, direkte Probe Immunfluoreszenz und Zellkultur ^1,2 basiert.

Hier berichten wir über die Entwicklung eines neuartigen Diagnose-Technik verwendet, um Live-Influenza-Viren zu erkennen. Wir nutzten die Maus-adaptierten menschlichen A/PR/8/34 (PR8, H1N1)-Virus ^3, um die Wirksamkeit dieser Technik unter Verwendung MDCK-Zellen ^{4 zu} testen. MDCK-Zellen (10 ⁴ oder 5 x 10 ³ pro Vertiefung) wurden in 96 kultiviert - oder 384-Well-Platten, mit PR8 und viralen Proteinen infiziert wurden unter Verwendung von anti-M2 gefolgt von einer IR-Farbstoff-konjugierten Sek.ondary antibody. M2 ⁵ und Hämagglutinin ¹ sind zwei bedeutende Marke Proteine ​​in vielen verschiedenen diagnostischen Assays verwendet. Der Einsatz IR-Farbstoff-konjugierten sekundären Antikörpern minimierte die Autofluoreszenz mit anderen fluoreszierenden Farbstoffen zugeordnet. Die Verwendung von Anti-M2-Antikörper erlaubte uns, die Antigen-spezifischen Fluoreszenzintensität als direkte Metrik von viralen Menge die verwenden. Um die Intensität der Fluoreszenz aufzählen, nutzten wir die LI-COR Odyssey IR-basierten Scanner. Dieses System verwendet zwei Kanal Laser-basierter IR-Erkennungen zu Fluorophoren identifizieren und unterscheiden sie von Hintergrundrauschen. Der erste Kanal Anregung bei 680 nm und emittiert bei 700 nm zu helfen, den Hintergrund zu quantifizieren. Der zweite Kanal erkennt Fluorophore anzuregen, dass bei 780 nm und 800 nm emittieren. Scannen von PR8-infizierten MDCK-Zellen in der IR-Scanner zeigten eine virale Titer-abhängige helle Fluoreszenz. Eine positive Korrelation der Fluoreszenzintensität zu Virustiter ab 10 ² -10 ⁵ PFU könnte conkonsequent beobachtet. Minimal, aber nachweisbare Positivität konsequent gesehen mit 10 ² -10 ³ PFU PR8 virale Titer zeigte die hohe Empfindlichkeit der Nah-IR-Farbstoffe. Das Signal-zu-Rausch-Verhältnis wurde durch Vergleich der Mock-infizierten oder Isotyp-Antikörper behandelten MDCK-Zellen bestimmt.

Mit Hilfe der Fluoreszenz-Intensitäten von 96 - oder 384-Well-Platte-Formate, konstruierten wir Standard-Titrationskurven. In diesen Rechnungen ist die erste Variable der virale Titer, während die zweite Variable ist die Fluoreszenzintensität. Deshalb nutzten wir die exponentielle Verteilung, um eine Kurve anpassbare, um das Polynom Beziehung zwischen den viralen Titer und Fluoreszenz-Intensitäten bestimmen, zu erzeugen. Zusammen schließen wir, dass IR-Farbstoff-basierten Protein Detection System kann bei der Diagnose von viralen Stämmen infiziert und genau aufzuzählen den Titer der infizierenden Erreger.

Protocol

1. MDCK-Zellen Kultur

1. Kultur 5.000.000 MDCK-Zellen über Nacht in einem T-75-cm ² Flasche in 20 ml RPMI1640 Vollmedium mit 10% FBS, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat, 5% von 7,5% Natriumbicarbonat Lösung und 0,001% β-Mercaptoethanol in einem 37 ° C Inkubator mit 5,2% CO ₂ infundiert.

2. PR8 Infektion und BAL-Flüssigkeit Sammlung

1. Herausforderung C57BL / 6 Mäusen intranasal mit 5000 PFU von PR8-Virus in sterilem PBS in einem Gesamtvolumen von 30 ul durch ein Nasenloch. Führen Sie Mock Infektionen nur mit sterilem PBS ohne Virus.
2. Einschläfern Mäuse 0, 2, 4 und 7 Tage nach der Infektion und schneiden die Brusthöhle zu öffnen und eine 1 cm lange Inzision parallel zur Luftröhre durch das Fell der Maus, um sie freizulegen.
3. Machen Sie einen Einschnitt an der Mittellinie auf dem proximalen Teil der Luftröhre.
4. Die Infusion erfolgt die Luftröhre mit 0,5 ml PBS-1% BSA und saugen Sie den BAL Flüssigkeit. BAL Fluide können in -20 ° C Gefrierschrank gelagert werden, bis verwendet.

3. Virus-Infektion und Nachweis von viralen Matrix-Protein (M2) mit dem LI-COR Odyssey

1. Um die viralen Titer unter Verwendung von Infrarot roten Farbstoff-konjugierte Antikörper quantifizieren, ernten die MDCK-Zellen aus T-75-cm ² Kolben und Platte sie in optischen flachen Boden schwarze 96-Loch (10.000 Zellen pro Vertiefung) oder 384-Well (5.000 Zellen pro Vertiefung -) Platten. Kultur die MDCK-Zellen für über Nacht bei 37 ° C in RPMI1640 Vollmedium und waschen zweimal mit Serum-freiem DMEM enthaltenden BSA (0,2%, Gewicht / Volumen), Penicillin (100 U / ml), Streptomycin (100 ug / ml), Natrium Pyruvat (1 mM), Natriumbicarbonat-Lösung (5% von 7,5%) und β-Mercaptoethanol (0,001%).
2. Inkubieren Sie die MDCK-Zellen mit BAL-Flüssigkeit (50 ul für 96-Well Platte oder 10 pl für 384-Well-Platte) oder PR8-Virus mit bekannten Titer in jede Vertiefung mit dem gleichen Volumen (50 ul für 96-Well Platte oder 10 pl für 384 - Well-Platte) von DMEM-Medium,, die L-1-tosylamido-2-phenylethyl Chlormethylketon (TPCK) Trypsin (0,2 ug / ml)-behandelt.
3. Nach 1 h der Infektion werden 100 ul (96-Well-Platte) oder 20 mu l (384-Well-Platte) von 10% FBS-haltigen RPMI1640 Vollmedium in jede Vertiefung.
4. Weiter Kultivierung MDCK-Zellen weitere 16 h der Infektion; waschen Sie die MDCK-Zellen zweimal mit 100 ul (96-Well-Platte) oder 20 mu l (384-Well-Platte) von PBS-1% BSA-Lösung und fixieren mit 100 ul (96-well Platte) oder 20 mu l (384-Well-Platte) von 1% Paraformaldehyd für 5 min.
5. Nach Fixierung, bebrüten die MDCK-Zellen weitere 30 min mit 100 ul (96-Well-Platte) oder 20 ul (384-Well-Platte) von PBS-1% BSA zum Blockieren.
6. Nach dem Blockieren bebrüten die MDCK-Zellen für 1 h mit primären Antikörper gegen M2-Protein (1:1000, verdünnt in PBS-1% BSA). Verwenden Sie 50 ul pro Well und 20 ul verdünnte Antikörper pro Well in 96-Well oder 384-Well-Platten, jeweils.
7. Waschen Sie MDCK-Zellen dreimal mit 100 ul (96-Well-Platte) Oder 20 mu l (384-Well-Platte) von PBS-1% BSA enthielt und Inkubation für 1 h mit 50 ul (96-Well-Platte) oder 20 mu l (384-Well-Platte) Ziege anti-Maus IRDye @ 800 Sekundärantikörper ( Verdünnung von 1:200).
8. Waschen Sie MDCK-Zellen dreimal mit 100 ul PBS-1% BSA enthielt. Legen Sie die gefärbten Platten auf der Lesebrille Plattform des LI-COR Odyssey IR-Scanner und stellen Sie den Leser für einen 96 - oder 384-Well-Platte lesen.
9. Blank negativen Kontrollvertiefungen kann mit dem LI-COR Odyssey Software werden. Quantifizieren ganze Platte oder ausgewählte Brunnen innerhalb Platte mit LI-COR Odyssey Software.
10. Mit Auto-Form-Werkzeug, Zeichnen Sie die Grenzen einer Zielregion (ROI) in der Mitte eines Tests auch von 96 - oder 384-Well-Platten. Erstellung von ROI ermöglicht die Software, um die definierten Hintergrund Brunnen zu den Virus-titriert Proben zu vergleichen.
11. Um den Baseline-Wert für die gesamte Assay festzulegen, verwenden Sie einen Hintergrund ROI. Führen Sie die beiden gegensätzlichen Fadenkreuz von der Odyssey-Software innerhalb der ROI zu versehen Messwieder die Intensität der Fluoreszenz über den auch.
12. Scannen Platten unter Verwendung 780 nm Kanal für Detektion und 680 nm als Referenz Wellenlänge in einem LI-COR Odyssey IR-Scanner.
13. Sobald der 'Read' Befehl aktiviert ist, wird die Fluoreszenz-Intensitäten in gleichmäßigen Abständen von der ROI messen und die erfassten Datenpunkte integriert. Eine Standardabweichung Multiplikator bestimmt den Pegel des Signals über der Grundlinie, die in der ROI-Bestimmung enthalten ist.
14. Hintergrundfluoreszenz wird von der Mock-infizierte oder sekundären Antikörper alleine steuert quantifiziert werden und wird verwendet, um die integrierte Intensität in Testschächte zu schätzen.
15. Wählen Sie 'integrierte Intensität "für Berechnungen, weil es net Pixel-Volumen für einen definierten einzelnen Punkt repräsentiert und ist unabhängig von der Strukturgröße. Verwenden Sie eine Standardkurve aus den bekannten viralen Titer, um die virale Titer von unbekannten Proben zu berechnen. Verwenden Sie eine lange Interpolationskurve genau berechnen lässt, virale Titer. Berechnen Sie die vira-Titer in der Prüflinge durch Vergleich der Intensitäten der Testproben mit der Standardkurve.

4. Repräsentative Ergebnisse

Die Standardisierung der IR-Farbstoff-basierte Hochdurchsatz-Virus-Detection System

PR8-Virus infizieren können MDCK-Zellen, daher haben wir diese Zellen, um diesen Test zu entwickeln. Wir maßen die viralen Titer unter Verwendung eines primären Antikörpers gegen ein Influenza-Virus-Matrix-Protein (M2). Im Gegensatz zu anderen Methoden, verwendeten wir ein sekundärer Antikörper, der konjugiert an ein Nah-IR-Farbstoff ist. Diese Methode stellt eine einfache, automatisierte PR8 Virustiter-Bestimmung mit Fluoreszenz-Intensität, die generiert werden beim Erkennen von M2-Protein ist. Nach Infektion mit dem Influenzavirus, wird M2-Protein übersetzt, transportiert und reichert sich in der Wirtszelle einschließlich der Zelloberfläche. Somit stellt die Menge die des M2-Proteins eine messbare Parameter, um die Menge die des Virus zu bestimmen. Vergleicht man die Intensitäten vondie Prüfmuster mit der Standardkurve bietet die präzise Messung des viralen Titer.

Um die Wirksamkeit der Fluoreszenz-Methode auf Basis der zu bestimmen, wir kultivierten 10 ⁴ MDCK Zellen / Vertiefung in der Kammer gleitet über Nacht. PR8 viralen Stammlösungen der bekannten Titern wurden hinzugefügt, um Vertiefungen mit unterschiedlichen Plaque-bildenden Einheiten (PFU) duplizieren und man ließ zu adsorbieren auf die Zellen für eine Stunde. Die Zellen wurden für 16 h inkubiert, um gestatten es dem Virus sich zu vermehren. Danach wurden die MDCK-Zellen in den Kammer-Objektträgern mit 1% Paraformaldehyd fixiert, gewaschen und mit Anti-M2-Antikörper für 1 h, gefolgt von AlexaFluor 488-konjugierten sekundären Antikörper für eine weitere 1 h. Konfokale mikroskopische Analysen der infizierten MDCK-Zellen demonstriert die anhaftende Monoschicht war weitgehend intakt und die PR8-abgeleiteten M2-Protein war reichlich vorhanden im Inneren der infizierten MDCK-Zellen (Abbildung 1A). Fluoreszierende Zellen könnten bei Infektionen mit viralen Titer so niedrig wie erkannt werden 10 ²

Deshalb, um eine genaue Schätzung virale Verfahren etablieren beschäftigten wir einen IR-Farbstoff-basierte Detektion und Quantifizierung System. MDCK-Zellen (10 ⁴ / Vertiefung) wurden in 96-Well-Platten, mit PR8 und viralen Proteinen infiziert kultiviert wurden, wurden unter Verwendung von anti-M2 durch eine IR-Farbstoff-konjugierten sekundären Antikörper gefolgt. Die Verwendung von Anti-M2-Antikörper erlaubte uns, die Antigen-spezifischen Fluoreszenzintensität als direkte Metrik von viralen Menge die verwenden. Um die Intensität der Fluoreszenz aufzählen, nutzten wir die LI-COR Odyssey IR-basierten Scanner. Dieses System nutzt zwei Laser-Kanal-based IR-Erkennungen zu identifizieren Fluorophore und unterscheiden sie von Hintergrundrauschen. Der erste Kanal Anregung bei 680 nm und emittiert bei 700 nm zu helfen, den Hintergrund zu quantifizieren. Der zweite Kanal erkennt Fluorophore anzuregen, dass bei 780 nm und 800 nm emittieren. Scannen von PR8-infizierten MDCK-Zellen im LI-COR Odyssey zeigte eine virale Titer-abhängige helle Fluoreszenz (Abbildung 1B). M2 positiven fluoreszierenden MDCK-Zellen deutlich zu erkennen waren innerhalb der Wells (Abbildung 1B). Eine positive Korrelation der Fluoreszenzintensität zu Virustiter ab 10 ² -10 ⁵ PFU konnte konsequent beachtet werden. PR8 viralen Titrationen höher als 10 ⁶ PFU führen zu einem Zelltod, die eine obere Grenze für die Empfindlichkeit des Tests legt diesen fest. Minimal, aber nachweisbare Positivität konsequent gesehen mit 10 ² -10 ³ PFU PR8 virale Titer zeigte die hohe Empfindlichkeit der Nah-IR-Farbstoffe. Das Signal-zu-Rausch-Verhältnis wurde durch Vergleichen der moc ermitteltk-infiziert oder Isotyp-Antikörper-behandelten MDCK-Zellen. Beide dieser Kontrollen führte zu vernachlässigen oder nicht nachweisbare Fluoreszenz (Abbildung 1B).

Zur weiteren Verbesserung der Empfindlichkeit und das Volumen der Testprobe zu reduzieren, infiziert wir 5 × 10 ³ MDCK Zellen / Well in 384-Well Platten. Verschiedene PFUs von PR8 wurden als serielle Verdünnungen ein Protokoll (Abbildung 1C) getestet. Detetionssensitivität von 384-Well-Platten war vergleichbar mit jener der 96-Well-Platte Assays. Sowohl 10 ¹ und 10 ² PFU arbeitete durchgängig besser in den 384-well Platten im Vergleich zu 96-well Platten. Mit Hilfe der Fluoreszenz-Intensitäten von 96 - oder 384-Well-Platte-Formate, konstruierten wir Standard-Titrationskurven (Abbildung 1D). In diesen Rechnungen ist die erste Variable der virale Titer, während die zweite Variable ist die Fluoreszenzintensität. Deshalb nutzten wir die Exponentialverteilung, um eine Kurve zu bestim-fit zu generierenine das Polynom Beziehung zwischen den viralen Titer und Fluoreszenz-Intensitäten. Wir haben auch unsere Beobachtungen validiert mithilfe einer anderen Antikörper, der gegen das Nukleoprotein (NP) der PR8-Virus (Daten nicht gezeigt) gerichtet wird. Distinct Quellen von PR8 Stämme wurden auch verwendet, um MDCK-Zellen, die mit Anti-NP-oder Anti-M2-Antikörpern (Daten nicht gezeigt) getestet wurden infizieren. Zusammen schließen wir, dass IR-Farbstoff-basierten Protein Detection System kann bei der Diagnose von viralen Stämmen infiziert und genau aufzuzählen den Titer der infizierenden Erreger.

Mathematische Überlegungen für die Berechnung der virale Titer

Die mathematischen Berechnungen der Fluoreszenzintensität und Titerbestimmungen fertig sind wie unten beschrieben. Nach der Färbung werden ganze Platte oder ausgewählte Brunnen innerhalb Platte quantifiziert mit LI-COR Odyssey Software. Mit Auto-Form-Werkzeug wurde Grenzen einer Zielregion (ROI) in der Mitte von den Testvertiefungen von 96 gezogen - oder 384-wirll Platten (Abbildung 2A und B). Erstellung von ROI ermöglicht die Software, um die definierten Hintergrund Brunnen zu den Virus-titriert Proben zu vergleichen. Ein Hintergrund-ROI wurde verwendet, um den Baseline-Wert für den gesamten Test eingestellt. Zwei gegenüberliegende Fadenkreuz (weiß) wurden innerhalb des ROI, um die Intensität der Fluoreszenz über die Vertiefung (Abbildung 2C) zu messen eingeführt. Kurven an der rechts auf dieser Seite und unterhalb der repräsentativen Vertiefungen in 2C Betreiber der Intensität der Pixel entlang dieser Fadenkreuz. Die Fluoreszenzintensitäten in gleichmäßigen Abständen des ROI wurden gemessen und die gesammelten Daten Punkte wurden integriert. Eine Standardabweichung Multiplikator bestimmt die Höhe des Signals über die Grundlinie, die in der ROI-Bestimmung aufgenommen wurde. Hintergrund Fluoreszenz wurde von der Mock-infizierten oder sekundären Antikörper allein kontrolliert quantifiziert und verwendet, um die integrierten Intensität in Testvertiefungen zu schätzen. Wir haben uns für integrierte Intensität für die Berechnungen, weil es RepressionEltern Netto Pixel Volumen für einen definierten einzelnen Spot und ist unabhängig von der Strukturgröße. Darüber hinaus ist integrierten Intensität im wesentlichen unabhängig von der Auflösung. Die Gesamtintensität / Pixels (I) entspricht der Signalintensität, die sich aus die gut in der Pixelfläche (Ist) zzgl. des Signals, die sich aus dem Hintergrund der Pixelfläche (b) ausgewählt ist. Daher ist für Pixel-'i':

I i = I s i + b i

Pixel Volumen repräsentiert sowohl die Größe des Signals und das Gebiet, in der es vertrieben wird. Steuerungsbereich wird auf die Verteilung der Probe, die Erzeugung des Signals wird Suchbegriffe. Die Pixel-Volumen ist gleich den gesamten Signal gemessen in Pixel 'i' im Bereich (a) des Pixels mal seine Höhe (I). Also für die Pixel-'i':

vi = a I i

Gesamt Pixelvolumen ist die Summe der Gesamtleistung des Signals aus der gesamten Umgebung so:

;	n		n
V =	Iv i	=	aΣI i
	i = 1		i = 1

Integrierte Intensität ist die Summe der Intensitätswerte aller Pixel, die durch Funktion eingeschlossen, durch die Fläche des Kreises / Rechteck (count mm ²⁾ multipliziert. Daher, die integrierte Intensität =

a (ΣI _i - b)

Dabei steht B für den durchschnittlichen Hintergrund Pixelintensität. Diese Formel berechnet den integrierten Signalintensitäten der Kontrolle oder dem experimentellen Brunnen und dadurch wird eine Standardkurve. Virustiter in den Proben wurden mit Hilfe dieser Standardkurve. Konzentration (der Intensität) ist als die Menge der Fluoreszenz in einem definierten ROI definiert. Die Konzentrationen in Proben sind BerechnungenTed relativ zu den definierten Konzentrationen der Standards in das gleiche Bild. Um die genaue viralen Titer zu berechnen, wird die Intensität eines jeden Konzentrationsstandard aufgetragen und mit einem langen Interpolationskurve. Die Konzentrationen der Testproben werden durch Vergleichen der Intensität der betreffenden Flächen innerhalb der Standardkurve berechnet.

Bestimmung von viralen Titer von BAL-Flüssigkeit von Influenza-infizierten Mäusen

Live-Erkennung von Influenza-Virus-Partikel in der klinischen und Laborproben ist von entscheidender Bedeutung. Deshalb haben wir untersucht, ob wir nächstes können diese Methode verwenden, um die Virus-Titer im Labor Proben zu bestimmen. BAL-Flüssigkeiten wurden aus nicht-immunisierten Mäusen gesammelt und versetzt mit einer bekannten Menge von PR8-Virus. Spiked BAL-Flüssigkeiten wurden linear zum Aufzählen der virale Titer titriert. Aliquots des beimpften BAL-Flüssigkeiten wurden verwendet, um MDCK-Zellen in 96-Well-Platten infizieren, fixiert und gefärbt mit Anti-M2 und IR-Farbstoff-konjugierten secondary-Antikörper. Ergebnisse in 3A gezeigt nachweisen, dass die viralen Titer in der dotierten BAL-Flüssigkeit nachweisbar waren und korreliert mit den PR8-Titer in der Standardkurve. Mit dem Standard-Kurve wurde präzise virale Zahlen in der versetzt und titriert BAL-Flüssigkeit quantifiziert. Exponentielle Kurvenanpassung Berechnungen lieferte ein Maß, um die virale Titer in der dotierten BAL-Flüssigkeit (Abbildung 3B) zu berechnen. Durch diese Methode erhalten wir exzellente Korrelationen zwischen den berechneten und versetzt virale Titer, Validierung dieses Ansatzes (3C).

Als nächstes analysierten wir die BAL-Flüssigkeit von PR8-infizierten Mäusen. PR8 wurde ausgiebig in Mausmodellen zur menschlichen Pathologie und antivirale Immunität ³ zu verstehen. Gruppen von Mäusen wurden intranasal mit 5.000 PFU des PR8 infiziert. Die Mäuse wurden für die Gewichtsabnahme, das Erscheinungsbild der Rundrücken, gekräuselte Fell und andere klinische Symptome überwacht. An den Tagen 0, 2, 4, 7 und 10 der nach der Infektion,Mäuse getötet und BAL-Flüssigkeiten wurden gesammelt. Um diese Laborproben zu nutzen, wurden MDCK-Zellen mit seriellen Verdünnungen von BAL-Flüssigkeit in einem Endvolumen von 50 &mgr; l für 17 h inkubiert in 96-Well-Platten. Kontrollvertiefungen der MDCK-Zellen mit bekannten Titern über diesen PR8-Virus infiziert serviert, um eine Standardkurve zu erzeugen. Nach der Infektion wurden die Zellen gewaschen, fixiert und gefärbt mit Anti-M2 primären Antikörper durch nah-IR-Farbstoff-konjugierten sekundären Antikörper gefolgt. MDCK-Zellen, die Mock-infizierte oder behandelt mit Isotypkontrollen nach der Infektion bildet den Hintergrund für die Fluoreszenz-Intensitäten Titer Berechnungen waren.

Analysen der BAL-Flüssigkeit gezeigt, dass PR8 Virus im Labor Probe wird durch die IR-Farbstoff-basierten Assay-System nachweisbar. Ein signifikanter Anstieg der Viruslast in der BAL-Flüssigkeit wurde an den Tagen 2 und 4 nach der Infektion (4A) beobachtet. Berechnungen der integrierten Intensität darauf hingewiesen, dass BAL-Flüssigkeiten von den Tagen 2 und 4 von i zu schreibennfection enthalten ein erhebliches Maß an PR8-Virus (Abbildung 4B). Unsere Ergebnisse zeigen eine allmähliche, aber signifikanten Gewichtsverlust während der frühen Phase der Infektion PR8, was die Schwere der Erkrankung. Dennoch begannen die meisten Mäuse der Genesung von Krankheitssymptomen und Gewichtszunahme 7 Tage nach der Infektion (4C). Mäuse am Tag 10 nach der Infektion nachweisbar PR8 fehlte jegliche Angabe der Clearance des Virus, die auch mit der Zunahme des Körpergewichts und erhebliche Reduzierungen der Krankheitssymptome korreliert.

Zur weiteren Erklärung die Anwendung dieses Tests, testeten wir ein 2009 A (H1N1) Influenza beim Menschen mit IR-Farbstoff-basierten Antikörper-Nachweis-System isolieren und verglichen sie mit real-time PCR-Assay. Diese klinische Probe wurde aus einem kombinierten Nasen-Rachen-/ Rachenabstrich von Patienten gewonnen Verdacht isoliert. Das Isolat wurde in MDCK-Zelllinie vermehrt an der Milwaukee Health Department Laboratory. Die Testergebnisse waren Unternehmenrot, um den Empfindlichkeit des IR-Farbstoff-basierte Methode zur Echtzeit-PCR-Assays (Abbildung 5) zu überprüfen. Die Ergebnisse zeigen, dass der IR-Farbstoff-basierten Antikörper-Nachweis System das Potenzial, Viruslast so günstig erkennen wie 10 ³ TCID ₅₀ / ml, was vergleichbar mit PCR-basierter Assay (10 KID ₅₀ / ml) und Fall ist innerhalb des klinischen Relevanz hat Bereich für die meisten Patientenproben. Diese Ergebnisse liefern starke Hinweise, dass der IR-Farbstoff-basierten Assay-System ausreichend empfindlich und Potenzial für virale Titer Aufzählung in der Forschung im Labor und im klinischen Bereich Anwendung finden soll.

Abbildung 1. IR-Farbstoff-basierte Immunsystem Nachweis von Influenzavirus. (A) Konfokale mikroskopische Analysen mit Influenza-infizierten MDCK-Zellen in 8-Well-Kammer-Objektträgern. Immunfluoreszenz mikroskopische Analysen zeigen die adhärenten MDCK-Monolayer ist weitgehend intakt und mit Virus-abgeleiteten M geladen2-Protein. (BC) Quantifizierung der viralen Titer auf IR-Farbstoff-und LI-COR Odyssey-System. (D) Generierung von Standard-Kurven und Exponentialkurve-fit-Profilen. Daten in AD präsentierte sind repräsentativ für fünf unabhängige Experimente.

Abbildung 2. Methodik der Bestimmung viraler Titer unter Verwendung IR-Farbstoffe. (A) Integrierter Fluoreszenzintensitätsmessungen. Ein definierter Bereich innerhalb des Test-Wells (ROI) wurde markiert, um die Fluoreszenz-Intensitäten zu messen. Mit Auto-Form-Werkzeug, wurden Grenzen der ROI in der Mitte von den Testvertiefungen von 96 gezogen - oder 384-Well-Platten. Die Fluoreszenz wurde als einzelne Pixel (Pixel = n) innerhalb der ROI gemessen. Integrierte Intensität ist die Summe der Intensitätswerte aller Pixel, die durch Funktion eingeschlossen, durch die Fläche des Kreises / Rechteck (count mm ²⁾ multipliziert. (B) Bestimmen der integrierten Fluoreszenz-Intensitäten in Testvertiefungen geben. Erstellung von ROIerlaubt das LI-COR-Scanner, um die definierten Hintergrund Brunnen zu den Virus-titriert Proben zu vergleichen. Hintergrund Fluoreszenz wurde von der Mock-infizierten oder sekundären Antikörper allein kontrolliert quantifiziert und verwendet, um die integrierten Intensität in Testvertiefungen zu schätzen. (C) Einholung von Datenpunkten innerhalb der ROI. Zwei gegenüberliegende Fadenkreuz (weiß) wurden innerhalb des ROI, um die Intensität der Fluoreszenz über die gut messen eingeführt. Kurven an der rechts auf dieser Seite und unterhalb der repräsentativen Vertiefungen Betreiber der Intensität der Pixel entlang dieser Fadenkreuz.

Abbildung 3. Detektion und Quantifizierung von Virustiter in PR8 Pfennigabsatz BAL-Flüssigkeiten. (A) MDCK-Zellen wurden in 96-Well Platten über Nacht und kultiviert hinzugefügt mit PR8-Pfennigabsatz BAL-Flüssigkeit. Die Platten wurden in der LI-COR Odyssey-System zu lesen. (B) Exogen Stachelwalze BAL-Flüssigkeit wurde mit Standardkurven verglichen. (C) Vergleich der Mittel zu erwartenden vir- al-Titer. Exponentielle Kurvenanpassung zur Verfügung gestellt y = 9.4784e ^0.0014x. Daten in AC vorgestellt sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente.

Abbildung 4. Detektion und Quantifizierung von Influenza-Virus in BAL-Flüssigkeiten von PR8 infizierten Mäusen. (A) Gruppen von Mäusen wurden intranasal mit 5.000 PFU des PR8 infiziert. MDCK-Zellen wurden mit seriellen Verdünnungen von BAL-Flüssigkeit in einem Endvolumen von 50 &mgr; l für 17 h in 96-Well-Platten inkubiert. Nach der Infektion wurden die Zellen gewaschen, fixiert und gefärbt mit Anti-M2 primären Antikörper, der durch IR-Farbstoff-konjugierten sekundären Antikörper gefolgt. Der ganz rechts steht für die Standardkurve. (B) Quantifizierung der viralen Titern in der BAL-Flüssigkeit von infizierten Mäusen. (C) der Gewichtsverlust der Mäuse während PR8 Infektion mit dem viralen Belastung korreliert. Daten in AC vorgestellt sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente.

RE 5 "src =" / files/ftp_upload/3623/3623fig5.jpg "/>
Abbildung 5. Nachweis und Quantifizierung von 2009 A (H1N1)-Pandemie (PDM)-Influenza aus einem menschlichen Patienten zu isolieren. (A) der IR-Farbstoff-basierten Antikörper-Fluoreszenz-System-Erkennung für Halb-fache Titration von infizierten MDCK-Zelllinie. Die Fluoreszenz-Ergebnisse zeigen, dass der Test hat das Potenzial, die Viruslast so niedrig wie 10 ³ KID ₅₀ / ml zu erkennen. (B) Nucleic Säure aus Kultur extrahiert isolieren, zusammen mit seriellen zehnfache Verdünnungen von einem bekannten Titer H1N1 Isolat wurden mit dem CDC-Echtzeit-PCR-Assay ¹² analysierten. Nachweisgrenze für real-time PCR betrug 10 KID ₅₀ / ml.

Discussion

Die jüngste Epidemie Ausbruch der Vogelgrippe in Südostasien und einer globalen Angst vor der Schweinegrippe-Pandemie zu verhängen enorme Bedenken für die öffentliche Gesundheit und Sicherheit. Kritische Schwerpunkt bei der Erzeugung von Impfstoffen für die bestehenden und neuer Stämme von Influenza-Viren gewidmet. Die Verfügbarkeit von schnellen High-Throughput-Technologien für präzise Erkennung und genaue Berechnungen Virustiter wird enorm verbessern Behandlung. Die am häufigsten verwendeten Techniken eingesetzt werden, um Virustiter zu berechnen beinhalten Plaque-bildenden und Influenza Hämagglutinationsassays. Die Plaque-bildenden-Assay wurde zunächst entwickelt, um Bakteriophagen-Titer schätzen und wurde von Renato Dulbecco angenommen zu berechnen Tier virale Titer ^4. Um diesen Test durchzuführen, werden 10-fach-Verdünnungen von Influenza lizenzfreie oder tierischen Proben, wie zB BAL-Flüssigkeit hergestellt und 0,1 ml Aliquots werden auf der Monoschicht von MDCK-Zellen inokuliert in 6-Well-Platten. Das Virus wird zur Adsorption auf die MDCK-Zellen von der Ad gefolgt erlaubtdition eines Nährmediums und Agarose. Während der Inkubation, lassen Sie die Original-infizierten Zellen virale Nachkommenschaft, die nur zu den benachbarten Zellen ausbreiten. Die zytopathogene Wirkung des Influenza-Virusinfektion produziert eine kreisförmige Zone von infizierten Zellen genannt Plaque. Jede Plakette wird vermutlich nach Infektion von einer einzigen Zelle mit einem einzigen Viruspartikel von der Replikation des Virus gebildet, gefolgt. Kontrast zwischen den lebenden Zellen und die Plaques können durch Farbstoffe wie Kristallviolett verbessert werden. Ein wesentlicher Nachteil von diesem Assay ist der Mangel an Reproduzierbarkeit und eine enorme Schwankungsbreite innerhalb Experimenten. Ein weiterer Assay verwendet, um die Influenza-Virus-Titer zu bestimmen ist die Hämagglutinationsassay. Die Hämagglutinin-Protein auf der Oberfläche des Influenzavirus effizient bindet an N-Acetylneuraminsäure-enthaltenden Proteine ​​auf Säugern und Vögeln roten Blutkörperchen ^1. Diese Wechselwirkung zwischen dem Influenza-Virus und den Erythrozyten führt zu Agglutination in der Form eines Gitters. Der level der Agglutination wird verwendet, um den Titer des Influenza-Virus in Prüfkörper zu schätzen. Erythrozyten-Agglutinations-Assay wird nur für die Titration von einem bekannten Virus zu bestimmen verwendet und kann nicht für Stammidentifizierungsnummer Zwecke verwendet werden. Da dieser Assay nicht zwischen dem Live-und den toten Viren zu unterscheiden, ist es schwierig, eine genaue Berechnung der viralen Titer zu erhalten.

Aktuelle klinische Diagnose von Influenza-Infektionen sind auf serologische Tests, Polymerase-Kettenreaktion, direkte Probe Immunfluoreszenz und Zellkultur ^1,6 basiert. Die hier beschriebene neue Verfahren hat auch klinische und labordiagnostische Potenzial. Influenza-Nachweis-Kits Directigen Flu-A (BD Biosciences, San Jose, CA) und BinaxNOW (Binax, Inc., Portland, ME) Verwendung Immunchromatographie Assay auf virales Antigen wie Nukleoprotein ⁷ zu erkennen. Unter Verwendung dieser Kits, Nachweis von Virus kann innerhalb von 15 min erreicht werden, doch, haben alle negativen Proben zur weiteren s betragencreened durch die Zellkultur-Verfahren. Verschiedene Studien haben auch geringe Empfindlichkeit dieser Kits, vor allem, wenn die Infektion mild oder niedrigen ⁸ berichtet wurde. Bei unserer Methode erkennen wir konsequent so niedrig wie 100 PFU des Virus. Dies legt nahe, unsere Technik ist hilfreich bei der Erkennung H1N1-Virus in klinischen Proben, selbst wenn die Infektion mild ist. Ein Fluoreszenz-basierte Methode zur viralen Antigene zu detektieren wurde berichtet, aus denen entweder Nasen-Rachen-Aspirat Proben direkt analysiert wurden oder wurden auf eine Monoschicht von empfänglichen Zellen zur Virusvermehrung und die anschließenden Auswertungen ⁹ inokuliert. Allerdings sind diese Methoden für diagnostische Zwecke beschränkt und eignen sich nicht für Virustiter Berechnungen. Q-PCR hilft, um das Vorhandensein von viraler RNA zu identifizieren und schätzt nicht die die Infektiosität von Lebend-Viren. Im Vergleich zu diesen Assays, wird IR-Farbstoff-basierten Assay-System in der Detektion und virale Titer-Enumeration in der klinischen und Laborproben zu helfen. Im Falle einer Grippewelle, ist esentscheidend für Tausende von Proben in einer kurzen Zeitperiode zu diagnostizieren. Unsere Methode auf einer 384-Well-Platte und IR-Scanner basieren, können 6-Platten in einer Zeit (> 2.000 Proben) zu scannen, und bietet daher einen größeren Vorteil gegenüber anderen direkten Fluoreszenz-Methoden. Machbarkeit der schnellen Verarbeitung von Tausenden von klinischen Proben könnten reduzieren Test Variabilität, Länge der Assay-Zeit und Kosten. Die Verwendung von einem M2-spezifischen Antikörper bietet den Vorteil, dass unabhängig von Belastung Unterschiede in den H und N-Proteine. Das M2-Protein ist relativ in den meisten Influenza-Stämme infizieren Menschen konserviert. Wenn Antikörper, die spezifisch an zirkulierenden Flecken mit unserem System kombiniert werden kann man messen sowohl den Titer des Virus zu identifizieren und die Belastung. Da jedoch M2 ist das Ziel für den Amantadin-ähnliche Medikamente, können Mutanten auf, die das Bindungsstelle für den hier verwendeten mAb ändern. Dies stellt eine potentielle Beschränkung für dieses System in Individuen, die durch diese Medikamente behandelt werden.

MehrereTests werden verwendet, um Influenza-Titer in Testproben aufzuzählen. Um Virustiter, 50% Gewebekultur infektiöser Dosis (TCID ₅₀₎ und Eier Allantois-Flüssigkeit-basierte Assays zu berechnen sind weit verbreitet ^1,10 verwendet. Stellen Sie jedoch Bedarf von mehreren Tagen diese Methoden weniger zuverlässig. Ferner wird in dieser Methoden Berechnungen auf 50% Veränderung in der Anzahl der Plaques Basis stellen theoretische, aber nicht genau viralen Titrationen. Plaque-bildenden Tests können innerhalb von 96 Stunden durchgeführt werden, jedoch ist mangelnde Reproduzierbarkeit ein wichtiges Anliegen der virale Titer Berechnungen. Die vorliegende Technik hier beschriebene Vorgehen hat mehrere deutliche Vorteile. Erstens ist es ein hoch reproduzierbare Technik mit konsistenten Ergebnissen führen. Zweitens Virustiter Berechnungen basieren auf einfachen Quantifizierung der Fluoreszenzintensitäten, die gegen definierte Standard-Kurven im Vergleich beruhen. Drittens kann zwei oder mehr primären Antikörper verwendet, um mehrere Serotypen in einer gegebenen Probe zu diagnostizieren. Außerdem haben IR-Farbstoff-konjugierte Antikörper minimal Autofluoreszenz und haben für Cell Imaging ¹¹ verwendet worden. UV-oder Stoss mit niedriger Energie (300-600 nM) führt zu hohen zelluläre Autofluoreszenz aufgrund der Gegenwart von hohen Quantenausbeuten nachgebenden endogener Fluorophore. Dazu gehören aromatische Aminosäuren, Lipo-Pigmente, pyridinischer Nukleotide (NADPH), Elastin, Kollagen und Flavin-Coenzymen. Diese intrinsische Eigenschaft von Zellen macht es schwierig, diese Quellen von Strahlung zu nutzen als Sonden die Expression spezifischer Proteine ​​zu quantifizieren. Im Gegensatz dazu anregen NIR-Farbstoffe und emittieren zwischen 670-1000 nm. Viele Gastgeber zellulären Molekülen und polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe nicht bei dieser Wellenlänge anregen und aufgrund der geringeren Lichtstreuung, geben extrem geringe Hintergrundfluoreszenz. Ferner wird das Fenster zwischen dem Hintergrund und spezifischen Nachweis erheblich verbessert aufgrund einer hohen Extinktionskoeffizienten der Nah-IR-Fluorophore. Photostabilität, Hervorragendes Signal-Rausch-Verhältnis, ist äußerst relevant bei der Quantifizierung der viralen Titer. Verwendung von Microfluidic Kammern wird das Screening-Verfahren durch Roboter-Steuerungen zu automatisieren, und könnten es uns ermöglichen, hoch ansteckende klinischen Proben mit Leichtigkeit zu testen. Somit ist die Nutzung der NIR-Farbstoffe in diesen Verfahren ideale und höchst zuverlässige, um virale Titer in Gewebeproben aufzuzählen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Rinderserumalbumin	Atlanta Biologicals	S11750
PR8-Virus			Von Dr. Thomas Moran M
Ziege anti-Maus-IRDye @ 800	LI-COR Biosciences	926-32210	1:200-Verdünnung
LI-COR Odyssey IR-Scanner	LI-COR Biosciences-	9201-01
384-Brunnen flache Bodenplatte	Nalge Nunc internationalen	164730
96-Brunnen flache Bodenplatte	Nalge Nunc internationalen	165305
DMEM-Medium	Invitrogen	11965126
RPMI-Medium	Invitrogen	11875135
Natriumbicarbonat	Invitrogen	25080
L-Glutamin 100x	Invitrogen	25030
Trypson-EDTA	Invitrogen	R001100
Natriumpyruvat	Invitrogen	11360070
Anti-M-2-Antikörper			Von Dr. Thomas Moran M
Anti-NP-mAb	CDC	V2S2208	Erhalten mit einem MTA