Einzel-Zell-Analyse Bacillus subtilis Biofilme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie

Summary

Mikrobielle Biofilme sind in der Regel bestehend aus Subpopulationen von spezialisierten Zellen. Einzelzell-Analyse dieser Subpopulationen setzen die Verwendung von fluoreszierenden Reporter. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu visualisieren und überwachen mehrere subpopulationswithin B. subtilis Biofilmen mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie.

Abstract

Biofilm-Bildung ist ein allgemeines Attribut auf fast allen Bakterien ^6.1. Wenn Bakterien Biofilme zu bilden, sind Zellen, in der extrazellulären Matrix, die hauptsächlich gebildet wird von Proteinen und Exopolysacchariden, neben anderen Faktoren ^7-10 umhüllt. Die mikrobielle eingeschlossen innerhalb der Biofilme häufig zeigt die Differenzierung von unterschiedlichen Subpopulation von spezialisierten Zellen ^11-17. Diese Subpopulationen koexistieren und zeigen oft räumliche und zeitliche Organisation innerhalb des Biofilms ^18-21.

Biofilm-Bildung in den Modellorganismus Bacillus subtilis erfordert die Differenzierung von Subpopulationen von spezialisierten Zellen. Unter ihnen ist die Subpopulation der Matrix Hersteller verantwortlich zu produzieren und sezernieren die extrazelluläre Matrix des Biofilms wesentlichen für die Biofilmbildung ^11,19. Daher ist die Differenzierung von Matrix-Produzenten ein Markenzeichen der Biofilmbildung bei B. subtilis.

Wir haben fluoreszierenden Reporter zur Visualisierung und Quantifizierung der Subpopulation der Matrix Produzenten in Biofilmen von B. subtilis ^15,19,22-24. Konkret haben wir beobachtet, dass die Subpopulation der Matrix Hersteller in Reaktion auf das Vorhandensein von selbst produzierten extrazelluläres Signal Surfactin ²⁵ unterscheidet. Interessanterweise wird Surfactin von einer Subpopulation von spezialisierten Zellen unterscheidet sich von der Subpopulation von Matrix ¹⁵ Herstellern produziert.

Wir haben in diesem Bericht die technischen Ansatz notwendig, visualisieren und quantifizieren die Subpopulation von Matrix-Produzenten und Surfactin Produzenten innerhalb der Biofilme von B. subtilis beschrieben. Um dies zu tun, sind fluoreszierende Reporter von Genen für Matrix-Produktion und die Produktion benötigten Surfactin in das Chromosom von B. eingefügt subtilis. Reporter werden nur in einer Subpopulation von spezialisierten Zellen exprimiert. Dann können die Subpopulationenüberwacht mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie (siehe Abb. 1).

Die Tatsache, dass unterschiedliche Subpopulationen von spezialisierten Zellen in vielzelligen Gemeinschaften von Bakterien koexistieren gibt uns eine andere Perspektive über die Regulation der Genexpression in Prokaryoten. Dieses Protokoll befasst sich mit diesem Phänomen experimentell und es kann leicht zu einer anderen Arbeits-Modell angepasst werden, um die molekularen Mechanismen der phänotypischen Heterogenität innerhalb einer mikrobiellen Gemeinschaft aufzuklären.

Protocol

1. Labeling B. subtilis und Biofilm-Assay

1. Amplify von PCR, das die Promotorregion des Gens von Interesse. Wir zeigen, wie beispielsweise das Klonen von P _Tapa, der Promotor der Gene, die für die Herstellung von Tasa Matrixprotein ^26. Klon P _Tapa in pkm008 Vektor (erstellt von der Rudner Labor, Harvard Medical School. Boston, USA) (Abb. 2).
2. Linearisieren die Plasmide durch enzymatische Verdauung (Enzyme empfohlen, XhoI).
3. Induzieren natürliche Kompetenz in B. subtilis Stamm 168, indem Sie die Ein-Schritt-Protokoll zuvor von Harwood beschrieben und Schneiden ^27.
4. Fügen Sie die linearisierten Plasmide in die Kultur der kompetenten Zellen und wählen Sie für Spectinomycin-Resistenz nach zwei Stunden Inkubation.
5. Stämme erhalten wurden, die das Konstrukt in die neutrale amyE Locus von B. eingesetzt subtilis durch doppelte Rekombination (Abb. 4). So erstellen SieDoppel-markierten Stamm, die Integration von zweiten Reporter in die neutrale Locus Laca mit dem Plasmid pDR183 stellen wir in der Abbildung 3. Fügen Sie diesen Reporter mit der gleichen Technik, die wir oben beschrieben für die Insertion von Reportern in pKM008 geklont.
6. Übertragen Sie die Reporter aus dem Stamm 168 bis NCIB3610, die in der Lage, Biofilme zu bilden. Verwenden Sie die SPP1 Phagen Transduktion Protokoll ^28,29. Grow Donorstamm in TY-Medium (LB 10 mM MgSO ₄ 10 uM MnSO _4). Mischen Sie 200 ul der Kultur mit 100 ul Phagen Lager Verdünnung. 3 ml Soft-Agar nach 30 min Inkubation und erlauben Phagen Halos entstehen bei 37 ° C
7. Sammeln Sie die Soft-Agar. Zentrifugieren es und die überstehende dachte eine Spritze 0,22 um-Filter. Mit dieser Überstand, um eine Kultur des Rezipienten-Stamm in TY-Medium zu infizieren. In 30 ul bis 10 ml Kultur 1:10 verdünnt. Inkubieren für 30 min und wählen Sie für Antibiotika-Resistenz nach 24 h Inkubation.
8. Sewählt einen geeigneten Kolonie wachsen und es über Nacht auf LB bei 37 ° C
9. Spot 3 ul der Übernachtkultur auf festen Biofilm-induzierenden Medium MSgg 1,5% Agar ^30. Willkommen Zellen während 72 Stunden bei 30 ° C (3) wachsen. Nach drei Tagen Wachstum entwickelt Biofilme auf der Oberfläche des MSgg Agar bilden einen Komplex morphologischen Architektur in der Oberfläche des Agar.

2. Biofilmdispersion und Zellfixierung

1. Entfernen Sie den Biofilm bilden die Oberfläche des MSgg Agar mit einem Zahnstocher oder einer Pinzette. Die Konsistenz des Biofilms sollte es Ihnen ermöglichen, um diese abziehen von der Oberfläche des Agars in einem Stück.
2. Setzen Sie den Biofilm in 3 ml PBS-Puffer und verteilen den Biofilm durch wiederholte Passage durch eine Pipette oder einer Nadel. Alternativ können Biofilm Dispersion erfolgt mit milden Beschallung werden. Milde Beschallung benötigt 12 Impulsen mit einer Leistung von 3 und Amplitude von 0,7 Sekunden.
3. Fix Proben vor Zell-Single-Analyse. Resuspend 300 ul der Zellsuspension in 1 ml 4% Paraformaldehyd Lösung, Inkubation bei Raumtemperatur für genau sieben Minuten.
   Zusammensetzung von 4% Paraformaldehyd-Lösung:
   2 g Paraformaldehyd
   50 ml PBS-Puffer
   4 ul 10 N NaOH
   Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22 um Filter und aliquoten
4. Waschen der Zellen nach der Fixierung in PBS-Puffer dreimal und resuspendieren ihnen in 300 ul PBS-Puffer.

3. Fluoreszenz-Mikroskopie

1. Gießen Sie 200 ul 0,8% Agarose über einen Objektträger und sorgfältig bedecken Sie es mit einer anderen Folie. Entfernen der oberen Folie sanft nach 2 Minuten, um eine Schicht von Agarose an der Folie des Bodens zu erhalten.
2. Spot 2 ul der fixierten Zellen auf der Oberfläche der Agarose-Schicht und bedecken Sie es mit einem Mikroskop Deckglas.
3. Legen Sie die Probe im Fluoreszenzmikroskop. Wir verwenden ein Fluoreszenzmikroskop Leica DMI6000B ausgestattet mit einem Leica CRT6000 iIluminatIonen-System. Die Filter sind für YFP Ex: BP500/20, Em: BP535/30 und für CFP sind Ex: BP426/20, Em: 480/40
4. Setzen Sie Ihre Probe einer Anregung Fluoreszenz zwischen 50-200 ms. Stellen Sie die Erregungsperiode gemäß einer negativen Kontrolle, die keine Fluoreszenz in den Bedingungen für das Experiment ausgewählt zeigt.
5. Siehe die Fluoreszenz Bild auf dem gleichen Bild mit hellen Feld erhalten. Zusammenführen der beiden Bilder in einem Bild. Die Ergebnisse fließen Fluoreszenz-Mikroskopie mit einem einfach markierten Stamm, der den Reporter P _Tapa-YFP in 6 dargestellt werden erhalten.

4. Die Quantifizierung einzelner Zellen mittels Durchflusszytometrie

1. Disperse die Stichprobe der fixierten Zellen mit milden Beschallung. Die Probe mit Ultraschall Durchführen 2-Serie von 12 Pulsen mit einer Leistung von 5 und Amplitude von 0,7 Sekunden, um Klumpen in einzelne Zellen zu dispergieren, ohne zur Zell-Lyse. Bestätigen Sie die Effizienz der Zelle Dispersion mittels Lichtmikroskopie.
Verdünnen der Probe 1:100 in PBS-Puffer, bevor Durchflusszytometrie-Analyse. Wir verwenden ein Durchflusszytometer BD FACS Canto II. Für YFP-Fluoreszenz, verwenden Sie einen Laser-Anregung bei 488 nm mit 530/30 Filter gekoppelt. Für GFP-Fluoreszenz, verwenden Sie den Laser-Anregung bei 405 nm mit einem 408/40 Filter gekoppelt.
2. Kalibrieren Sie das Durchflusszytometer Maschine mit zwei negativen Kontrollen. Eine Probe von PBS-Puffer ohne Zellen in Suspension sollte als Negativkontrolle für die Größe der Teilchen, erfasst durch das Durchflusszytometer zu dienen. Eine Probe ohne Fluoreszenz-Reporter markiert ist als negative Kontrolle für die Fluoreszenz-Empfindlichkeit des Durchflusszytometer dienen.
3. Legen Sie die Probe mit dem fluoreszierenden Reporter im Durchflusszytometer beschriftet. Für jede Probe zu analysieren mindestens 50.000 Ereignisse mit einer Strömungsgeschwindigkeit zwischen 300 und 3000 pro Sekunde.
4. Erfassen von Daten mittels FACS Diva Software (BD Biosciences) und analysieren sie mit Hilfe FlowJo 8.5.2 Software. Siehe Fluoreszenz-Signale an die Steuerung, die zeigen,s keine Fluoreszenz.
5. Präsentieren der Daten Überwachung der Fluoreszenz-Signal von einem einfach markierten Stammes in einem Zwei-Achsen-Grafik. Zur Erstellung der Fluoreszenzsignal in der X-Achse und der Anzahl von Zellen, die die verschiedenen Ebenen der Fluoreszenz in der Y-Achse erfaßt. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie-Analyse unter Verwendung einer einzigen markierten Stamm, der den Reporter P _Tapa-YFP in Abbildung 8 dargestellt werden erhalten.
6. Präsentieren der Daten Überwachung der Fluoreszenz-Signal von einer doppelt markierten Stamm in einem Drei-Achsen-Grafik. Zur Erstellung der Fluoreszenz-Signal von jedem der Kanäle in X und Y-Achse (beispielsweise GFP würde in der X-Achse und GFP in der Y-Achse gemessen werden) überwacht. Plot in der Z-Achse die Anzahl der Zellen, die jedes Reporterkügelchen und sie als Kontur Isolinien, die senkrecht wäre der Ebene des Papiers (Abb. 9 und 10).

4. Repräsentative Ergebnisse

Wenn B. subtilis wächst auf einem Teller des biofilm-induzierenden Medium MSgg, Biofilmbildung wird nach drei Tagen Inkubation bei ³⁰ ° C 30 beobachtet. Der Biofilm zeigt starke Kohärenz und es könnte von der Oberfläche des Mediums werden in einem Stück abgezogen werden. Darüber hinaus zeigt sich der Biofilm eine komplexe morphologische Architektur, die ein Indikator für die verschiedenen beteiligten Zell-Subpopulationen (Abb. 5) ist. Zum Beispiel wird die Produktion der extrazellulären Matrix in Biofilmen in der Bildung von Falten auf der Oberfläche der Kolonie. Diese Funktion kann mit der Differenzierung der Subpopulation von ¹⁹ Herstellern Matrix korreliert werden. In ähnlicher Weise ist die Ansammlung von Luft Strukturen auf der Oberfläche des Biofilms auf die Anwesenheit einer Subpopulation von sporenbildenden Zellen, da die Sporen in der apikalen Bereich dieser Strukturen ³⁰ lokalisiert.

Beispiele der Visualisierung von Zelldifferenzierung in einem einfach markierten und eine doppelt markierte Stamm unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie sind represented in 6 bzw. 7. Die einfach markierten Stamm birgt die fluoreszierenden Reporter P _Tapa-GFP, die in der Subpopulation von Matrix-produzierenden Zellen exprimiert wird. Diese Subpopulation ist verantwortlich zur Produktion und Sekretion der extrazellulären Matrix, die den Biofilm (6) bildet. Die Doppel-markierten Stamm birgt die Reporter P ^_Tapa-GFP-26 und die zusätzliche Reporter P _srfAA-YFP ^31. Diese zweite Reporter ermöglicht es, die Subpopulation von Zellen verantwortlich, die Signalmolekül Surfactin, was die Signalkaskade ausgelöst, um die Differenzierung der Matrix Produzenten (Abb. 7) absondern zu überwachen. Subpopulation der Matrix Produzenten sind falsch in blau gefärbten während die Subpopulation von Surfactin Produzenten falsch ist gelb gefärbt.

Durchflusszytometrie-Analyse unter Verwendung einer einzigen markierten Stamm, der Reporter P _Tapa-YFP in Abbildung 8 dargestellt. Unbehandelte Kontrollstamm nicht beherbergenkeine fluoreszierende Protein Gene zeigte eine einzelne Population niedrigen relativen Fluoreszenz. Zellen, die P _Tapa-YFP in nicht Biofilm-induzierenden Bedingungen nicht unterscheiden die Subpopulation von Matrix-Produzenten und die ganze Bevölkerung zeigten eine geringe relative Fluoreszenz. In Biofilm-induzierenden Bedingungen, kam es zu einer Subpopulation von Zellen mit einer hohen relativen Fluoreszenz beobachtet als eine Schulter auf der rechten Seite der niedrigen relativen Fluoreszenz Peak ^23.

Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie-Analyse unter Verwendung eines Doppel-markierten Stammes sind in Abbildung 9 und 10 vertreten. Abbildung 9 überwacht die Subpopulationen der Matrix Produzenten und Produzenten Surfactin mit der Doppel-markierten Stamm P _Tapa-GFP, P _srfAA-YFP. Als Kontrolle der Hintergrundfluoreszenz verwendeten wir eine Stamm nicht beherbergen keine fluoreszierende Protein Gene. Als nächstes entdeckt man jede Subpopulation von Matrix-Produzenten und Surfactin Hersteller auf jedem Kanal Fluoreszenz unter Verwendung von Ein-markierten Stamm s als Kontrollen. Die Doppel-markierten Stamm P _Tapa-GFP, P _srfAA-YFP zeigte zwei Subpopulationen von Zellen, die hohe Konzentrationen der fluoreszierenden Reporter. Jede Population wird gerahmt, die zeigen, dass es keine Überschneidungen bei der Expression der Reporter zwischen den beiden Subpopulationen von spezialisierten Zellen ^15. Ebenso Durchflusszytometrie-Analyse mit Doppel-markierten Stamm P _SKF-YFP, P _Tapa-YFP ist in Abbildung 10 dargestellt. Der Reporter-Gen für die SKF überwacht die Differenzierung der Subpopulation von Kannibalen ^32, die beschrieben worden ist, um koordinativ differenzieren mit der Subpopulation von Matrix ²⁴ Herstellern. In diesem Fall hatte die doppelt markierte Stamm eine einzelne Subpopulation von fluoreszierenden Zellen, die sowohl YFP und GFP. Dies zeigte, dass beide Wege Zelldifferenzierung koordinativ sind in der gleichen Subpopulation aktiviert.

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Abbildung 1. Insgesamt Schema des Experiments. Das Protokoll ist in drei Hauptbereiche unterteilt. Der erste Schritt erfordert die Kennzeichnung der Stamm von B. subtilis mit dem Reporter, der die Fusion Subpopulation von Interesse überwacht. Zweitens wachsen beschriftet Stämme in Biofilm-induzierenden Bedingungen. Drittens, verteilen den Biofilm und durchzuführen Single-Cell-Analyse der Population mit der Fluoreszenz-Mikroskop und Durchflusszytometrie.

Abbildung 2. Schematische Darstellung der Integration Vektor pKM008. Dieser Vektor integriert die Reporter Fusion von Interesse in der neutralen Ort amyE durch doppelte Rekombination. Der Promoter von Interesse (P _Tapa) in Vektor mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII. Dann wird die Expression des GFP-Gen unter der Kontrolle des Promotors P _Tapa. Die orientatIonen der Gene in das Plasmid wird durch einen Pfeil dargestellt.

Abbildung 3. Schematische Darstellung der Integration Vektor pDR183. Dieser Vektor integriert die Reporter Fusion von Interesse in der neutralen Ort Laca durch doppelte Rekombination. Die Fusion von Interesse (P _Tapa - GFP) ist in den Vektor mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI. Die Orientierung der Gene im Plasmid wird durch einen Pfeil dargestellt.

Abbildung 4. Schema der Integration der Reporter in das Chromosom von B. subtilis durch doppelte Rekombination. (A) B. subtilis-Chromosom besitzt zwei neutrale Loci, amyE und Laca, zu Fusionen Reporter ohne Auswirkungen auf die Entwicklung des Biofilms zu integrieren. (B) B. subtilis durch doppelte Rekombination. Der Reporter Fusion integriert in die neutrale Locus in einer stabilen Weise.

Abbildung 5. Biofilmbildung von B. subtilis NCIB3610. Prozess der bioflm Bildung des Stammes B. subtilis NCIB 3610 beim Anbau auf dem Biofilm-induzierenden Medium MSgg während der drei Tage bei 30 ° C Sequential Bilder von der Entwicklung des Biofilms wurden alle 12h genommen.

Abbildung 6. Visualisierung der Subpopulation der Matrix Produzenten unter dem Fluoreszenzmikroskop. Eine Probe aus einem Biofilm von B. subtilis P _Tapa - GFP wurde fixiert und unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht. 200 ms der FluoreszenzAnregung zeigte eine Subpopulation von Zellen emittieren höhere Fluoreszenz als der Rest der Zellen. Wir haben über diese Subpopulation als Subpopulation von Matrix-produzierenden Zellen. Maßstabsbalken ist 3 um.

Abbildung 7. Visualisierung der Subpopulation der Matrix Produzenten und Surfactin Produzenten unter dem Fluoreszenzmikroskop. Stichprobe aus einem Biofilm der B. subtilis P _Tapa-GFP, YFP-P _srfAA Doppel-markierten Stamm wurde fixiert und unter dem Fluoreszenzmikroskop. Belichtungszeit von 250 ms belegt zwei Subpopulationen von Zellen emittieren höhere Fluoreszenz als der Rest der Zellen. Eine Subpopulation exprimiert YFP und es wurde festgestellt ausschließlich unter Verwendung des YFP-Kanal (false gelb gefärbt). Dies ist die Subpopulation von Surfactin Hersteller. Eine weitere Subpopulation exprimiert GFP und es wurde ausschließlich unter Verwendung der GFP chann el. Dies ist die Subpopulation der Matrix Hersteller. Maßstabsbalken ist 3 um.

8. Die Quantifizierung der Subpopulation der Matrix Produzenten mit 2-D-Durchflusszytometrie. Verstreute Zellen aus einem Biofilm von B. subtilis P _Tapa-YFP wurden mit Hilfe der Durchflusszytometrie. Das Durchflusszytometer gezählt 50,000 Ereignisse und das Fluoreszenzsignal für jedes Ereignis überwacht wurde. Anzahl der Zellen gezählt wird in Y-Achse aufgetragen, während die Intensität von YFP-Signal in der X-Achse aufgetragen ist. Die Zellen wurden in LB-Medium nicht-induzierenden Bedingungen Biofilm zu erhalten. Die Zellen wurden in MSgg mittel-bis Biofilm-induzierenden Bedingungen zu erhalten gewachsen. Die Subpopulation von Matrix-Produzenten unterscheidet nur in Biofilm-induzierenden Bedingungen. Diese Zahl wurde von López et al angepasst., PNAS (2009) 106 :280-285.

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Abbildung 9. Quantifizierung der Subpopulation der Matrix Hersteller und Produzenten Surfactin unter Verwendung von 3-D Durchflusszytometrie. Fluoreszenzsignal der Kanäle überwacht werden in der X-Achse (YFP) und Y-Achse (GFP) dargestellt. Die Z-Achse misst die Anzahl von Zellen, die sich Reporter und wird quantifiziert als Kontur Isolinien der Ebene des Papiers senkrecht. Die Anzahl der Ereignisse in diesem Experiment beobachtet wurde 50,000 Ereignisse. Linke obere Fenster enthält eine Steuerung der Hintergrund-Fluoreszenz beherbergen keine fluoreszierende Protein Gene. Rechte obere Panel erkennt die Subpopulation von Surfactin Produzenten in der YFP-Fluoreszenz-Kanal (gerahmt in gelb) mit einem einzigen Stamm P-markierten _srfAA-YFP. Linke untere Platte erkennt die Subpopulation von Matrix-Produzenten in den GFP-Fluoreszenz-Kanal (blau umrandete Bilder) mit einem einzigen Stamm P-markierten _Tapa-GFP. Die Doppel-markierten Stamm P _Tapa </ Em>-GFP, P _srfAA-YFP ist in der rechten unteren Panel überwacht. Es zeigte zwei Subpopulationen, die in gelb und blau eingerahmt werden. Diese Zahl wurde von López et al angepasst., Genes and Development (2009) 23 :1631-1638.

Abbildung 10. Quantifizierung der Subpopulation der Matrix Hersteller und Kannibalen unter Verwendung von 3-D Durchflusszytometrie. Fluoreszenzsignal der Kanäle überwacht werden in der X-Achse (YFP) und Y-Achse (GFP) dargestellt. Die Anzahl der Ereignisse in diesem Experiment überwacht war 50,000. Rechte obere Panel erkennt die Subpopulation von Kannibalen in der YFP-Fluoreszenz-Kanal (gerahmt in gelb) in einem einzigen Stamm P-markierten _SKF-YFP. Linke untere Platte erkennt die Subpopulation von Matrix-Produzenten in den GFP-Fluoreszenz-Kanal (blau umrandete Bilder) in einem einzigen Stamm P-markierten _Tapa-GFP. Das d-markierte das Gerät auch Stamm P _Tapa-GFP, P _SKF-YFP zeigte nur eine Subpopulation von Zellen in der Diagonale auf die X-und Y-Achse (grün umrahmt). Diese Subpopulation ist in der YFP-und CFP-Kanal erkannt, weil es die zwei Reporter gleichzeitig drückt. López et al., Genes and Development (2009) 23 :1631-1638.

Discussion

Die Tatsache, dass bakterielle Gemeinschaften Subpopulationen von Zellen, die bestimmte Gruppe von Genen, beweist die Komplexität mikrobieller Gemeinschaften ^33,34 zeigen. Dieses Protokoll soll helfen, festzustellen, ob die Expression eines beliebigen Gens von Interesse für eine bestimmte Subpopulation von spezialisierten Zellen innerhalb der mikrobiellen Gemeinschaft beschränkt. Die Visualisierung dieser Subpopulationen erfordert die Entwicklung neuer Techniken, da herkömmliche Methoden Genexpression oder Mi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Technik	Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer
MSgg Zusammensetzung	5 mM Kaliumphosphat	Roth	6878
	100 mM MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
	2 mM Magnesiumchlorid	Roth	2189,1
	Calciumchlorid 700μM	Roth	A119.1
	Eisenchlorid 50 uM	Sigma-Aldrich	157740
	Zinkchlorid 1 &mgr; M	Applichem	A2076
	Thiamin 2 &mgr; m	Sigma-Aldrich	74625
	Glycerin 0,5%	Roth	7533
	GlutaMate 0,5%	Sigma-Aldrich	49621
	Tryptophan 50μg/ml	Sigma-Aldrich	T0254
	Phenylalanin 50μg/ml	Sigma-Aldrich	P2126
Zellfixierung	Paraformaldehyd	Roth	0335
	Bezeichnung des Geräts	Firma	Katalog-Nummer
Ultraschallbehandlung	Zelle Sonicator	Bandelin	D-1000
Fluoreszenz-Mikroskopie	Fluoreszenz-Mikroskop	Leica	DMI6000B
	Name der Software	Firma	Katalog-Zahl
Fluoreszenz-Mikroskopie	Asaf	Leica
Die Durchflusszytometrie	FCASDiva	BD
Die Durchflusszytometrie	FlowJo	Treestar