Methodenartikel

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektoren für die Gentherapie über DNA-Familie Shuffling

DOI:

10.3791/3819

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2. April 2012

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1Cluster of Excellence CellNetworks, Department of Infectious Diseases, Virology, Heidelberg University, 2Department of Infectious Diseases, Virology, Heidelberg University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir zeigen die grundlegende Technik zur molekularen konstruieren und zu entwickeln synthetischen Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren für die Gentherapie durch DNA-Shuffling Familie. Darüber hinaus bieten wir allgemeine Richtlinien und repräsentative Beispiele für die Auswahl und Analyse der einzelnen chimären Kapside mit verbesserten Eigenschaften auf Ziel-Zellen in Kultur oder in der Maus.

Zusammenfassung

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Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren repräsentieren einige der stärksten und viel versprechende therapeutische Fahrzeuge für die menschliche Gen-Transfer aufgrund einer einzigartigen Kombination von positiven Eigenschaften ein. Dazu gehören die Apathogenität der zugrunde liegenden Wildtyp Viren und hochentwickelte Methoden zur Herstellung von hohem Titer, hoher Reinheit und klinisch-Klasse rekombinanten Vektoren 2. Ein weiterer besonderer Vorteil des AAV-Systems gegenüber anderen Viren ist die Verfügbarkeit von einer Vielzahl von natürlich vorkommenden Serotypen, die in wesentlichen Eigenschaften unterscheiden sich noch, lassen sich bequem als Vektoren mit Hilfe eines gemeinsamen Protokolls 1,2 konstruiert werden. Darüber hinaus wurden eine Reihe von Gruppen, einschließlich unserer eigenen kürzlich Strategien, um diese natürlichen Viren als Vorlagen für die Erstellung von synthetischen Vektoren, die entweder vereinen die Vorzüge von mehreren Input-Serotypen, oder durch die der Eigenschaften eines einzelnen isolieren verwenden ausgedacht. Die entsprechenden Technologien, um diese Ziele zu erreichen are Familie entweder DNA shuffling 3, dh Fragmentierung der verschiedenen AAV-Kapsid Gene durch ihre erneute Montage auf partielle Homologien (typischerweise> 80% für die meisten AAV-Serotypen) oder Peptid-Display 4,5, dh Einfügen von in der Regel sieben Aminosäuren in der Basis gefolgt eine freiliegende Schleife des viralen Kapsids wobei das Peptid im Idealfall vermittelt wieder Ausrichtung auf einen gewünschten Zelltyp. Für maximalen Erfolg, sind beide Methoden in einem High-Throughput-Mode, wobei die Protokolle werden hochskaliert, um Bibliotheken von rund einer Million verschiedene Varianten ergeben Kapsid angewendet. Jeder Klon wird dann aus einer einzigartigen Kombination von zahlreichen elterliche Viren (DNA-Shuffling-Ansatz) umfasst oder enthält einen unverwechselbaren Peptids innerhalb der gleichen viralen Rückgrat (Peptid-Display-Ansatz). In der abschließenden Schritt ist iterativen Auswahl einer solchen Bibliothek auf Zielzellen, um für einzelne Kapside erfüllen die meisten oder am besten alle Anforderungen des Auswahlverfahrens zu bereichern. Die letztere vorzugsweise Kammines Überdruck, wie Wachstum auf einem bestimmten Zelltyp von Interesse, mit negativer Selektion, zum Beispiel Beseitigung aller Kapside Umsetzung mit Anti-AAV Antikörper. Diese Kombination erhöht die Chancen, dass synthetische Kapside überlebenden die Auswahl die Bedürfnisse der jeweiligen Anwendung, in einer Weise, die wahrscheinlich nicht in jeder beliebigen natürlich vorkommenden AAV isolieren gefunden übereinstimmen. Hier konzentrieren wir uns auf die DNA-Familie schlurfenden Methode als theoretisch und experimentell schwierigere der beiden Technologien. Wir beschreiben und zeigen alle wesentlichen Schritte für die Erzeugung und Auswahl von neu gemischt AAV-Bibliotheken (Abb. 1), und dann besprechen die Fallstricke und kritische Aspekte der Protokolle, die man braucht, um sich bewusst sein, um mit molekularen Evolution AAV erfolgreich zu sein.

Protokoll

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1. Herstellung von Plasmid-Sets Encoding AAV-Kapsidgene

  1. Um die routinemäßige Herstellung ausreichender Mengen der verschiedenen AAV-Kapsid (Cap)-Gene für die nachfolgende DNA-Shuffling zu erleichtern, zunächst subklonieren diese Gene in einer gemeinsamen Plasmidrückgrat. Es ist wichtig, identische flankierende Sequenzen von> 20 Nukleotiden, die für die spätere Verwendung als Primer-Bindungsstellen für verschachtelte PCR und für die Klonierung (2) umfassen.
  2. Unter Verwendung geeigneter Primer (siehe Tabelle für beispielhafte Primer für AAV5), verstärken PCR gewünscht cap-Gene von AAV-Plasmiden allgemein verfügbar,....

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Diskussion

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Hier haben wir wesentliche experimentelle Schritte und Richtlinien für die AAV-Kapsid Engineering über DNA-Shuffling und Familie für die Evolution in Zellen oder Tiere dargestellt. Im Wesentlichen sind diese Protokolle standardisierte Versionen der Verfahren, die wir zunächst innerhalb der AAV-Bereich berichtet in 2008 3. Während eine Flut von Follow-up-Studien von anderen zahlreichen Modifikationen zB 10-13 berichtet haben, stellen unsere gegenwärtigen Versionen grundlegende Strategien Na.......

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Offenlegungen

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Alle Autoren erklären, dass sie nichts zu offenbaren haben.

Danksagungen

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Die Autoren danken für herausragende Unterstützung ihrer Labor-, Team-Mitglieder und Arbeit des Exzellenzclusters CellNetworks an der Universität Heidelberg sowie von der Chica und Heinz Schaller (CHS) Fundament. Wir schätzen, dass die molekulare Evolution über AAV DNA shuffling Familie hat sich ein sehr aktives Gebiet seit unserer ersten Veröffentlichung vor drei Jahren und so allen Autoren einschlägiger Publikationen, deren Arbeit nicht hier aus Platzgründen zitiert werden entschuldigen.

....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Name des Reagenzes Firma Katalog-Nummer
DNase I Invitrogen 18068-015
Polyethylenimin (PEI) Sigma-Aldrich 408727
Restriktionsenzyme NEB Verschiedene
T4 DNA-Ligase NEB M0202T
Gelextraktionskit Qiagen 28704
Phusion Polymerase II Kit Finnzymes (NEB) F-540S
HotStar Hifi-Polymerase-Kit Qiagen 202602
DMSO Finnzymes (NEB) F-540S (Teil-Kit)
EDTA (25 mM) Invitrogen 18068-015 (Teil-Kit)
Tris Roth 4855,2
Ampicilin Natriumsalz Roth K029.2
dNTPs (10 mM, 100 ul) Invitrogen 18427013
Iodixanol (Optiprep) Axis-Shield 1114739
Phenolrot Merck 107241
Plasmid Mega Prep Kit Qiagen 12181
Ultrazentrifugation Beckman-Coulter Optima L90K
Quick-Seal Zentrifugenröhrchen Beckman-Coulter 342414
Die Elektroporation Einheit Bio-Rad GenePulserXcell
Thermocycler Eppendorf Vapo Protect
Heizblock BIOER MB-102
Fluoreszenzmikroskop Olymp IX81
FACS-Analyser Beckman-Coulter Cytomics FC500 MLP
MEGAX DH10B T1R Zellen Invitrogen C640003
Benzonase Merck 101695
Adenovirus-5 ATCC VR-5
pBluescript II KS (+)-Plasmid Stratagene 212207
cap5F (Pac I-Stelle in gelb, CAP5-spezifische Sequenzen in Fettdruck):
GACTCTTAATTAACAGGT ATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC 		IDTDNA Benutzerdefinierte Primer
cap5R (Asc I-Stelle in Grün, CAP5-spezifische Sequenzen in Fettdruck):
GTGAGGGCGCGCC TTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC 		IDTDNA Benutzerdefinierte Primer

Referenzen

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  1. Grimm, D., Kay, M. A. From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy. Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).
  2. Grimm, D.

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Schlagwörter

Synthetische AAV VektorenCapsid EngineeringHerstellung viraler BibliothekenPlasmidbibliothekPCR Amplifikationvirale Capsid SelektionReportergenexpressionWestern Blot

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