Kultivierung humaner neuronaler Vorläuferzellen in einer 3-dimensionalen Self-Montage Peptide Hydrogel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Verwendung eines sich selbst organisierenden 3-dimensionalen Gerüst zur Kultur humaner neuraler Vorläuferzellen. Wir präsentieren ein Protokoll, um die Zellen aus dem Gerüste Freisetzung analysiert anschließend zB mittels Durchflusszytometrie werden. Dieses Protokoll kann zu anderen Zelltypen angepasst werden, um detaillierte mechanistisch Studien durchzuführen.

Zusammenfassung

Der Einfluss von 3-dimensionalen (3D) Gerüste auf Wachstum, Proliferation und schließlich neuronale Differenzierung ist von großem Interesse, um neue Methoden für die zellbasierte und standardisierte Therapien bei neurologischen Erkrankungen oder neurodegenerativen Erkrankungen zu finden. 3D-Strukturen sollen ein Umfeld viel näher liefern, um die in vivo Situation als 2D-Kulturen. Im Rahmen der regenerativen Medizin, hält die Kombination von Biomaterial Gerüste mit neuralen Stamm-und Vorläuferzellen großes Versprechen als therapeutisches Werkzeug. ^1-5 Kultur-Systemen emuliert eine dreidimensionale Umgebung haben gezeigt, dass die Proliferation und Differenzierung in verschiedene Arten von Stammzellen beeinflussen und Vorläuferzellen. Hierbei wird die Bildung und Funktionalisierung der 3D-Mikroumgebung wichtig für das Überleben und das Schicksal der eingebetteten Zellen zu bestimmen. ^6-8 Hier haben wir PuraMatrix ^9,10 (RADA16, PM), ein Peptid Hydrogel Gerüst,die ist gut beschrieben und verwendet werden, um den Einfluss einer 3D-Umgebung auf verschiedenen Zelltypen zu untersuchen. ^7,11-14 PuraMatrix kann leicht angepasst werden und das synthetische Herstellung der Nano-Fasern bietet eine 3D-Kultursystem von hoher Zuverlässigkeit, die wird zusätzlich xeno-frei.

Vor kurzem haben wir den Einfluss der PM-Konzentration auf die Bildung des Gerüstes untersucht. ¹³ In dieser Studie verwendeten Konzentrationen von PM hatten einen direkten Einfluss auf die Bildung der 3D-Struktur, die durch Rasterkraftmikroskopie nachgewiesen wurde. Eine anschließende Analyse der Überleben und die Differenzierung der hNPCs zeigte einen Einfluss der verwendeten Konzentrationen von PM auf das Schicksal der eingebetteten Zellen. Allerdings zeigt die Analyse des Überlebens oder der neuronalen Differenzierung durch Immunfluoreszenztechniken besitzen einige Hürden. Um sich verlässliche Daten, muss man die Gesamtzahl der Zellen in einer Matrix zu bestimmen, um die relative Anzahl von z. B. erhalten. neuronalen Zellen durch βIII-Tubulin markiert. Diese Voraussetzungen eine Technik, um die Gerüste in allen 3-Dimensionen mit einem konfokalen Mikroskop oder eine vergleichbare Technik wie Fluoreszenz-Mikroskope in der Lage, Z-Stapel von der Probe zu analysieren. Des Weiteren wird diese Art der Analyse ist extrem zeitaufwendig.

Hier zeigen wir eine Methode, um Zellen aus dem 3D-Gerüste für die spätere Analyse zB mittels Durchflusszytometrie freizugeben. In diesem Protokoll menschliche neurale Vorläuferzellen (hNPCs) der ReNcell VM-Zelllinie (Millipore USA) wurden kultiviert und differenziert in 3D-Gerüsten aus PuraMatrix (PM) oder PuraMatrix mit Laminin (PML) ergänzt. In unseren Händen ein PM-Konzentration von 0,25% war optimal für die Kultivierung der Zellen ^13, aber die Konzentration auf andere Zelltypen können angepasst werden. ¹² Die freigesetzten Zellen können zB immunzytochemische Studien eingesetzt werden und anschließend mittels Durchflusszytometrie analysiert. Dies beschleunigt die Analyse und more über die gewonnenen Daten beruhen auf einer breiteren Basis, die Verbesserung der Zuverlässigkeit der Daten.

Protokoll

1. Teil 1: Culture of hNPCs in PuraMatrix

1. Im Vorfeld der Erstellung eines Gerüsts mit einem PuraMatrix Konzentration von 0,25% ohne Laminin man braucht, um die folgenden Lösungen vorbereitet
2. Bereiten Sie eine Lösung mit 20% Saccharose und eine Lösung mit 10% Saccharose in sterilem destilliertem Wasser gelöst.
3. Für Lösung 1 Mix 120 ul der 20% Saccharose-Lösung mit 120 ul destilliertem Wasser in einem 1,5 ml konischen Röhrchen.
4. Für Lösung 2 mischen 60 ul der PuraMatrix Lösung mit 60 ul 20% Saccharose-Lösung in ein 1,5 ml konischen Röhrchen.

Bei einer Zubereitung, der ein Gerüst mit einem PuraMatrix Konzentration von 0,25% mit Laminin (8 g pro 100 ul Matrix) braucht man ergänzt um folgende Lösungen herzustellen.

1. Für Lösung 1 Mix 72 ul destilliertem Wasser mit 120 ul 20% Saccharose-Lösung und 48 ul Laminin in einem 1,5 ml konischen Röhrchen.
2. Für Lösung 2 mischen 60 ul PuraMatrix Lösung mit 60 ul der 20% Saccharose-Lösung in ein 1,5 ml konischen Röhrchen.

5. Für die Einbettung der Zellen in der PuraMatrix bereiten ein 4-Well-Zellkultur-Platte und legen Sie eine sterilisierte Deckglas (Durchmesser 13 mm) in zwei Brunnen. Bewahren Sie die Platte in der sauberen Bank für die spätere Verwendung. Glasdeckgläschen sind nur für die immunzytochemische Studien verwendet. Wenn keine immunzytochemische Färbungen bestimmt sind, kann der Schritt übersprungen werden.

Zur Vorbereitung der hNPCs für die Verkapselung in 3D Gerüste, muss man die folgenden Lösungen herzustellen. Verdünnen Sie die Benzonase in der Trypsin / EDTA-Lösung, mit einem Verdünnungsfaktor von 1:10.000. Für eine Trypsin-Inhibitor/Benzonase Lösung zu mischen: DMEM/F12 + Benzonase 25U/μl + 1% HSA + Trypsin-Inhibitor (0,5-Promillegrenze).

6. Lösen Sie die Zellen durch Zugabe von 500 ul Trypsin / Benzonase-Lösung und Inkubation für 5 min in einem Inkubator (37 ° C, 5% CO ₂₎. Stoppen Sie die Reaktion mit Trypsin-Inhibitor/Benzonase Lösung. Anschließend Zentrifuge der abgelösten Zellen für 5 min bei 3000 x g. Wash-Zellen mit 5 ml 10% Saccharose-Lösung und Zentrifuge wieder. Überstand verwerfen.
7. Resuspendieren der Zellen in 10% Saccharose-Lösung sollte die endgültige Zelle Lösung enthalten 1x10 ⁶ Zellen / ml.

Die nächsten Schritte, 1,8 bis 1,11, sollte so schnell wie möglich erfolgen, da der niedrige pH-Wert des PuraMatrix Lösung, die schädlich für die Zellen könnten.

8. Mix 60 ul Zellsuspension mit Lösung 1.
9. Add 120 ul Lösung 1, die die Zellen enthält, die konische Röhrchen mit Lösung 2 und vorsichtig mischen.
10. Platz 100 ul der Mischung sofort auf jedem Deckgläschen in der 4-Well-Platte residierte.
11. Fügen Sie langsam 200 ul Zellkulturmedium pro Vertiefung und nach 2-3 Minuten weitere 200 ul. Dies wird zu initiieren die Selbstorganisation der Matrix.
12. Inkubieren cEllen bei 37 ° C, für 1 Stunde in der Sterilbank auf einer Heizplatte oder die beheizte Fläche Ihres Sterilbank. So weit wie möglich bewegen sich nicht die Platte, da dies die Montage der Matrizen schaden könnte.
13. Entfernen Sie die meisten der mittel-, aber nicht alle, zur Vermeidung der Matrizen fallen trocken, mit einem 1000 ul Pipette. Add 500 ul Medium, um Matrizen für 10 min waschen. Schließlich entfernen Sie das Medium, und fügen Sie 500 ul frisches Medium und Ort der Kultur Platte in einem Inkubator (37 ° C, 5% CO _2). Da die Matrizen sind empfindlich gegen Stöße der Platten so wenig wie möglich bewegt werden sollte und gespeichert, wenn möglich, in einem separaten Brutschrank.
14. Die hier verwendete hNPCs wurden 7 Tage in der 3D-Gerüste vermehrt und Differenzierung wurde durch Rücknahme des Wachstums Faktoren ¹³ eingeleitet. Das Medium wurde alle 2-3 Tage gewechselt.

2. Teil 2: immunzytochemische Färbung des ganzen Matrizen

1. Im Vorfeld der Färbung muss man vorbereiten: abVerriegelung Pufferlösung bestehend aus 5% normalem Ziegenserum und 0,3% Triton X-100 in PBS gelöst, ein 4% Paraformaldehyd-Lösung auf 0,1 M PBS basiert und bei Bedarf eine Lösung mit 4 ',6-Diamidin-2'-phenylindoldihydrochlorid ( DAPI) für eine Kerne Färbung mit 100 ng DAPI / ml in PBS gelöst. Die Proben wurden mit einer Mischung aus Mowiol und DABCO montiert.
2. Zum Waschen der Matrizen entfernen das Medium mit einem 1000 ul Pipette und waschen Sie die Gerüste mit PBS einmal für 5 Minuten.
3. Zur Befestigung der Gerüste entfernen Sie die PBS und fügen 400 ul von Paraformaldehyd (4% in 0,1 M PBS) in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Matrizen für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Feste Gerüste können in PBS gelagert werden ergänzt mit 0,02% NaN ₃ bei 4 ° C für mehrere Wochen bis zu mehreren Monaten.
4. Im Vorfeld einer Färbung waschen die Gerüste mit PBS für 5 Minuten.
5. Inkubieren Sie die Gerüste in Blocking-Puffer-Lösung. Blocking-Lösung wurde dreimal alle 2-3 Stunden und subsequ verändertently Gerüste wurden in Blocking-Lösung über Nacht bei 4 ° C.
6. Entfernen Sie die Blocking-Puffer-Lösung und fügen Sie den Primärantikörper in PBS gelöst mit 1% normalem Ziegenserum ergänzt und inkubieren Sie die Matrizen über Nacht bei 4 ° C.
7. Entfernen Sie den primären Antikörper-Lösung und waschen Gerüste 4-mal für 2 h und anschließend über Nacht bei 4 ° C mit PBS.
8. Entfernen Sie die PBS und fügen Sie die Lösung mit dem sekundären Antikörper, in PBS gelöst ergänzt mit 1% normalem Ziegenserum, für 4 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
9. Waschen Sie die Proben mit PBS 4-6 mal für 1 h und anschließend über Nacht bei 4 ° C im Dunkeln.
10. Für eine Kerne Färbung kann man hinzufügen, 400 ul der DAPI-Lösung für 30 min.
11. Um die Proben braucht man Objektträger montieren. Dann werden 50 ul Mowiol / Dabco auf dem Objektträger. Entfernen Sie den Deckel rutscht von der 4-Well-Platte und legte sie vorsichtig auf die Montage Medium.
12. Hier verwendeten wir eine Biozero 8000Mikroskop (Keyence, Deutschland, Karlsruhe) zu erhalten einzelnen Aufnahmen und z-Stacks. Jeder Stapel enthält 30 einzelne Bilder mit einem Abstand von 1-2 um. Mit Hilfe der entsprechenden Analyse-Software der Unschärfe eigen Fluoreszenz wurde vor vollen Projektionen der z-Stacks produziert wurden entfernt.

3. Teil 3: Release des hNPCs aus der Gerüste für Durchflusszytometrie

1. Im Vorfeld der Veröffentlichung der Zellen von Gerüsten waschen die Gerüste mit 500 ul HBSS.
2. Übertragen Sie die Gerüste durch eine 1000 ul Pipette auf eine 15 ml konischen Röhrchen mit Zellkulturmedium.
3. Um stören die Gerüste mechanisch resuspendieren der Zelle Lösung mehrmals mit einem 1000 ul Pipette und anschließend zentrifugiert die Lösung bei 3000 xg für 5 min.
4. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette 500 ul Trypsin / Benzonase Lösung und Zellpellet mehrmals.
5. Inkubieren Sie die Zellen für 5 minbei 37 ° C in der Trypsin / Benzonase Lösung. Zum Stoppen der Reaktion mit 1 ml Trypsin-inhibitor/Benzonase Lösung und Pipette nach oben und unten mehrere Male.
6. Centrifuge die Zellsuspension 5 min bei 3000 xg, entfernen Sie den Überstand und die Zellen mit 2 ml HBSS-Puffer. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Dieses Verfahren wird entfernen Matrix Schutt.
7. Pass der Zellsuspension Lösung Trog einer Zelle Sieb (Porengröße 70 um), um Aggregate zu entfernen und sammeln Sie die Zellen in Zellkulturmedium. Die erhaltenen Zellen können ausgesät wieder auf Deckgläsern für funktionelle Studien als Patch-Clamp-oder fluometric Messungen z. B. werden. Zur Bearbeitung der Zellen für die Durchflusszytometrie, fixieren die Zellen sofort (siehe 4.1).

4. Teil 4: Quantifizierung von βIII-Tubulin-positiven Zellen mittels Durchflusszytometrie

1. Fix die freigesetzten Zellen in Schritt 3.7 mit 1% PFA erhalten für 15 min bei Raumtemperatur.
2. Centrifuge die Zellsuspension für 5 min bei 3000 xg und Entfernene der Überstand. Falls erforderlich, können die Zellen bereit, bei 4 ° C für eine spätere Analyse gespeichert werden. Deshalb die Zellen in Waschpuffer (PBS mit 0,5% BSA und 0,02% Na-Azid ergänzt).
3. Um mit der Vorbereitung für die Durchflusszytometrie, Zentrifuge die Zellsuspension für 10 min bei 350 xg, Überstand verwerfen und Zellen in 25 ul der Antikörper-Lösung. Daher ist der erste Antikörper wird mit Saponin-Puffer in einer Konzentration 1:100 zB βIII-Tubulin gemischt. Die Saponin-Puffer besteht aus PBS mit einem Saponin-Konzentration von 0,5%, einer BSA-Konzentration von 0,5% und einem Na-Azid-Konzentration von 0,02%.
4. Inkubieren Sie die Zellsuspension mit dem ersten Antikörper für 2 h bei Raumtemperatur auf einem Schüttler. Als Negativ-Kontrolle vorzubereiten einer Probe ohne den ersten Antikörper.
5. Zum ersten Waschschritt add 300 pl Saponin-Puffer direkt auf die Zellen. Centrifuge die Zellsuspension für 5 min bei 350 x g. Für den zweiten Waschschritt verwerfenÜberstand, zusätzlich 300 ul Puffer und zentrifugieren die Zellsuspension für 5 min bei 350 x g.
6. Entfernen Sie den Überstand und 25 ul Lösung mit dem sekundären Antikörper (zB Alexa Fluor 647, 1:1000, gelöst in Saponin-Puffer). Inkubieren Zellen mit dem sekundären Antikörper 1h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
7. Zum ersten Waschschritt add 300 pl Saponin-Puffer direkt auf die Zellen. Centrifuge die Zellsuspension für 5 min bei 350 x g. Für den zweiten Waschschritt den Überstand verwerfen, zusätzlich 300 ul Puffer und zentrifugieren die Zellsuspension für 5 min bei 350 x g.
8. Überstand verwerfen und Zellen in 500 ul Waschpuffer für die Durchflusszytometrie.

5. Repräsentative Ergebnisse

Ein Beispiel für hNPCs in der sich selbst organisierenden Hydrogel Gerüst PuraMatrix kultiviert wird in Abbildung 1 dargestellt. Die hNPCs wachsen in sphärische Strukturen in unveränderter Uhr. In dieser Kultur Zustands, Zellen kann es kaum in einem Getriebe Licht erkannt werden, obwohl Bündeln von Prozessen zwischen den Sphären sichtbar sind (Abb. 1A). Je nach den Kulturbedingungen der verwendeten Zelltyp kann die Matrix zB durch Zugabe von Laminin geändert werden. Für die hNPC Zelllinie ReNcell VM (Millipore) Laminin ist notwendig, um ein Wachstum Muster mit weniger dichte Aggregate, sondern eine homogenere Verteilung der Zellen (Abb. 1B) zu induzieren. Unabhängig von Änderungen, kann die Matrix verwendet werden, um zB neuronale Differenzierung zu studieren. Abbildung 1C zeigt eine Färbung der hNPCs für die neuronalen Marker βIII-Tubulin. In diesem Beispiel wurden die Zellen für 7 Tage in der Matrix gewachsen und anschließend für 4 Tage, wo Differenzierung nach Abzug der Wachstumsfaktoren EGF und bFGF. ¹³ Zellkörper und ein dichtes Netz von Prozessen von den Zellen gebaut induziert wurde, unterschieden werden können anerkannt leicht. Es ist jedoch offensichtlich, dass eine Quantifizierung der Zellzahl zeitaufwendig ist, da eine große Anzahl vonBilder von verschiedenen Regionen der Matrix muss analysiert werden, um eine zuverlässige Datenbasis für eine statistische Analyse zu erhalten. In Abb. 1D kann man sehen, ein Beispiel von Zellen aus der Matrix freigesetzt und anschließend auf Deckgläsern flochten. Diese Zellen könnten für funktionelle Studien verwendet werden.

Die Freisetzung der Zellen aus dem 3D-Gerüsten bietet die Möglichkeit, verschiedene Parameter wie Expression von Marker-Proteinen oder Überlebensrate der Zellen durch AnnexinV / PI-Färbung oder eine TUNEL-Assay analysiert. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel eines Durchflusszytometrie-Analyse des Prozentsatzes der βIII-Tubulin ⁺ Zellen. Die Negativ-Kontrolle (Zellen, die nicht für βIII-Tubulin markiert) ist in Abbildung 2a dargestellt. Diese Kontrollen werden verwendet, um das Tor für die spätere Detektion von βIII-Tubulin ^+-Zellen (Abb. 2B) zu bestimmen. Ein Vergleich der manuellen Zählung von Zellen und eine Analyse mittels Durchflusszytometrie ist in Abbildung 2C dargestellt. Der Anteil der βIII-Tubulin ⁺ Zellen wurde bestiminiert durch Zählen der Gesamtzellzahl (mittels eines nuklearen DAPI-Färbung) und die Anzahl der βIII-Tubulin ⁺ Zellen in der Fluoreszenz-Bildern.

Abbildung 1. hNPCs in der sich selbst organisierenden Peptid-Hydrogel PuraMatrix kultiviert. A) hNPCs in PuraMatrix gekapselt (PM) wachsen in sphärische, dicht gepackte Strukturen, wo der Durchmesser der Kugeln kann bis zu mehreren hundert um. In zwischen den Kugeln kann man erkennen, Bündeln von Prozessen von den Zellen (Pfeile) gebaut. B) Zellen in PuraMatrix gekapselt mit Laminin (PML) in weniger dichten Strukturen wachsen, mehr homogen verteilt ergänzt. In der Laminin ergänzt Matrix kann man einzelne Zellen in weniger dicht besiedelten Gebieten (Pfeile) zu erkennen, aber es ist kaum möglich, die Anzahl der Zellen zu quantifizieren. C) hNPCs für 4 Tage in PML ausdrückliche neuronalen Marker wie βIII-Tubulin (grün) differenziert. Um Auswertungente der Anteil der positiven Zellen muss man die gesamte Zellzahl von einem Kerne Färbung wie DAPI (blau) zu bestimmen. Die Mikrofotografie stellt die volle Projektion einer Z-Stapel von Bildern mit Biozero-8000 Lupe genommen. D) Zellen aus der Matrix freigesetzt werden zB auf Deckgläsern für die weitere funktionelle Studien ausgesät werden. Die Mikrofotografie zeigt Zellen für 3D kultiviert, anschließend das Freigabeverfahren. Die Färbung für βIII-Tubulin (rot) zeigt eine vergleichbare Morphologie der Zellen in die 3D-Gerüst gehostet.

Abbildung 2. Durchflusszytometrie Zellen aus PuraMatrix freigegeben. Um die zeitaufwendige Quantifizierung von Mikrophotographien verwendeten wir ein Protokoll, um Zellen in PuraMatrix den Zugang zu schnelleren Analyse mittels Durchflusszytometrie kultivierten Version zu überwinden. A) Ungefärbte Zellen wurden als negative Kontrolle verwendet, um das Tor (schwarzer Rahmen) für die nachfolgend dargestellt und analysiertvon z. B. βIII-Tubulin-Zellen. B) Zur Quantifizierung der Anteil der βIII-Tubulin ⁺ Zellen die gleiche Tor, in der Negativ-Kontrolle eingestellt, verwendet wurde. Positive Zellen werden im rechten Teil der x-Achse, wo sich auch ein Zwischenprodukt Bevölkerung beobachtet wurde (gestrichelte Rahmen), am ehesten entspricht Zelltrümmer. C) Der Vergleich der manuellen gezählten Zellen und Zellen mittels Durchflusszytometrie gezählt zeigte einen viel höheren Anteil an positiven Zellen, in denen die zeitliche Abhängigkeit von der Anzahl der βIII-Tubulin ⁺ war vergleichbar mit Angabe der Zuverlässigkeit der Durchflusszytometrie Protokoll.

Diskussion

Der Einsatz von 3D-Gerüsten bietet die Möglichkeit, die Entwicklung verschiedener Zelltypen in einer Zellkultur Situation näher an die in vivo Situation zu studieren. Doch in Bezug auf die Analyse von zB neuronale Differenzierung oder funktionelle Untersuchungen muss man einige Hürden überwinden, um zuverlässige Daten für zB Quantifizierung von Zelltypen zu gewinnen.

Hier beschreiben wir die Kultur des hNPCs in der Peptid-Hydrogel-basierte Gerüst PuraMatrix und anschließend Freigabe...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
PuraMatrix Peptid-Hydrogel	BD Bioscience	354250
Maus Laminin I	Cultrex	400-2009090
Sucrose	Sigma	S9378-1KG
Normalem Ziegenserum	Dako	X0907
Triton X 100	Roth	3051,3
PBS Dulbecco	Biochrom AG	L 1825
HBSS	Gibco	14170-088	Hanks 'Balanced Salt Solution 1X
ΒIII-Tubulin-Antikörper	Santa Cruz	Sc-51670	Maus, monoklonal, 1:500
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A 11029	Ziege α-Maus, 1:1000
Alexa Fluor 568	Invitrogen	A 11031	Ziege α-Maus, 1:1000
Alexa Fluor 647	Invitrogen	A 21235	Ziege α-Maus, 1:1000
Mowiol 4-88 Reagent	Calbiochem	475904
Dabco	Aldrich	D2 ,780-2	1,4-Diazabicyclo [2.2.2] octan 98%
Zellsieb	BD Biosciences	352350	70 um Porengröße
Saponin	Merck	7695
Trypsin/ EDTA	GIBCO	25300-054
Benzonase 250 U / ul	Merck	1.01654.0001
Trypsin Inhibitor	Sigma	T6522 (500 mg)
20% HSA	Octapharma	Human-Albumin Kabi 20%