Wir beschreiben eine schnelle Methode zur Isolierung und Kultur hippokampalen und kortikalen Neuronen aus Nagetier Embryonen. Dieses Protokoll erlaubt es uns, Experimente, in denen nahezu reinen neuronalen Kulturen sind erforderlich, durchzuführen.
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Methodenartikel
Isolierung und Kultivierung von embryonalen Ratten-Nervenzellen: ein Quick-Protokoll
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Wir beschreiben eine schnelle Methode zur Dissoziation und Kultur oder kortikalen Neuronen des Hippocampus von E15-17 Rattenembryonen. Das Verfahren kann erfolgreich zur Isolierung von Maus und Mensch primären Neuronen und neuralen Vorläuferzellen angewendet werden. Dissoziierte Neuronen in serumfreiem Medium bis zu mehreren Wochen aufrechterhalten. Diese Kulturen können Nukleofektion, Immunzytochemie, Nukleinsäuren Herstellung sowie Elektrophysiologie verwendet werden. Ältere neuronalen Kulturen können auch mit einem guten Wirkungsgrad von lentiviralen Transduktion und, weniger effizient, mit Calciumphosphat oder Lipid-basierte Methoden wie Lipofectamin transfiziert werden.
Protokoll
1. Poly-D-Lysin (PDL): Herstellung
- 5 ml sterilem ddH 2 O bis 5 mg PDL um eine Stammlösung von 1 mg / ml zu erhalten.
- Mischen Sie Stammlösung durch mehrmaliges Pipettieren.
- Sofort verwenden oder speichern Poly-D-Lysin-Lösung bei 2-8 ° C.
2. Poly-D-Lysin (PDL): Beschichtung Zellkulturschalen
- Verdünnen Sie die PDL-Stammlösung mit sterilem ddH 2 O auf die Endkonzentration von 10 ug / ml.
- Pipette genug Lösung in eine 60 mm-Schale zur Kultur-Oberfläche (3 ml für eine 60 mm-Schale) zu decken.
- Schaukeln sanft auf gleichmäßige Beschichtung der Oberfläche Kult....
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Diskussion
Die Methode der Präparation und Kultur von Ratten-Hippocampus und kortikalen Neuronen hier beschriebenen ermöglicht die Durchführung von Experimenten unter Verwendung nahezu reinen neuronalen Kulturen in einem chemisch definierten Medium (Abbildung 3) gewachsen. Obwohl Protokolle für die Kultivierung nahezu reinem Neuronen in serumfreiem Medium wurden zuvor 2,3,4 beschrieben, gibt es wesentliche Änderungen in unserer Methode. Anders als bei traditionellen Protokollen (zB Banker et al.) 5.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Wir bedanken uns bei Jonna Ellis für die redaktionelle Unterstützung. Vom National Institute of Mental Health: Das Projekt beschrieben wurde von Verleihungsnummer R01MH079751 (F. Peruzzi PI) unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Institute of Mental Health oder des National Institutes of Health.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Reagens | Konzentration | ||
| Neurobasal | 98% | ||
| B27 | 2% | ||
| Glutamax | 0,5 mM |
Tabelle I Neurobasal/B27 Vollmedium.
| Reagens | Konzentration |
|---|---|
| Glucose | 16 mM |
| Saccharose | 22 mM |
| HEPES | 10 mM |
| NaCl | 160 mM |
| KCl | 5 mM |
| Na 2 HPO 4 | 1 mM |
| KH 2 PO 2 | 0,22 mM |
| Gentamicin | 50 ug / ml |
| Fungizone | 250 ng / ml |
| pH-Wert | 7,4 |
| Osmolarität | 320-330 mOsm |
Tabelle II. Dissection Medium.
| Reagens | Volume (ul) |
|---|---|
| Neurobasal/B27 Vollmedium | 240 |
| Trypanblau Stain 0,4% | 250 |
| Gesamt | 490 |
Tabelle III. 50x Counting Lösung.
| Reagens | Firma | Cat. Anzahl |
|---|---|---|
| Hibernate E | Brainbits | 767171 |
| Neurobasal | Gibco, Invitrogen | 21103-049 |
| B27 | Gibco, Invitrogen | 17504-044 |
| Fungizone | Gibco, Invitrogen | 15290-018 |
| Gentamicinsulfat | Sigma Aldrich | G1264 |
| 200 mM Glutamax | Gibco, Invitrogen | 35050 |
| TrypLE Express w / o Phenolrot | Gibco, Invitrogen | 12604 |
| Cytosin-β-D-Hydrochlorid arabinofuranosid | Sigma Aldrich | C6645 |
| Poly-D-Lysin | Sigma Aldrich | P6407 |
| Laminin 1 mg / ml | Millipore | CC095 |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 |
| Trypanblau Stain 0,4% | Gibco, Invitrogen | 15250 |
Tabelle IV. Spezifische Reagenzien.
| Ausrüstung | Firma | Cat. Anzahl |
|---|---|---|
| Stereo-Mikroskop | Olymp | SZ61 |
| Große Zange | FST | 11022-14 |
| Fine-Pinzetten | Moria | MC40B |
| Micro Fine-Pinzetten | Moria | MC31 |
| Gestochen scharfe Schere | Roboz | RS-6820 |
| Micro Präparierschere | FST | 91460-11 |
| Micro Dissecting gebogenen Schere | FST | 14067-11 |
| Glas 2-Kammer-Objektträgern | Lab-Tek | 154461 |
| 60 mm Platten | BD Falcon | 353002 |
| 100 mm-Schalen | Corning | 430167 |
| 15 ml Röhrchen | BD Falcon | 352099 |
| 1,5 ml Kryo-Röhrchen Fläschchen | Nunc | 375353 |
Tabelle V. Ausstattung.
Referenzen
- Aprea, S. Tubulin-mediated binding of human immunodeficiency virus-1 Tat to the cytoskeleton causes proteasomal-dependent degradation of microtubule-associated protein 2 and neuronal damage. J. Neurosci. 26, 4054-4062 (2006).
- Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H.
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Nachdrucke und Genehmigungen
