Mikrofluidischen Mischern für ein Studium Proteinfaltung

Zusammenfassung

In dieser Arbeit erklären wir die Herstellung und Verwendung eines mikrofluidischen Mixer zum Mischen zweier Lösungen in ~ 8 ms. Wir zeigen auch den Einsatz dieser Mischer mit spektroskopischen Nachweis mittels UV-Fluoreszenz-und Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET).

Zusammenfassung

Der Prozess, durch den sich ein Protein faltet seine native Konformation ist äußerst relevant für Biologie und Gesundheit des Menschen aber immer noch wenig verstanden. Ein Grund dafür ist, dass Faltung erfolgt über einen weiten Bereich von Zeitskalen von Nanosekunden bis Sekunden oder länger, je nach dem Protein ^1. Konventionelle Stopped-Flow-Mischer erlaubt haben Messung von Faltungskinetik ab etwa 1 ms. Wir haben kürzlich einen Mikrofluidik-Mixer, der Vergällungsmittel ~ 100-fach in ~ 8 ms ² verdünnt entwickelt. Im Gegensatz zu einem Stopped-Flow-Mixer arbeitet diese Mischer in der Laminar-Flow-Regime, in dem Turbulenzen nicht auftritt. Das Fehlen von Turbulenz ermöglicht eine präzise numerische Simulation aller Strömungen innerhalb des Mischers mit exzellenter Übereinstimmung zu experimentieren ^3-4.

Laminar-Flow ist für Reynoldszahlen Re ≤ 100 erreicht. Bei wässrigen Lösungen erfordert diese Geometrien im Mikrometerbereich. Wir verwenden ein hartes Substrat, wie Silizium oder Silizium kondensiertenca, um Kanäle 5-10 &mgr; m breit und 10 um tief (siehe Abbildung 1). Die kleinste Abmessungen, am Eingang zu dem Mischbereich, liegen in der Größenordnung von 1 um in der Größe. Der Chip wird mit einer dünnen Glas-oder Fused-Silica-Deckglas für optische Zugang verschlossen. Typische insgesamt lineare Flussraten sind ca. 1 m / s, was zu Re ~ 10, aber die Protein-Verbrauch beträgt nur ~ 0,5 NL / s oder 1,8 ul / hr. Die Proteinkonzentration wird durch den Nachweis Verfahren: Für Tryptophanfluoreszenz die typische Konzentration 100 pM (1 Trp / Protein) und FRET die typische Konzentration ~ 100 nM.

Der Falzvorgang wird durch schnelle Verdünnung des Denaturierungsmittels von 6 M bis 0,06 M Guanidin-Hydrochlorid eingeleitet. Das Protein in hoher Vergällungsmittel fließt einem zentralen Kanal und ist auf beiden Seiten an der Mischbereich durch Puffer ohne Vergällungsmittel bewegt ~ 100-mal schneller (siehe Abbildung 2) erfüllt. Diese Geometrie bewirkt eine schnelle Verengung des Proteins Fluss in ein engesJet ~ 100 nm breit sind. Die Diffusion der Moleküle Licht Vergällungsmittel ist sehr schnell, während die Diffusion der schweren Protein-Moleküle ist viel langsamer, diffundieren weniger als 1 um in 1 ms. Der Unterschied in der Diffusionskonstante des Denaturierungsmittels und den Protein führt zu einer schnellen Verdünnung des Denaturierungsmittels von dem Protein Strom, wodurch die effektive Konzentration des Denaturierungsmittels in der Umgebung des Proteins. Das Protein Strahl fließt mit einer konstanten Geschwindigkeit entlang der Beobachtungskanal und Fluoreszenz des Proteins während der Faltung beobachtet unter Verwendung eines konfokalen ^{5 beschrieben.}

Protokoll

1. Fertigung von mikrofluidischen Chips Mixing

Abbildung 3 zeigt die grundlegenden Herstellungsschritte.

1. Reinigen Sie 4 Zoll (100 mm) Quarzgut-Scheiben mit frischem Piranha-Lösung (3:1 H ₂ SO _4: H ₂ O _2): i) Wärme der Schwefelsäure auf 130 ° C dann in der Peroxid zu gießen. Beachten Sie, dass die Oberflächenrauhigkeit und die Flachheit der Quarzgut-Scheiben spielen eine wichtige Rolle für ein Verbindungsschritt verwendet. ii) Tauchen die Wafer für mindestens 30 Minuten. iii) für 5 Minuten mit Wasser abspülen und trocknen. Anwenden eines Polysilizium (Poly) Beschichten, ~ 1 um dicke pro jedem bestimmt 10 um die Tiefe der letzten mikrofluidischen Kanälen, unter Verwendung eines chemischen Niederdruck-Gasphasenabscheidung (LPCVD)-Ofen.
2. Reinigen Sie die Wafer und Maske mit dem Piranha-Protokoll in Schritt 1.1. Reinigen Sie die Maske auf die gleiche Weise, dann mit Aceton, Methanol und Isopropanol spülen und trocken blasen sofort. Entwässern der Wafer auf einer heißen Platte bei 150 ° C für ca. 10 Minuten (mit einer Aluminiumfolie Zelt, um Partikel fern zu halten) oder in einem Ofen 120 ° C für mindestens 120 Minuten (über Nacht bevorzugt). Um Fotolack Haftung zu erhöhen, sofort entlarven die warmen Waffeln zu HMDS Dampf für 5 Minuten. Schleuderbeschichtungsverfahren die Wafer mit einem ~ 900 nm dicke Schicht aus Photoresist AZ5214 und Weichbacken bei 90 ° C direkt auf einer Heizplatte 1 Minute oder in einem Ofen bei 110 ° C für 30 min (3, Schritt 1).
3. Richten Sie die Maske und machen einen harten und Vakuum-Kontakt. Expose mit UV-Licht für einige Sekunden (Gesamtenergie: ~ 103 mJ / cm ²⁾ (Abbildung 3, Schritt 2). Entwickeln Sie mit AZ400K Entwickler, verdünnt 4:1 mit VE-Wasser für ~ 50 Sekunden (bis Fotolack vollständig entwickelt ist) unter leichtem Schütteln. Spülen Sie mit Wasser für 2 Minuten. Untersuchen Sie Eigenschaften mit Mikroskop (Abbildung 3, Schritt 3). Wenn Eigenschaften schlecht sind entschlossen, strippen den Fotolack und beginnen wieder von 1,2. Hartbacken 115 ° C direkt auf einer Heizplatte für 2Minuten.
4. Descum Wafer mit Asher oder O _2-Plasma für 2,5 Minuten bei 100 W RF-Leistung. Unter Verwendung eines tiefen reaktiven Ionenätzer (DRIE), Ätzen der Polysiliziumschicht den ganzen Weg durch die Quarzglas unten. Isolieren der verbleibenden Photoresistschicht mit PRS2000 Resist-Stripper bei 75 ° C für 10 Minuten. Spülen und trocknen. Messen Sie die Ätztiefe zu gewährleisten, ist es den ganzen Weg durch die Poly-Beschichtung (Abbildung 3, Schritt 4).
5. Verwendung eines Oxid, wie einem DRIE ULVAC NLD-6000 Radierer, etch Quarzglas zu einer Tiefe von ~ 10 um pro Mikrometer Dicke der Poly-Beschichtung (3, Schritt 5). Diese Poly-Beschichtung entfernt wird beim Ätzen getragen werden, so kann es notwendig sein, auf die Integrität der Beschichtung periodisch zu überprüfen während des Ätzprozesses. Wenn absichtlich featureless Regionen der Wafer-Oberfläche geworden sind entblößt der schützenden Poly-Beschichtung beim Ätzen ist die Oberfläche sehr wahrscheinlich geworden entkernt und dann nicht mehr geeignet für die Verklebungin den letzten Schritten der Produktion. In diesem Fall wird der Wafer ist sehr wahrscheinlich nicht mehr lebensfähig. Reinigen Sie mit der Matrix Asher für 4 Minuten, 100 W HF-Leistung. Isolieren Sie das Polysilizium mit einem XeF ₂ Radierer (Abbildung 3, Schritt 6). Es kann notwendig sein, Schritt 1.4 und diesen Schritt einige Male wiederholen, um alle der Photoresist und Poly Beschichtungen zu entfernen.
6. Spin-Coating-Wafern mit einem neuen ~ 1 mu m Schicht aus Fotolack, um die Kanäle während der anschließenden Transport zu gewährleisten. Bohren Sie Ein-und Ausfahrt Löcher in jeder Chip mit einem Computer gesteuert diamantbestückte Bohrer oder manuell mit einem Sandstrahler (Abbildung 3, Schritt 7). Wenn mit einem Bohrer, montieren Sie den Wafer (Feature-Seite nach unten) auf einer Glasplatte mit Opfer-Aqua Bond 55, wobei darauf zu halten, der Bonder frei von Blasen. Kühlen Sie den Bohrer mit Mikro-90 Reinigungslösung. Das hält kleine Glassplitter vom Kleben an den Kanälen, die dann verstopfen den Chip während des Gebrauchs.
7. Spülen Sie den Wafer mit DI-Wasser mit einer Spritze zu injizieren water in jedes Loch. Tauchen Sie ein in Seifenwasser für eine Stunde. Entfernen Sie Fotolack und Aqua Bond mit PRS 2000 bei 60 ° C für mehrere Stunden, bis die Oberfläche sauber ist. Spülen Wafer mit DI-Wasser und warmem Seifenwasser. Spülen Sie jede Bohrung wieder mit einer Spritze, die Vermeidung geätzten Strukturen. Dry-Wafer mit Stickstoff und in einem Vakuumofen auf 120 ° C eingestellt Untersuchen Sie Löcher, um sicherzustellen, sie sind frei von Grobstaub und wiederholen Sie die Schritte Reinigung wie nötig. Messen Sie die Tiefe der Kanäle entweder mit einem optischen oder mechanischen Oberflächen-Profiler (Abbildung 3, Schritt 8).
8. Saubere Scheiben und eine äquivalente Anzahl von 170 um dicken Quarzglas Deckgläser mit 1) Piranha-Lösung (1-2 Stunden nach dem Verfahren in 1.1), 2) RCA 2 (05.01.01 DI: HCl: H ₂ 0 ₂ )-Lösung für 10 Minuten bei 75 C, 3) RCA 1-Lösung (05.01.01 DI: NH ₄ OH: H ₂ 0 ₂₎ für 22 Minuten bei 75C). Spülen mit DI-Wasser für 5 Minuten zwischen jeder Lösung.
9. Legen Sie eine Wafer-Funktionen Seite nach oben auf der Oberseiteein Stapel von 3-4 Reinraumtücher auf einem festen, ebenen Fläche steht, wie eine kleine Scheibe. Trocknen Sie die Wafer gründlich mit Stickstoff-Gas für mindestens 5 Minuten. Wiederholen Sie mit Deckglas. Pick-up Deckglas durch die Kante und schwenken, so dass die polierte Seite nach unten wird über den Wafer statt und richten Sie die flachen Kanten. Vorsichtig fallen das Deckglas auf den Wafer und lassen Sie ihn zu begleichen. Nudge nur horizontal, um die Ausrichtung anzupassen. Drücken Sie mit einem Finger auf die Mitte des Wafers. Man sollte sehen, ein Verbindung der vorderen nach außen strahlt beginnen. Falls erforderlich werden, gelten zusätzlich Druck auf andere Positionen rund um den Wafer, um die Verbindung der vorderen (Abbildung 3, Schritt 9) voranzutreiben.
10. Legen Sie die versiegelten Wafer in einer Hochtemperatur-Ofen gesetzt, um von Raumtemperatur bis 800 ° C über 3 Stunden Rampe, dann 800 bis 1100 ° C über weitere 1,2 Stunden. Halten bei 1100 ° C für 2 Stunden, und dann abgesenkt auf Raumtemperatur über weitere 1,5 Stunden.
11. Dice mit einer Wafersäge in iNDIVIDUELLE Chips (Abbildung 3, Schritt 10).
12. Das Protokoll beschreibt die Herstellung von Kanälen in dem eher unüblich Quarzglassubstrat, die für UV-Detektion. Aber das Protokoll kann auch für ein Siliziumsubstrat, die nur eine Ätzschritt ² erfordert angepasst werden. Ein Glas (aber nicht Quarzglas) Deckglas kann auf den Wafer mittels anodischen Bonden verbunden sein.

2. Montage und Laden von Chips

1. Der Verteiler, um das Mischen und Chip-Lösungen zu halten, kann aus Kunststoff sein, wie Lexan oder Plexiglas oder Aluminium für die Temperaturregelung (siehe Abbildung 4). Wenn unter Verwendung von Aluminium, sollte die Lösung Reservoirs mit Parylen beschichtet werden, um die Auflösung von Aluminium durch die Salzlösungen in den Behältern zu verhindern. Die Temperatur des gesamten Verteiler, Lösungen und Chip gesteuert mit thermoelektrischen Vorrichtungen angebracht an den Seiten und einer elektronischen Steuerung werden.
2. Der Chip wird auf der Mani verpaartfach durch kleine O-Ringe und einer an Ort und Stelle mit einem Sicherungsring, der eine klare optische Blick auf das Zentrum des Chips erlaubt gehalten. Die O-Ring-Nuten sollte flacher als Standard für eine gute Paarung, ohne zu viel Druck auf den Chip zu gewährleisten, sollte also eine 002 O-Ring sein, 0,025 "tief. Sobald der Chip montiert wird, fügen Sie Lösungen für die Haupt-und Seitenständer Stauseen , wobei darauf geachtet, um irgendwelche Blasen am Boden der Wells gefangen zu lösen.
3. Da die Volumina in diesem Mischer verwendet so klein sind, kann der Durchfluss mit Luftdruck über dem Brunnen Lösung angewandt gesteuert werden. Abbildung 4 zeigt die vielfältigen Druck zusammengefügt, um oben auf der Chip-Verteiler mit O-Ringen. Die Druckleitung wird an computergesteuerten Drucksensoren, die Drücke von 2-80 ~ PSI halten kann, verbunden. Der Chip wurde so gestaltet, dass gleich Druck auf die Mitte und seitlichen Kanäle eine ~ 100-fach-Verhältnis in den linearen Flussraten zu produzieren. Bei 20 PSI, ist die lineare Strömungsgeschwindigkeit in dem Austrittskanal ca. 1 m/ S.
4. Setzen Sie auf vielfältige einem inversen Mikroskop untersuchen und Mischen Region mit dem Okular oder die Kamera-Ausgang. Eine glühende Taschenlampe oben auf dem Verteiler angebracht wird genug Licht bieten. Verwendung eines Farbstoffs oder hohen Brechungsindex Lösung (dh 6 M Guanidin-Hydrochlorid) in den mittleren Kanal der Düse zu kommen.
5. Bei gleichem Druck auf die Mitte und seitlichen Kanäle, wird der Strahl nur schwer mit dem Auge zu sehen, so beginnt mit dem Seitenkanal Druck bei 0 PSI und langsam auf gleichen Druck zu erhöhen. Wenn eine Seite Kanal verstopft ist, wird der Strahl gegen eine der Wände des Austrittskanals geschoben werden. Wenn ein sichtbares Verstopfung erscheint, werden durch Anwendung von Druck oder Vakuum an den Austrittskanal mit einer Spritze abgelöst werden.
6. Wenn Protein oder ein anderes organisches Material verstopft den Chip, kann es durch Eintauchen in Lösung über Nacht Pirhana gereinigt werden.

3. Data Collection

Abbildung 5 zeigt den prinzipiellen optischen Instrument Layout.

1. Bringen Sie einen kollimierten Laserstrahl in ein Forschungs-Grade-Mikroskop mit einem dichroitischen Spiegel entweder innerhalb oder außerhalb des Mikroskops. Richten Sie den Laser so, dass der Fokus im Okular oder die Kamera etwas in der Nähe des Misch-Region gesehen werden kann.
2. Fluoreszenz des Proteins in dem Mischer durch das Ziel gesammelt und durch den dichroitischen Spiegel, fokussiert durch eine Linse auf eine Lochblende und abgebildet auf einem Photonenzähler. Scannen des Chips unter Verwendung eines piezoelektrischen Scanner in x und y zur Abbildung der Mischbereich (typischen Schrittweite 2 um). Wählen Sie eine Position auf der Jet-und Scan in X und Z, um den Fokus in der Mitte des Kanals senkrecht zu finden. Die Schärfentiefe des Mikroskops ist viel geringer als die Tiefe und die Strömungsgeschwindigkeit gleichmäßig in dem Kanal, außer in 1 um der Wände. Daher ist die zeitliche Auflösung der beobachteten Fluoreszenz hauptsächlich durch die Größe des konfokalen Ort festgelegt.
3. Scannen horizontal im Austrittskanal (typisch Schritt size ist 0,2 um über den Jet, 2 mu m entlang des Jets) in Schritten von 100 mu m entlang des Jets, für die Beobachtung ~ 1 ms pro Position (siehe Abbildung 6). Bewegen Sie den Mikroskoptisch von 80-90 mu m entlang des Jets zu späteren Zeiten zu erfassen.
4. Alternativ kann Licht, das durch einen Spektrographen und CCD nach dem dichroitischen Spiegel unter Verwendung einer Linse, um das Licht auf den Eintrittsspalt konzentrieren detektiert werden. Da die Datenerhebung ist langsamer als für die Photonen-Zähler (1 Sekunde pro Position), wird in der Regel die ersten Jet mit der Photonenzähler bebildert und dann entlang des Jets werden mit dem Spektrographen gemessen (siehe Abbildung 7).
5. Daten aus dem Photon Zähler wird durch die Summe 3-5 Pixel um den Strahl an jeder Position, um eine graphische Darstellung der Intensität vs Distanz schaffen analysiert. Die Zeit wird aus der Distanz mit einer berechneten Geschwindigkeit von den angelegten Druck (siehe Abbildung 8) berechnet.
6. Die Daten aus dem Spektrographen kann eine Reihe von Möglichkeiten untersucht werden. Für FRET, channels als "Spender" und "Akzeptor" bezeichnet kann jeder werden summiert und die Nähe Verhältnis E = I _A / (I + _D I _D) berechnet werden (siehe Abbildung 9). Alternativ können einzelne-Zerlegung durchgeführt, um zu unabhängigen spektralen Komponenten gegen die Zeit, wie die Verschiebung des Tryptophan Emissionsspektrum als Proteinfaltung zu suchen.
7. Entfernung in den Austrittskanal kann zu Zeit unter Verwendung einer konstanten Durchflußmenge des von der aufgebrachten Druck auf die seitlichen Kanäle umgewandelt werden. Innerhalb der ersten 2 um der Austrittskanal, beschleunigt die Strömung des Proteins Jet ~ 100x und die Zeiten, in diesem Bereich muss mit Finite-Elemente-Analyse der Stromlinien (Herstellung der Zeit aufgetragen in 8) berechnet werden. Dies erzeugt eine Beschleunigung von ~ 1-2 us ausgeglichen, nachdem die Geschwindigkeit konstant wird und kann in der Regel bei der Messung Kinetik viel langsamer als Misch ignoriert werden.

4. Repräsentative Ergebnisse

6 zeigt ein Konturdiagramm der Intensität in dem Mischbereich durch das Photon gemessen. Der Hintergrund in den Austrittskanal außerhalb der Strahl sollte nahe dem Grundrauschen des Detektors sein und wird typischerweise nicht abgezogen werden. Eine höhere Hintergrund kann für eine schlechte Ausrichtung oder dass das Protein an den Wänden des Kanals kleben. Ein Jet, geknickt oder krumm aussieht, vor allem in der Nähe des Mischbereich, deutet auf eine schlechte etch der Düsen.

Abbildung 7 zeigt die zeitaufgelösten Spektren aus dem Protein Acyl-Coenzym A-bindende Protein (ACBP) mit Alexa 488 und Alexa 647 beschriftet. Diese Daten wurden Hintergrund abgezogen, um die dunklen Lade-und Laser-Signal zu entfernen. Das Hintergrundsignal wurde mit dem Center-Kanal Druck auf 0 PSI übernommen.

Das Mischen kann durch Messen einer schnellen Reaktion, die viel schneller als die Mischung wie Trp Fluoreszenzlöschung b gemessen werdeny KI oder Zusammenbruch der Einzelstrang-DNA, markiert mit FRET-Farbstoffen, durch die Zugabe von NaCl. Da der Strahl kleiner als die optische Auflösung des Mikroskops, gibt es eine große Intensität Tropfen im Mischbereich, während der Jet Formen. Dieses Instrument Reaktion kann durch eine Kontrollmessung, in denen keine Lösung Bedingungen ändern. 8 zeigt das Verhältnis der Mischung (in 400 mM KI) und nicht-Mischexperimente von N-Acetyl Tryptophanamid Fluoreszenz entfernt werden. Die Linie zeigt die vorhergesagte Konzentration von KI von COMSOL Simulationen. Die Mischzeit, wie die Zeit für die Konzentration auf 80% vermindert gemessen, 8 ms.

Da die Daten in 100 mu m-Schritten entlang der 500 pm langen Exit-Kanal gesammelt wird, müssen die Daten zusammen aus mehreren Ansichten eingefügt werden. Es gibt gelegentlich kleine Verschiebungen des Signals zwischen diesen Ansichten, wahrscheinlich auf kleine Änderungen in der Ausrichtung als der Chip von dem Mikroskoptisch bewegt wird. Durch Bewegen der Bühne 80 oder 90um pro-Ansicht können diese Offsets durch die Untersuchung überlappenden Daten eliminiert werden. Typischerweise Daten werden mit mindestens zwei Flussraten gesammelt und die Daten werden kombiniert, um alle Änderungen zu bestätigen Signal sind durch spektroskopische echte Veränderungen in der Proteinstruktur, anstatt optische oder Flow-Effekte. Abbildung 9 zeigt das FRET-Änderungen im Protein ACBP nach Verdünnung von Denaturierungsmittels von 6 M bis 0,06 M. diesen muss nicht ein Kontrollexperiment, da die FRET ist bereits ein Verhältnis und die Instrumentenantwort ist bereits entfernt. Der rasche Sprung in der Nähe von T = 0 steht für eine rasche Änderung der FRET-Signals innerhalb der Mischzeit.

1. Aufbau Mischbereich gemessen durch Elektronenmikroskopie.

Abbildung 2. Schematische Darstellung der hydrodynamischen Mischen der Proteinfaltung zu studieren. Das Protein,gelöst in hoher Vergällungsmittel, um es zu entfalten, fließt der mittlere Kanal in Richtung Mischbereich wo er mit Puffer fließt ~ 100-mal schneller. Laminar-Flow zwingt die Protein-Stream in einen schmalen Strahl, aus dem Vergällungsmittel Moleküle schnell diffundieren können. Da der Strahl fließt das Exit-Kanal, kann das Protein mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung mit einem konfokalen Mikroskop beobachtet werden.

Abbildung 3. Fused-Silica-Fertigung. 1) Der Prozess beginnt mit einer hochglanzpolierten 500 um dick Quarzglassubstrat (a) mit einer Schicht aus Polysilizium (Poly), die auf den oberen und unteren Flächen (b) und mit einer Schicht aus Photoresist (c) durch Spin-Coating. 2) Eine Photomaske (e) int gebracht o hartem Kontakt mit dem Wafer und der Fotolack wird mit UV-Licht (d) ausgesetzt. 3) Der Wafer wird in einem Entwickler-Bad gebracht und das Muster ist in dem Photoresistfilm offenbart. 4) Der Wafer wird in einer DRIE angeordnet und die Merkmale werden in den oberen Poly Beschichtung geätzt. Der Fotolack wird dann entfernt. 5) Das Poly dient dann als Maske, wenn der Wafer in einem Oxid Radierer angeordnet ist, und die Merkmale 10 geätzt - 40 um in die Quarzglassubstrat. 6) Die Poly Beschichtung wird dann in einer Ätzmaschine XeF ₂ entfernt. 7) Der Wafer wird auf eine Opferschicht Glasplatte mit einer wärmeaktivierten Dichtmittel (g), Merkmale nach unten, und eine Diamant-Bohrkopf (f) abrasiv Bohrer Durchgangslöcher von der Rückseite verbunden. 8) Eine Oberfläche Profiler (h), dann misst direkt die geätzten Merkmal Tiefen. 9) A 170 um dick Quarzglas Deckglas Wafer direkt auf der oberen Oberfläche des Wafers geklebt. 10) Der Wafer wird in einzelne Chips zerteilt mikrofluidischen.

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Abbildung 4. Der Mischer vielfältig. Die Mikrofluidik-Chip-Lösung wird dem Verteiler mit einer bearbeiteten Aluminium-Frontplatte und vier O-Ringe unter den ~ 200 ul Stauseen gesichert. Ein großes Loch durch die Mitte des Verteilers direkt oberhalb der Mischbereich der mikrofluidischen Chip angebracht bearbeitet, so dass überschüssige UV-Licht ohne Rückstreuung, Inhibierung einer Auto-Fluoreszenz von dem Verteiler selbst zu entkommen und eine direkte Beleuchtung des Chips mit dem Auge oder die Kamera für die Ausrichtung. Die Luftverteiler Dichtungen jedem der Reservoirs, so daß der Luftdruck in jeweils über einen externen Druck Steuereinheit gesteuert werden kann.

Abbildung 5. Schematische Darstellung des optischen konfokalen Mikroskop.

Abbildung 6. Konturdiagramm von TryptophanFluoreszenz in der mikrofluidischen Mischer. Der Mischbereich ist bei ~ 90 um auf der y-Achse.

Abbildung 7. Zeitabhängige Fluoreszenz-Spektren innerhalb des Mischers gesammelt. Die grünen und roten Rechtecke zeigen die Wellenlängen als Donor-und Akzeptor-Kanäle bezeichnet sind.

Abbildung 8. Mischzeit durch Fluoreszenzlöschung von Tryptophan durch Kaliumiodid (Punkte und rechte Achse) gemessen und berechnet Finite-Elemente-Analyse (Linie und linke Achse).

9. FRET Veränderungen während der Faltung des Proteins ACBP gemessen. Der rasche Anstieg nahe t = 0 eine Burst-Phase innerhalb der Mischzeit und die langsameren Anstieg stellt eine allmähliche Akkumulationtion der Struktur wie das Protein faltet. Die Daten wurden bei zwei verschiedenen Flussraten aufgenommen und überlagert, was zu unterschiedlichen Dichten von Messungen zu verschiedenen Zeiten.

Diskussion

Eine schnelle Durchmischung war ein Entwicklungsziel für das Gebiet der Proteinfaltung seit vielen Jahren, weil es seit langem anerkannt, dass molekulare Prozesse von Biomolekülen über Zeitskalen von Pikosekunden bis Sekunden auftreten. Konventionelle Stopped-Flow-Mischer haben Totzeiten von 1-5 ms, die vor allem durch Turbulenz ist begrenzt. Turbulente kontinuierlichen Mischern mit Mischzeiten von 30-300 us haben in den vergangenen 15 Jahren von einer kleinen Anzahl von Gruppen entwickelt, sondern erfordern in der Regel hohe Flussraten, um diese zu erreichen Mischzeiten und verwenden daher eine Menge von Probe ^6-8.

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Mikrofluidsystemen Mischen Chips schnelle Verdünnung in der laminaren Strömung zu erreichen. Es gibt mehrere Vorteile, die innerhalb dieses Systems, sondern eine primäre ist die Fähigkeit, die gesamte Mischverfahren mit hoher Genauigkeit, die man, um die gemischte Antwort zu modifizieren simulieren. T-Mischer von anderen Gruppen mit einfachen geom entwickeltetries haben Mischzeiten von 100-200 us, die hauptsächlich von der Größe der Kanäle ^9-10 wurden beschränkt gezeigt. Durch Skalieren der Größe der Kanäle bis 10 um Ritter verringert die Mischzeit auf ~ 10 us ^11. Yao und Bakajin zeigte, dass kleine Veränderungen in der Geometrie können zu erheblichen Verbesserungen in der Mischzeit ⁴ führen. Zeigten jedoch, dass Arbeit, die Beschleunigung der Vermischung kann auch zu einer langsameren Phasen als auch führen. Das Design in dieser Arbeit verwendet ^12-13 ist ein Kompromiss zwischen den beiden besten Entwürfe in Bezug ^4, um die langsameren exponentiellen Abfall in Vergällungsmittel Konzentration zu minimieren und auch um die Funktion besser reproduzierbar in DRIE Ätzen.

Es gab einige Kontroversen auf dem Gebiet der ultraschnellen Vermischung über die Definition der Mischzeit. Es ist wichtig, den Unterschied zwischen "Mischzeit" und "tote Zeit" zu erkennen. Die Totzeit wird in einem turbulenten Mischer als die Zeit, während der eine Messung! Definiertt nicht gemacht werden und können in der Tat deutlich länger als die tatsächliche Mischzeit. Es wird üblicherweise erreicht, indem mehrere Messungen eines pseudo-erster Ordnung bimolekularen Reaktion (wie Abschrecken der Tryptophan-Fluoreszenz von N bromosuccinate) bei verschiedenen Konzentrationen bestimmt. Die beobachteten exponentiellen Abfall angebaut, um an einem einzigen Wert angenommen, dass t = 0 s sein konvergieren und die Zeit zwischen diesem Zeitpunkt und dem ersten Messpunkt ist die Totzeit. Für laminare Strömung Mischer, können die Messungen während des Mischprozesses hergestellt sein, so gibt es keine Totzeit nur eine Mischzeit. Die Mischzeit ist einfach die Zeit, um zwei Lösungen kombinieren, bis eine ausreichende Einheitlichkeit erreicht wird. Wir haben zuvor die Mischzeit auf eine 90/10, die Zeit für die Konzentration des Denaturierungsmittels, um von 90% bis 10% des ungemischten Wert verkleinert werden definiert. Jedoch ist die Form des Mischkurve nicht perfekt symmetrisch mit dem Schwanz des Zerfalls mit einer kleinen exponentielle Komponente. Ferner weist ein Proteinfaltungstark nicht-lineare Abhängigkeit von Denaturierungsmittel Konzentration, so dass Falten oft beginnen kann, selbst wenn der Vergällungsstoff nur durch zwei-fache reduziert. Deshalb haben wir in jüngster Zeit die Mischzeit als die Zeit, um die Vergällungsmittel Konzentration um 80% definiert. Sicherlich andere Definitionen können in Abhängigkeit von den Anforderungen des Experiments werden.

Die Verwendung dieses Mischpult auf die Proteinfaltung zu studieren hat immer wieder überraschende Ergebnisse zeigten. Die Faltung von Cytochrom c und Apomyoglobin haben lange studiert worden, um mehrere Klapptritt und frühen Ergebnisse mit kontinuierlichen Mischern haben gezeigt, Zusammenbruch auf der ~ 100 us Zeitskala ^10,14-15 auftreten. Unsere Messungen mit diesem Mixer zeigte dort auf mindestens 2 Schritte auf dieser Zeitskala zu sein, ein sehr schneller, wahrscheinlich nicht-spezifischen, Kollaps (wie von Trp-Fluoreszenz spektrale Verschiebung gemessen) innerhalb der Mischzeit des Mischers eine längere Phase folgte (wie gemessen durch das Abschrecken von insgesamt Trp Emission) das ist wahrscheinlich das first Bildung von nativen Struktur ^5. Wir haben auch ein 50 us-Prozess in der B1-Domäne von Protein L beobachtet, Umsturz der herkömmlichen Interpretation, dass dieses Protein eine 2-Staaten-Ordner ¹³ ist.

Ein Vorteil dieser schnellen Mischer ist, dass es die Faltung von Proteinen zu den am schnellsten Faltung, die normalerweise nur messbar gewesen durch Nanosekunden-T-Sprung Instrumente zu sondieren. T-Sprung erfordert in der Regel Beobachtung der Faltung / Entfaltung Entspannung in der Nähe der Schmelztemperatur des Proteins und somit nie folgt die Faltung der gesamten Bevölkerung. Mit diesem Mischpult haben wir bei der Faltung von γ-Repressor (λ ^6-86) sowohl mit Trp Gesamtemission und spektrale Verschiebung angesehen und fand Beweise, dass das Protein kein Hindernis für die Faltung unter Bedingungen, die starke Faltung nicht zugänglich waren zu früheren T hat -Messungen ¹² springen. Schließlich haben wir den Falten des Villin Kopfstück HP-35 gemessen, von ter am schnellsten Ordner nicht gemessen und festgestellt, dass die Faltung Rate nach dem Mischen gemessen ~ 5-mal langsamer als mit T-Sprung unter den gleichen Bedingungen ¹⁶ gemessen ist. Dies deutet darauf hin, dass Faltungskinetik von den Anfangsbedingungen ab hängt, Kippen eine wichtige Annahme in diesem Bereich.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
AZ P4110 Fotolack	AZ Electronic Materials
AZ 400 K Entwickler	AZ Electronic Materials
Baker PRS 2000 Photoresist-Stripper	Avantor Performance Materials
AquaBond	AquaBond Technologies	AquaBond 55
500 pm Abdeckwafers	SENSOR Prep Dienstleistungen		Ø: 100 mm ± 0,5 mm Dicke: 0,5 mm ± 0,025 mm Standard-Toleranzen (Sofern nicht anders angegeben) Oberflächenfinish: SI: 4-8a; SII: 8-12a Wohnungen: Ein primärer SEMI-STD; Ein Scribe Sauber und poliert, beidseitig
170 um Abdeckwafers	SENSOR Prep Dienstleistungen	7980 2G Waffeln	Ø: 100 mm ± 0,5 mm Stärke: 0,17 mm ± 0,025 mm Standard-Toleranzen (Sofern nicht anders angegeben) Oberflächenfinish: SI: 4-8a; SII: 8-12a Wohnungen: Ein primärer SEMI-STD; Ein Scribe Sauber und poliert, beidseitig
Deep Reactive Ion Radierer für Oxide	ULVAC	ULVAC NL-6000
Argon-Ionen-Laser	Cambridge Laboratories Laser	Lexel 95-SHG	λ = 258 nm
Argon-Ionen-Laser	Melles Griot		λ = 488 nm
Mikroskop	Olymp	IX-51
Mikroskopobjektiv	Thor Labs	OFR LMU-40X-UVB 0,5 NA	λ = 258 nm
Mikroskopobjektiv	Olymp	UPLSAPO 60XW 1,2 NA	λ = 488 nm
Nanopositionierer	Mad City Labs	Nano-LP100
Motorisierte Verschiebetisch	Semprex Corp	KL-Serie 12-6436
GaAsP Photonenzähler	Hamamatsu	H7421-40
Monochromator	Horiba Instruments Inc	MicroHR
CCD-Kamera	Andor Technology	idus 420A-BU
Guanidinhydrochlorid (GuHCl)	Sigma-Aldrich	G4505