High-Throughput-Physikalische Kartierung von Chromosomen unter Verwendung von Automated In-situ- Hybridisierung

Zusammenfassung

Genomassemblierungen, die auf massiv parallelen DNA-Sequenzierungstechnologien basieren, sind in der Regel stark fragmentiert. Die Entwicklung physikalischer Chromosomenkarten kann Genomassemblierungen potenziell verbessern. Hier demonstrieren wir innovative Ansätze für die Chromosomenpräparation, die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung und die Bildgebung, die den Durchsatz der physikalischen Kartenentwicklung deutlich erhöhen.

Zusammenfassung

Projekte zur Gewinnung von Gesamtgenomsequenzen für 10.000 Wirbeltierarten¹ und für 5.000 Insekten und verwandte Arthropodenarten² werden voraussichtlich in den nächsten 5 Jahren stattfinden. So erfolgt beispielsweise die Sequenzierung der Genome von 15 Malariamückenarten derzeit mit einer Illumina-Plattform^3,4. Dieser Anopheles-Artencluster umfasst sowohl Vektoren als auch Nicht-Vektoren der Malaria. Wenn die Genomassemblierungen verfügbar sind, werden die Forscher die einzigartige Gelegenheit haben, vergleichende Analysen durchzuführen, um evolutionäre Veränderungen abzuleiten, die für die Vektorfähigkeit relevant sind. Es hat sich jedoch als schwierig erwiesen, Next-Generation-Sequencing-Reads zu verwenden, um qualitativ hochwertige De-novo-Genomassemblierungen zu generieren⁵. Darüber hinaus sind die vorhandenen Genomassemblierungen für Anopheles gambiae, obwohl sie mit der Sanger-Methode gewonnen wurden, lückenhaft oder fragmentiert^4,6.

Der Erfolg vergleichender genomischer Analysen wird begrenzt sein, wenn Forscher sich mit zahlreichen Sequenzierungscontigs befassen, anstatt mit chromosomenbasierten Genomassemblierungen. Fragmentierte, nicht kartierte Sequenzen stellen Probleme für genomische Analysen dar, weil: (i) nicht identifizierte Lücken zu einer falschen oder unvollständigen Annotation genomischer Sequenzen führen; (ii) nicht kartierte Sequenzen führen zu einer Verwechslung zwischen paralogen Genen und Genen aus verschiedenen Haplotypen; und (iii) das Fehlen einer Chromosomenzuordnung und -orientierung der Sequenzierungskontigs erlaubt es nicht, die Rearrangement-Phylogenie zu rekonstruieren und die Chromosomenevolution zu untersuchen. Die Entwicklung hochauflösender physikalischer Karten für Arten mit neu sequenzierten Genomen ist eine zeitgemäße und kosteneffiziente Investition, die die Genomannotation, die evolutionäre Analyse und die Resequenzierung einzelner Genome aus natürlichen Populationen erleichtern^{wird 7,8}.

Hier präsentieren wir innovative Ansätze zur Chromosomenpräparation, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und Bildgebung, die eine schnelle Entwicklung physikalischer Karten ermöglichen. Am Beispiel von An. gambiae zeigen wir, dass die Entwicklung physikalischer Chromosomenkarten Genomassemblierungen und damit die Qualität genomischer Analysen verbessern kann. Zunächst verwenden wir eine Hochdruckmethode, um Polyten-Chromosomenspreizungen vorzubereiten. Diese Methode, die ursprünglich für Drosophila⁹ entwickelt wurde, ermöglicht es dem Benutzer, mehr Details auf den Chromosomen sichtbar zu machen als die reguläre Quetschtechnik¹⁰. Zweitens wird ein vollautomatisches Frontend-System für FISH für die physikalische Genomkartierung mit hohem Durchsatz verwendet. Das automatisierte Objektträgerfärbesystem führt mehrere Assays gleichzeitig durch und reduziert den Zeitaufwand drastisch¹¹. Drittens scannt und fotografiert ein automatisches Fluoreszenz-Bildgebungssystem, das einen motorisierten Objektträgertisch umfasst, automatisch markierte Chromosomen nach FISH¹². Dieses System ist besonders nützlich für die Identifizierung und Visualisierung mehrerer Chromosomenplatten auf demselben Objektträger. Darüber hinaus erfasst der Scanvorgang ein einheitlicheres FISH-Ergebnis. Insgesamt ist das automatisierte physische Mapping-Protokoll mit hohem Durchsatz effizienter als ein manuelles Standardprotokoll.

Protokoll

1. Hochdruck-Polyten-Chromosomenpräparation aus Eierstock-Ammenzellen

1. Präparieren Sie halbträchtige Anopheles-Weibchen 25 Stunden nach der Blutfütterung unter einem Präpariermikroskop und fixieren Sie die Eierstöcke in frischer, modifizierter Carnoy-Lösung mit Methanol (100 % Methanol: Eisessig, 3:1). In diesem Stadium befinden sich die Eierstöcke im Entwicklungsstadium von Christophers' III, in dem die Follikel eine ovale Form und ein transparenter Bereich mit Ammenzellen innerhalb der Follikel eine runde Form hat¹³. Legen Sie die Eierstöcke von etwa fünf weiblichen Pflanzen in 500 μl modifizierte Carnoy-Lösung in ein 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen und halten Sie sie 24 Stunden lang bei Raumtemperatur. Übertragen Sie die Eierstöcke auf -20 °C für eine Langzeitlagerung.
2. Bereiten Sie die modifizierte Carnoy-Lösung mit Ethanol (100 % Ethanol: Eisessig, 3:1) und 50 % Propionsäure vor, kurz bevor Sie Objektträger herstellen. Legen Sie ein Paar Eierstöcke auf einen staubfreien Objektträger und geben Sie einen Tropfen modifizierte Carnoy-Lösung. Teilen Sie die Eierstöcke mit Präpariernadeln in ca. 6 Abschnitte auf und legen Sie sie in Tropfen mit 50%iger Propionsäure auf saubere Objektträger unter einem Dissektions-MZ6-Leica-Stereomikroskop. Verwenden Sie für jeden Abschnitt eine separate Folie.
3. Trennen Sie die Follikel beim Präparieren mit Nadeln und wischen Sie das restliche Gewebe mit Filterpapier oder Papiertuch unter einem Präpariermikroskop aus. Geben Sie einen neuen Tropfen 50% Propionsäure in die Follikel und lassen Sie sie 3-5 Minuten bei Raumtemperatur ruhen. Legen Sie ein Deckglas auf das 50%ige Propionsäuretröpfchen. Lassen Sie die Folie ca. 1 Minute stehen.
4. Wickeln Sie den Objektträger mit Filterpapier und Plastik ein. Drücken Sie die Follikel mit einem Dremel 200 Rotationswerkzeug mit einem Flex-Shaft-Aufsatz und einer weichen Kunststoffspitze zwischen 3000 und 5000 U/min aus, indem Sie die Spitze in Kreisen drehen und leicht auf das Deckglas drücken, um die Kerne gleichmäßig zu verteilen. Dieser Schritt sollte ca. 1 Minute dauern. Überprüfen Sie die Spread-Qualität mit einem Olympus CX41 Phasenmikroskop mit einem 20-fach-Objektiv.
5. Bereiten Sie ein Sandwich vor, indem Sie ein zusätzliches Deckglas neben das Deckglas legen, das die Chromosomen bedeckt, und decken Sie sie mit einem zweiten Objektträger ab. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit, dass der Schlitten im Schraubstock zerquetscht wird. Wickeln Sie die Objektträger mit einer Plastikfolie ein, die in Glasobjektträgerbehältern geliefert wird, und Filterpapier, um das Sandwich zu halten und die Folie vor Kratzern durch den Schraubstock zu schützen.
6. Üben Sie mit einem mechanischen Schraubstock Druck auf die Schlitten aus. Ein Druck von 85-120 inch-lbs ist ausreichend und wird durch die Verwendung eines Drehmomentschlüssels erreicht. Dieser Schritt ist notwendig, um die Chromosomen so weit wie möglich abzuflachen.
7. Entfernen Sie den zweiten Objektträger und das zusätzliche Deckglas. Erhitzen Sie den Objektträger mit dem Deckglas, das die Chromosomen bedeckt, auf einem Objektträger-Denaturierungs-/Hybridisierungssystem für 10-15 Minuten, um die Chromosomen weiter abzuflachen. Tauchen Sie den Objektträger mindestens 15 Sekunden lang in flüssigen Stickstoff und entfernen Sie das Deckglas schnell mit einer Rasierklinge, wenn das Blubbern aufgehört hat. Legen Sie die Objektträger sofort 5 Minuten lang in kaltes 50%iges Ethanol. Dörren Sie die Objektträger jeweils 5 Minuten lang mit 70 %, 90 % und 100 % Ethanol ein. Rutschen an der Luft trocknen.

2. FISH mit einem automatisierten Objektträger-Färbesystem

Programm ist mit dem automatischen Objektträgerfärbesystem Xmatrx so eingerichtet, dass es die folgenden Schritte ausführt, mit Ausnahme der Sondenbeschriftung. Das detaillierte Protokoll zur Markierung der Nick-Translation ist in der Dokumentation beschrieben, die mit der DNA-Polymerase von Fermentas bereitgestellt wird.

1. Bereiten Sie vor der FISH Fluoreszenzsonden vor, indem Sie genomische BAC-DNA mit einem Fluorochrom unter Verwendung eines Nick-Translationsprotokolls markieren. Mischen Sie 1 μg DNA, je 0,05 mM unmarkiertes dATP, dCTP und dGTP und 0,015 mM dTTP, 1 μl Cy3- oder Cy5-dUTP, 0,05 mg/ml BSA, 5 μl 10x Nick-Translationspuffer, 20 Einheiten DNA-Polymerase I, 0,0012 Einheiten DNase I und nukleasefreies Wasser auf 25 μl. Das DNA-Polymerase I/DNase I-Verhältnis wird empirisch ausgewählt, um Sonden mit einem Größenbereich von 300 bis 500 bp zu erhalten. Die Mischung 1 Stunde lang bei 15 °C inkubieren.
2. Geben Sie Objektträger und Reagenzien in das automatisierte Objektträgerfärbesystem Xmatrx und starten Sie das Programm, um die folgenden Schritte auszuführen. 800 μl 1x PBS für 20 min auftragen. Folien mit Luft einblasen. Führen Sie die Formalinfixierung durch, indem Sie 1 Minute lang 450 μl 4 % Formalin in 1x PBS auftragen, gefolgt von Waschungen mit 100 % Ethanol für 1 Sekunde zweimal und einmal für 2 Min. Folien mit Luft einblasen.
3. Erhitzen Sie die Objektträger 2 Minuten lang bei 45 °C, um Blasenbildung beim Anbringen der Sonden zu vermeiden. 20 μl der DNA-Sonden werden aufgetragen, Tropfen Mineralöl hinzugefügt, um eine Verdunstung einer Hybridisierungslösung zu vermeiden, und ein Deckglas darauf gelegt. Denaturierung von Chromosomen und DNA-Sonden durch Erhitzen der Objektträger bei 90 °C für 10 Minuten.
4. Für die Hybridisierung werden die Objektträger 14 Stunden lang bei 42 °C mit Deckgläsern inkubiert. Die Hybridisierungslösung besteht aus 2x SSC, 100 mM Natriumphosphat, 1x Denhardt-Lösung, 100 μg/ml Natriumazid und 10 % Dextransulfat in Formamid.
5. Für Stringenzwäschen die Objektträger 2 min bei 42 °C erhitzen, Deckgläser entfernen, die Objektträger 4 x 4 Mal 1 Sek. in 2x SSC waschen. Folien mit Luft einblasen. 800 μl 0,4x SSC bei 42 ΰC 10 min lang 2 Mal auftragen. Waschen Sie die Objektträger in 2x SSC bei 25 °C für 10 min.
6. Führen Sie eine Chromosomenfärbung durch, indem Sie 50 μl 1 μM YOYO-1 in 1x PBS auftragen. Tropfen Mineralöl auftragen, um ein Verdampfen der Färbelösung zu vermeiden, Deckgläser aufsetzen und 10 min bei 25 °C inkubieren. Deckgläser entfernen, Objektträger 4 x 1 Sek. in 2x SSC waschen. Folien mit Luft einblasen. 15 μl ProLong Gold Antifading-Reagenz auftragen. Deckgläser aufkleben.

3. Dialesen mit einem automatischen Fluoreszenz-Bildgebungssystem

Dieser Abschnitt beschreibt die Verwendung der Duet-Software, die standardmäßig mit dem automatisierten Scansystem ACCORD PLUS geliefert wird. Die Anweisungen beginnen nach dem Einschalten in dieser Reihenfolge: Olympus U-RFL-T Netzteil für eine Halogenlampe, Computer Dell precision T3500, Mikroskop Olympus BX61 mit angeschlossener Kamera Olympus U-CMAD3.

1. Um 10x Pre-Scan einzurichten, öffnen Sie die Duet-Software im automatisierten ACCORD PLUS Scansystem. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Online". Geben Sie eine neue Fall-ID ein und weisen Sie eine Folien-ID zu. Klicken Sie auf den Punkt mit der Bezeichnung "BF". Dies ist die Hellfeld-Option. Stellen Sie die Scan-Option auf "10x Prescan" ein. Verwenden Sie "2500x Kreis", "10000x Kreis" oder "Rechteck". Klicken Sie auf "Set&Run" für 10x Pre-Scan.
2. Klicken Sie auf die Schaltfläche "OK", um 10x Pre-Scan auszuführen. Befolgen Sie die Anweisungen, um den Scanvorgang richtig einzustellen. Klicken Sie auf "Fertigstellen", um den Scan zu starten. Drücken Sie auf die Registerkarte "Main", um zum Hauptbildschirm zurückzukehren. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Offline". Suchen Sie die zugewiesene Fall-ID und Folien-ID und klicken Sie auf "Offline-Scan". Klicken Sie in der schwarzen Box oben links auf einen Pfeil und wählen Sie "10x Prescan". Gehen Sie mit den Pfeilen (< || Δ > auch bekannt als Tasten "Zurück", "Pause", "Wiedergabe", "Vorwärts") durch die gescannten Bilder.
3. Nachdem Sie ein interessantes Bild gefunden haben, doppelklicken Sie auf den Bildschirm in der Mitte des Zielbereichs und drücken Sie auf "Snap". Dadurch wird ein Bild für die spätere Erfassung als Ziel verwendet. Nachdem Sie alle Ziele ausgewählt haben, klicken Sie auf "Klassifizieren". Wählen Sie "10x Prescan". Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf ein Bild und erhalten Sie die Möglichkeit, die Bilder zu klassifizieren. Wählen Sie "Polyten".
4. Richten Sie 40x Pre-Scan in der Duet-Software ein. Klicken Sie auf "Haupt", um zum Hauptmenü zurückzukehren. Wählen Sie erneut "Online". Wählen Sie eine Folie aus. Ändern Sie "BF" in "FL". Ändern Sie den Aufgabennamen in "Revisit-X40-RG". Ändern Sie den Abschnitt direkt unter der letzten Einstellung in "ALLE erneut besuchen". Klicken Sie auf "Set&Run". Drücken Sie auf "OK". Folgen Sie den Anweisungen erneut, um die Automatisierung einzurichten. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Mit dem Abgleichen von Ansichten beginnen", um 10x- und 40x-Bilder abzugleichen. Klicken Sie auf "Fertigstellen", um den Scan zu starten. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf "Klassifizieren" und sehen Sie sich die Bilder an.

4. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt grafisch das Schema der Hochdruck-Chromosomenpräparation. Dieser Schritt umfasst den Prozess des Quetschens und Abflachens von Chromosomen mit einem Dremel-Werkzeug und einem mechanischen Schraubstock sowie die Visualisierung der Chromosomen mit einem Phasenkontrastmikroskop. Abbildung 2 zeigt die Hybridisierung einer fluoreszenzmarkierten Sonde zur gezielten DNA-Gewinnung auf den Chromosomen-Objektträgerpräparaten unter Verwendung eines automatisierten Objektträger-Färbesystems, die Verwendung eines automatisierten Rastermikroskops zur Visualisierung und Kartierung der Sonden nach dem FISH-Experiment und das Platzieren und Ausrichten genomischer Gerüste auf den Chromosomen.

Präparationen von ovariellen Ammenzell-Polyten-Chromosomen von Weibchen von An. gambiae wurden mit der Hochdrucktechnik hergestellt. Diese Methode beschädigt oder verändert den größten Teil der Chromosomenstruktur nicht (Abbildung 3). Es flacht verbogene Chromosomen ab und legt so verborgene feine Banden frei, die bei normalen Präparaten nicht zu sehen sind (Abbildung 4).

Die in diesem Protokoll verwendeten Sonden sind genomische BAC-DNA-Klone, die aus einer ND-TAM BAC-Bibliothek gewonnen wurden, die aus der DNA des PEST-Stammes von An. gambiae generiert wurde. Die genomische DNA für diese Bibliothek wurde aus frisch geschlüpften Larven des ersten Stadiums beiderlei Geschlechts extrahiert. Abbildung 5 zeigt die Ergebnisse von FISH mit BAC-Klonen, die mit Polytenchromosomen von An. gambiae hybridisiert wurden.Dieses Verfahren wurde mit dem automatisierten Objektträgerfärbesystem Xmatrx durchgeführt. Unter Verwendung einer zytogenetischen Photomap für An. gambiae¹⁰ wurden zwei BAC-Klone, 102B24 (GenBank: BH372701, BH372694) und BAC 142O19 (GenBank: BH368703, BH368698), in den Unterabteilungen 16C bzw. 16D des 2R-Arms lokalisiert. Die BLAST-Suche gegen den An. gambiae-PEST-Stamm AgamP3-Assemblierung ¹⁴ identifizierte jedoch die Sequenzen, die homolog zu 102B24 und 142O19 in den Unterdivisionen 16B bzw. 17A des 2R-Arms sind (Tabelle 1). Daher kann die Übereinstimmung zwischen den genomischen Koordinaten und den zytogenetischen Unterteilungen nun entsprechend unseren Kartierungsdaten angepasst werden. Die BLAST-Suche gegen die Genomassemblierungen der An. gambiae M-Form und der S-Form ergab, dass sich die beiden BAC-Klone in unterschiedlichen Contigs, aber in den gleichen Gerüsten innerhalb jeder Form befinden (Tabelle 1). Die identifizierten Contigs können nun mit bestimmten Chromosomenorten in Verbindung gebracht werden. Darüber hinaus können die identifizierten Gerüste nun innerhalb der zytologischen Unterteilungen 16CD korrekt ausgerichtet werden. Interessanterweise betragen die Abstände zwischen den 102B24- und 142O19-Sequenzen in den Gerüsten 1.892.981 bp, 1.658.391 bp bzw. 1.688.426 bp in den Genomassemblierungen des PEST-Stammes, der M-Form und der S-Form. Da es sich bei dem PEST-Stamm um eine Hybride zwischen den M- und S-Formen handelt, ist dieser Unterschied wahrscheinlich auf eine falsche Assemblierung des PEST-Genoms zurückzuführen.

kg

BAC (Beitritt)	SCHÄDLINGSSTAMM AgamP3 Koordinaten	M-form contigs Koordinaten	M-form Gerüste Koordinaten	S-Form contigs Koordinaten	S-Form Gerüste Koordinaten
102B24 (BH372694)	2R:AAAB0100 8844_26 (16B) 43.681.342- 43.681.874	ABKP020247 53,1 32.513 33.045	EQ090167.1 1.858.377- 1.858.909	ABKQ010123 32.1 4.299 4.832	EQ099711.1 215.891- 216.424
102B24 (BH372701)	2R:AAAB0100 8844_28 (16B) 43.788.213- 43.788.969	ABKP020247 51.1 24.816- 25.575	EQ090167.1, 1.772.683- 1.773.442	ABKQ010123 35.1 27.782, 28.540	EQ099711.1, 305.514- 306.272
142O19 (BH368698)	2R:AAAB0100 8805_5 (17A) 45.428.580- 45.429.264	ABKP020247 01.1 2.499 3.185	EQ090167.1 315.806- 316.492	ABKQ010123 76.1 49.242- 49.942	EQ099711.1 1.791.625- 1.792.325
142O19 (BH368703)	2R:AAAB0100 8805_8 (17A) 45.560.099- 45.574.323	ABKP020220 17.1 30.971 32.469	EQ090167.1 200.518 202.016	ABKQ010123 79,1 27.760, 28.508	EQ099711.1 1.903.569- 1.904.317

Tabelle 1. BLAST-Ergebnisse der BAC-Endsequenzen gegen die Genomassemblierungen von An. gambiae.

Abbildung 1. Schematische Darstellung der Hochdruck-Chromosomenpräparation. Die Eierstöcke der Mücken werden im richtigen Entwicklungsstadium gezeigt.

Abbildung 2. Ein Schema, das automatisiertes FISH, Objektträger-Scanning und Chromosomen-Mapping von genomischen Gerüsten darstellt.

Abbildung 3. Eine Ausbreitung des Polyten-Chromosoms 3 von An. gambiae, die unter Verwendung der Hochdrucktechnik erhalten wurde. 3L und 3R markieren den linken und rechten Arm an ihren Telomeren. PH und IH weisen auf perizentrisches bzw. interkaläres Heterochromatin hin.

Abbildung 4. Vergleich von An. gambiae-Polyten-Chromosomen, die mit der traditionellen (oben) und Hochdrucktechnik (unten) hergestellt wurden. Die Bilder decken die Unterteilungen 29A-30E des Arms 3R (A) und 43D-46D des Arms 3L (B) ab.

Abbildung 5. FISH von BAC-Klonen auf polytene Chromosomen von An. gambiae. A) Hybridisierung von 102B24 (rotes Signal) mit dem 2R-Arm. B) Zweifarbiges FISH von 102B24 (rotes Signal) und 142O19 (blaues Signal) zu den Unterteilungen 16C bzw. 16D des gestreckten 2R-Arms. Pfeile zeigen Signale der Hybridisierung von BAC-Klonen an, die mit Cy3 (rot) und Cy5 (blau) markiert sind. C-die zentromerische Region. a/+ zeigt die heterozygote 2La-Inversion. Die Chromosomen wurden mit dem Fluorophor YOYO-1 gegengefärbt.

Diskussion

Der kritischste Schritt des Hochdruckverfahrens ist das ordnungsgemäße Zerquetschen der ovariellen Ammenzellen, die im Christophers-III-Stadium der Ovarialentwicklung isoliert wurden¹³. Unsachgemäßes Quetschen kann zu einer unzureichend verteilten Chromosomen führen, was zu Problemen bei der Bestimmung der Sondenpositionen nach FISH führen kann. Wenn die Chromosomen übermäßig gequetscht werden, können sie gebrochen oder verlängert werden, bis zu dem Punkt, an dem die Bandenmuster verloren gehen. Die Produktion mehrerer Objektträger sollte zu einer Konsistenz führen, wenn versucht wird, die Objektträger mit dem Dremel-Werkzeug zu quetschen, was die Gesamteffizienz der Objektträgerproduktion erhöht. Die Hochdrucktechnik wurde zunächst für frisch isolierte Speicheldrüsen von D. melanogaster⁹ entwickelt. Eierstöcke von Mücken werden jedoch routinemäßig in modifizierter Carnoy-Fixierlösung (3 Methanol: 1 Eisessig nach Volumen) konserviert, bevor sie für chromosomale Präparate verwendet werden. Daher haben wir das bestehende Hochdruckprotokoll so modifiziert, dass es für die fixierten Polytenchromosomen der ovariellen Ammenzelle der Malariamücke An. gambiae geeignet ist. Da der hohe Druck mit einem Präzisionsschraubstock ausgeübt wird, der über eine hochparallele Arbeitsfläche des gesamten Objektträgers verfügt, dauert die Vorbereitung des Chromosomenquetschs deutlich weniger Zeit als bei einer herkömmlichen Klopftechnik mit einem Radiergummi.

Weitere wichtige Schritte sind das ausreichende Einweichen der Follikel in 50%iger Propionsäure und das Erhitzen des Objektträgers. Beide Schritte sind wichtig, um die Chromosomen abzuflachen. Wenn sie vernachlässigt werden, können Chromosomen nach der Dehydrierung glänzend erscheinen, was möglicherweise zu einer Überfülle an Hintergrund führt, die mit einem Signal in FISH verwechselt werden kann. Die Hochdruck-Quetschtechnik funktioniert auch gut, wenn die gleichen Lösungen bei der Herstellung von mitotischen Chromosomenpräparationen verwendet werden. Die zusätzliche Spreizung und Abflachung hilft, die Chromosomen aus ihren Zellkernen besser zu exprimieren. Durch Hinzufügen von gleichem Druck sollten sie entsprechend abgeflacht werden, um Messungen und möglicherweise eine bessere Auflösung der durch Färbung sichtbaren Banden zu ermöglichen. Die Einzelheiten über die Isolierung mitotischer Chromosomen aus Mücken sind an anderer Stelle¹⁵ angegeben. Obwohl regelmäßige Kürbispräparate für viele Zwecke, einschließlich FISH ¹⁶ und Immunfärbung¹⁷, ausreichend sind, verringert die Hochdruckmethode nicht nur die potenzielle Varianz von einem Objektträger zum nächsten, sondern erhöht auch die allgemeine Chromosomenqualität, was zu einer höheren Detailgenauigkeit bei der Kartierung von Chromosomen führt. Dieses Verfahren kann auch zur Vorbereitung von Polyten-Chromosomenmembran-Objektträgern für die Laser-Capture-Mikrodissektion verwendet werden.

Zu den Einschränkungen der Hochdruckmethode gehören der Bruch des Objektträgers und die Überdehnung der Chromosomen. Ein Rutschenbruch, der durch zu starke Belastung des Schlittens über den Schraubstock verursacht wird, ist möglich, wird jedoch durch die Verwendung der im Artikel angegebenen Drücke begrenzt. Bei einer Überdehnung der Chromosomen besteht die Möglichkeit, dass die Chromosomen zu stark gedehnt werden und ihre Auflösung verlieren, wenn das Dremel-Werkzeug über einen längeren Zeitraum auf den Objektträger angewendet wird. Dies kann behoben werden, indem das Werkzeug für einen kurzen Zeitraum angewendet, unter dem Mikroskop überprüft und mehr Zeit mit dem Dremel-Werkzeug angewendet wird, wenn die Chromosomen unzureichend verteilt sind.

Ein traditionelles FISH-Protokoll umfasst eine Reihe von Wasch- und Inkubationsschritten, die in der Regel 5-20 Minuten dauern und während der gesamten Dauer des Experiments fast die volle Aufmerksamkeit eines Forschers erfordern. Darüber hinaus ist die Anzahl der Objektträger, die manuell bearbeitet werden können, in der Regel auf wenige Objektträger in einem bestimmten Experiment beschränkt. Im Gegensatz dazu führt ein automatisiertes Objektträgerfärbesystem alle Schritte (einschließlich Waschen, Inkubation, Sondenauftrag, Denaturierung, Hybridisierung, Deckglasaufbringen und -entfernen) automatisch durch. Dadurch werden bis zu 6-8 Arbeitsstunden für einen Forscher in einem FISH-Experiment frei. Darüber hinaus kann ein automatisiertes FISH-System den Durchsatz deutlich erhöhen. So ist das Xmatrx-System beispielsweise in der Lage, bis zu 40 Assays auf Einzelpräparaten und bis zu 80 Assays auf Doppelpräparationsobjektträgern gleichzeitig zu verarbeiten. Zu den Einschränkungen dieses Systems gehört, dass es für eine kleine Anzahl von FISH-Experimenten nicht effizient ist, da es die Herstellung großer Mengen an Lösungen erfordert. Darüber hinaus kann es sein, dass das im System programmierte FISH-Protokoll für neue Anwendungen Modifikationen und Anpassungen erfordert.

Ein Objektträger-Scansystem ist eine automatisierte Version eines Fluoreszenzmikroskops. Die automatische Tischbewegung und ein einfaches Bedienfeld des Mikroskops entlasten den Forscher und machen die Bedienung des Mikroskops extrem einfach. So ermöglicht die Software im ACCORD PLUS Scansystem beispielsweise die einfache Erfassung mehrerer Fluoreszenzkanäle und eine einfach zu verwaltende Bildaufnahme. Ein Beispiel dafür ist die Einbeziehung von Z-Stack-Erfassung, anstatt ein einzelnes Bild aufzunehmen. Die Software erfasst einen konfigurierbaren Z-Stapel von Bildern, um sicherzustellen, dass mindestens ein Bild scharf bleibt. Obwohl dieses System eher für die Aufnahme mehrerer Bilder (viele Zellen auf einem einzigen Objektträger) konzipiert ist, macht es das Auffinden von Chromosomen auf dem Objektträger immer noch viel einfacher als das manuelle Navigieren durch den Objektträger.

Sowohl das automatisierte Objektträgerfärbesystem als auch das Scansystem werden von zytogenetischen Kliniken routinemäßig für die FISH-Diagnostik von Chromosomenanomalien in menschlichen Zellen eingesetzt. In dieser Studie haben wir ein Protokoll entwickelt, das diese automatisierten Systeme für eine Anwendung in der Grundlagenforschung nutzt. Das automatisierte physikalische Kartierungsprotokoll mit hohem Durchsatz kann die schnelle Entwicklung physischer Chromosomenkarten für jede Spezies von Interesse erleichtern. Obwohl wir in diesem Bericht Polytenchromosomen für die physikalische Kartierung verwendet haben, können mitotische Chromosomen auch mit diesen Systemen verwendet werden. Es wäre sinnvoll, das Protokoll an mitotische Chromosomen anzupassen, da die Mehrzahl der Organismen keine lesbaren Polytenchromosomen entwickelt. Die Polytenchromosomen können, sofern verfügbar, jedoch nützliche Informationen über die Korrespondenz funktioneller Genomdomänen mit der Chromosomenstruktur bei höchster Auflösung liefern. Die Organisationsprinzipien der Polytenchromosomen, wie z. B. die Muster der Banden und Interbanden, wurden kürzlich mit denen der regulären Nichtpolyten-Chromosomen (Interphasenchromosomen) verglichen¹⁸. Daher hat die detaillierte physikalische Kartierung, die an Hochdruck-Chromosomenpräparaten durchgeführt wird, das Potenzial, DNA-Sequenzen mit spezifischen Chromosomenstrukturen wie Banden, Interbanden, Puffs, Zentromeren, Telomeren und Heterochromatin zu verknüpfen; So entstehen chromosomenbasierte Genomassemblierungen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
22x22 mm Mikroskop-Deckgläser	Fisher	12-544-10
18x18 mm Mikroskop-Deckgläser	Fisher	12-553-402
Essigsäure	Fisher	A491-212
Methanol	Fisher	A412-4
Propionsäure	Sigma-Aldrich	402907
Dremel 200 Rotationswerkzeug mit Flex-Schaft Aufsatz	Rand		3" Mehrzweck-Mini-Doppelschleifer (mit Ratenbegrenzer)
Speziell entwickelt 200 μ l Kunststoffspitzen (Kunststoffkanten mit Wulst) für Dremel-Werkzeug	Pipetman	F171300	Schneiden und Erhitzen des fetten Endes von Pipettenspitzen
Verzinnter beschichteter Schnellschraubstock	Avenger Gold Toolmaker	MTC-200-1	Präzisionsgeschliffen, quadratisch und parallel innerhalb von 0,00025
Drehmomentschlüssel	Craftsman	44593
ThermoBrite Slide Denaturierungs-/Hybridisierungssystem	Abbott Molecular	30-144110
25 mm Barriere-Objektträger	Abbott Molecular	XT108-SL
25 mm Deckgläser	Abbott Molecular	XT122-90X
Xmatrx Automatisiertes Objektträger-Färbesystem	Abbott Molecular	08L46-001
MZ6 Leica Stereomikroskop	Leica	VA-OM-E194-354	Es kann ein anderes Stereomikroskop verwendet werden
Olympus CX41 Phasenmikroskop	Olympus	CX41RF-5	Es kann ein anderes Phasenmikroskop verwendet werden
ACCORD PLUS Automated Scanning System	BioView (USA)	BV-5000-ACCP
10x PBS	Invitrogen	P5493
10% NBF (neutral gepuffertes Formalin)	Sigma-Aldrich	HT501128
99% Formamid	Fisher Scientific	BP227500
Dextransulfat-Natriumsalz	Sigma	D8906
20x SSC-Puffer	Invitrogen	AM9765
Natriumphosphat	Sigma-Aldrich	S3264
50x Denhardt-Lösung	Sigma-Aldrich	D2532
Natriumazid	Sigma-Aldrich	S2002
1 mM YOYO-1 iodid (491/509) Lösung in DMSO	Invitrogen	Y3601
ProLong Gold Antifading-Reagenz	Invitrogen	P36930
dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Fermente	R0141, R0151, R0161, R0171
Cy3-dUTP, Cy5-dUTP	GE Healthcare PA53022	, PA55022
BSA	Sigma	A3294
DNA-Polymerase I	Fermentas	EP0041
DNase I	Fermentas	EN0521