Genom-Assemblys, die auf massiv parallelen DNA-Sequenzierungstechnologien basieren, sind gewöhnlich stark fragmentiert. Die Erstellung physikalischer Chromosomenkarten kann die Genom-Assemblys möglicherweise verbessern. Hier demonstrieren wir innovative Ansätze zur Chromosomenpräparation, zur fluoreszenzmarkierten in situ-Hybridisierung und zur Bildgebung, die den Durchsatz bei der Entwicklung physikalischer Karten erheblich steigern.
Methodenartikel
High-Throughput-Physikalische Kartierung von Chromosomen unter Verwendung von Automated
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Es wird erwartet, dass Projekte zur Gewinnung von Ganzgenomsequenzen für 10.000 Wirbeltierarten1 und für 5.000 Insekten- und verwandte Arthropodenarten2 in den nächsten 5 Jahren durchgeführt werden. Beispielsweise erfolgt derzeit die Sequenzierung der Genome von 15 Malaria-Mückearten mithilfe einer Illumina-Plattform3,4. Dieser Anopheles-Artkomplex umfasst sowohl Vektoren als auch Nicht-Vektoren der Malaria. Sobald die Genomzusammenstellungen verfügbar sind, werden Forscher die einzigartige Gelegenheit haben, vergleichende Analysen durchzuführen, um evolutionäre Veränderungen im Hinblick auf die Vektorfähigkeit abzuleiten. Es hat sich jedoch als schwierig erwiesen, Sequenzierungsdaten der nächsten Generation für die Erstellung hochwertiger de-novo-Genomzusammenstellungen zu nutzen5. Zudem weisen die bisher verfügbaren Genomzusammenstellungen von Anopheles gambiae, obwohl sie mit der Sanger-Methode gewonnen wurden, Lücken oder Fragmentierungen auf4,6.
Der Erfolg vergleichender genomischer Analysen wird begrenzt sein, wenn Forscher mit zahlreichen Sequenzierungs-Contigs anstelle chromosomenbasierter Genom-Assemblys arbeiten. Fragmentierte, nicht zugeordnete Sequenzen verursachen Probleme für genomische Analysen, weil: (i) nicht identifizierte Lücken zu fehlerhaften oder unvollständigen Annotationen genomischer Sequenzen führen; (ii) nicht zugeordnete Sequenzen zu Verwechslungen zwischen paralogen Genen und Genen aus unterschiedlichen Haplotypen führen; und (iii) das Fehlen einer Chromosomenzuordnung und -orientierung der Sequenzierungs-Contigs die Rekonstruktion einer Rearrangements-Phylogenie und die Untersuchung der Chromosomenevolution unmöglich macht. Die Erstellung hochauflösender physikalischer Karten für Arten mit neu sequenzierten Genomen stellt eine zeitgemäße und kosteneffiziente Investition dar, die die Genomannotation, die evolutionäre Analyse sowie die Neusequenzierung individueller Genome aus natürlichen Populationen erleichtern wird7,8.
Hier stellen wir innovative Ansätze zur Chromosomenpräparation, zur fluoreszenzmarkierten in situ-Hybridisierung (FISH) und zur Bildgebung vor, die die schnelle Erstellung physikalischer Karten ermöglichen. Am Beispiel von An. gambiae zeigen wir, dass die Erstellung physikalischer Chromosomenkarten die Genom-Assemblys und damit die Qualität genomischer Analysen potenziell verbessern kann. Zunächst verwenden wir eine Hochdruckmethode zur Herstellung von Polytänchromosomenpräparaten. Diese Methode, ursprünglich für Drosophila9 entwickelt, ermöglicht es dem Anwender, mehr Details an den Chromosomen sichtbar zu machen als mit der herkömmlichen Quetschtechnik10. Zweitens kommt ein vollautomatisiertes Frontend-System für FISH zur Anwendung, das eine hochdurchsatzfähige physikalische Genomkartierung ermöglicht. Das automatisierte Objektträger-Färbungssystem führt mehrere Assays gleichzeitig durch und reduziert die manuelle Arbeitszeit erheblich11. Drittens scannt und fotografiert ein automatisiertes fluoreszierendes Bildgebungssystem, das einen motorisierten Objektträgertisch enthält, nach der FISH-Methode markierte Chromosomen automatisch12. Dieses System ist besonders nützlich, um mehrere chromosomale Platten auf demselben Objektträger zu identifizieren und sichtbar zu machen. Außerdem gewährleistet der Abtastprozess ein gleichmäßigeres FISH-Ergebnis. Insgesamt ist das automatisierte, hochdurchsatzfähige Verfahren zur physikalischen Kartierung effizienter als ein herkömmliches manuelles Protokoll.
Protokoll
1. Herstellung von Polytänchromosomen bei hohem Druck aus Ovarialnursezellen
- Sezieren Sie halbträchtige Anopheles-Weibchen 25 Stunden nach der Blutmahlzeit unter einem Stereomikroskop und fixieren Sie die Ovarien in frischer modifizierter Carnoy’scher Lösung mit Methanol (100 % Methanol : eisessige Säure, 3:1). Zu diesem Zeitpunkt befinden sich die Ovarien im Christophers-Stadium III, bei dem die Follikel eine ovale Form aufweisen und der transparente Bereich mit den Nährzellen innerhalb der Follikel rundlich ist13. Geben Sie die Ovarien von etwa fünf Weibchen in 500 μl modifizierter Carnoy’scher Lösung in einem 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen und lagern Sie sie 24 Stunden bei Raumtemperatur. Überführen Sie die Ovarien anschließend zur Langzeitlagerung bei -20 °C.
- Stellen Sie die modifizierte Carnoy’sche Lösung kurz vor dem Präparieren her, indem Sie Ethanol (100 % Ethanol : eisessige Säure, 3:1) und 50 % Propionsäure mischen. Geben Sie ein Ovarienpaar auf einen staubfreien Objektträger in einen Tropfen der modifizierten Carnoy’schen Lösung. Teilen Sie die Ovarien mit Hilfe von Präparationsnadeln in etwa sechs Abschnitte und legen Sie diese in Tropfen 50 %iger Propionsäure auf saubere Objektträger unter einem Stereomikroskop Leica MZ6. Verwenden Sie für jeden Abschnitt einen separaten Objektträger.
- Lösen Sie die Follikel vorsichtig mit Nadeln und entfernen Sie restliches Gewebe mit Filterpapier oder Küchenpapier unter dem Stereomikroskop. Geben Sie einen neuen Tropfen 50 %iger Propionsäure zu den Follikeln und lassen Sie diese 3–5 Minuten bei Raumtemperatur einwirken. Legen Sie ein Deckglas auf den Tropfen der 50 %igen Propionsäure. Lassen Sie das Präparat etwa 1 Minute stehen.
- Umwickeln Sie den Objektträger mit Filterpapier und Plastikfolie. Drücken Sie die Follikel mit einem Dremel-200-Rotationsgerät, das mit einem Flex-Schaft und einer weichen Kunststoffspitze ausgestattet ist, bei 3000–5000 U/min durch kreisförmiges Bewegen und leichtes Andrücken des Deckglases gleichmäßig auseinander, um die Kerne zu verteilen. Dieser Schritt sollte etwa 1 Minute dauern. Überprüfen Sie die Qualität der Verteilung mit einem Phasenkontrastmikroskop Olympus CX41 und einem 20x-Objektiv.
- Erstellen Sie ein Sandwich, indem Sie ein zusätzliches Deckglas neben das chromosomenbedeckende Deckglas legen und beide mit einem zweiten Objektträger abdecken. Dadurch wird die Gefahr verringert, dass der Objektträger in der Schraubzwinge zerquetscht wird. Wickeln Sie das Präparat mit der Plastikfolie, wie sie in Objektträgerbehältern enthalten ist, und Filterpapier ein, um das Sandwich zu stabilisieren und den Objektträger vor Kratzern durch die Zwickel zu schützen.
- Üben Sie Druck auf die Objektträger mithilfe einer mechanischen Schraubzwinge aus. Ein Drehmoment von 85–120 inch-lbs ist ausreichend und wird mit einem Drehmomentschlüssel erreicht. Dieser Schritt ist notwendig, um die Chromosomen so flach wie möglich zu machen.
- Entfernen Sie den zweiten Objektträger und das zusätzliche Deckglas. Erhitzen Sie den Objektträger mit dem chromosomenbedeckenden Deckglas 10–15 Minuten lang auf 55 °C in einem System zur Denaturierung/Hybridisierung von Objektträgern, um die Chromosomen weiter zu glätten. Tauchen Sie den Objektträger mindestens 15 Sekunden in flüssigen Stickstoff und entfernen Sie, sobald das Blasen aufgehört hat, das Deckglas rasch mit einer Rasierklinge. Stellen Sie die Objektträger unmittelbar für 5 Minuten in kalten 50 %igen Ethanol. Dehydrieren Sie die Objektträger nacheinander in 70 %, 90 % und 100 %igem Ethanol je 5 Minuten. Lassen Sie die Objektträger anschließend an der Luft trocknen.
2. FISH unter Verwendung eines automatisierten Objektträger-Färbegeräts
Das Programm ist am Xmatrx-Automatisierten Objektträgerfärbungssystem so eingerichtet, dass die folgenden Schritte durchgeführt werden, mit Ausnahme der Sondenmarkierung. Die ausführliche Nick-Translation-Markierungsanleitung ist in der Dokumentation beschrieben, die zusammen mit der DNA-Polymerase von Fermentas bereitgestellt wird.
- Vor der FISH-Analyse fluoreszierende Sonden herstellen, indem genomische BAC-DNA mit einem Fluorochrom über ein Nick-Translation-Protokoll markiert wird. 1 μg DNA, jeweils 0,05 mM unmarkiertes dATP, dCTP und dGTP sowie 0,015 mM dTTP, 1 μl Cy3- oder Cy5-dUTP, 0,05 mg/ml BSA, 5 μl 10x Nick-Translationspuffer, 20 Einheiten DNA-Polymerase I, 0,0012 Einheiten DNase I und nukleasefreies Wasser zu 25 μl Gesamtvolumen mischen. Das Verhältnis von DNA-Polymerase I zu DNase I wird empirisch so gewählt, dass Sonden mit einer Größe zwischen 300 und 500 bp entstehen. Die Mischung 1 Stunde bei 15 °C inkubieren.
- Die Objektträger und Reagenzien in das automatisierte Objektträgerfärbegerät Xmatrx geben und das Programm starten, um die folgenden Schritte durchzuführen. 800 μl 1x PBS 20 Minuten lang zugeben. Die Objektträger mit Luft abblasen. Die Fixierung mit Formalin durchführen, indem 450 μl 4 % Formalin in 1x PBS 1 Minute lang zugegeben werden, gefolgt von zwei Spülgängen mit 100 % Ethanol je 1 Sekunde und einem Spülgang mit 2 Minuten Dauer. Die Objektträger mit Luft abblasen.
- Die Objektträger 2 Minuten lang auf 45 °C erhitzen, um Blasenbildung beim Auftragen der Sonden zu vermeiden. 20 μl der DNA-Sonden auftragen, Tropfen Paraffinöl hinzufügen, um die Verdunstung der Hybridisierungslösung zu verhindern, und ein Deckglas auflegen. Chromosomen und DNA-Sonden durch Erhitzen der Objektträger auf 90 °C für 10 Minuten denaturieren.
- Zur Hybridisierung die Objektträger 14 Stunden bei 42 °C mit aufgelegtem Deckglas inkubieren. Die Hybridisierungslösung besteht aus 2x SSC, 100 mM Natriumphosphat, 1x Denhardt-Lösung, 100 μg/ml Natriumazid und 10 % Dextran Sulfat in Formamid.
- Für die Stringenzwäschen die Objektträger 2 Minuten lang auf 42 °C erhitzen, die Deckgläser entfernen und die Objektträger viermal je 1 Sekunde in 2x SSC waschen. Die Objektträger mit Luft abblasen. Jeweils zweimal 800 μl 0,4x SSC bei 42 °C 10 Minuten lang zugeben. Die Objektträger bei 25 °C 10 Minuten lang in 2x SSC waschen.
- Die Chromosomenanfärbung durchführen, indem 50 μl 1 μM YOYO-1 in 1x PBS aufgetragen werden. Tropfen Paraffinöl hinzufügen, um die Verdunstung der Färbelösung zu verhindern, Deckgläser auflegen und 10 Minuten bei 25 °C inkubieren. Die Deckgläser entfernen und die Objektträger viermal je 1 Sekunde in 2x SSC waschen. Die Objektträger mit Luft abblasen. 15 μl ProLong Gold Antifade-Reagenz auftragen. Deckgläser auflegen.
3. Schlidenbeurteilung mit einem automatischen fluoreszenzbasierten Bildgebungssystem
Dieser Abschnitt beschreibt die Verwendung der Duet-Software, die standardmäßig mit dem automatisierten ACCORD PLUS-Scansystem geliefert wird. Die Anweisungen beginnen nach dem Einschalten in folgender Reihenfolge: Olympus U-RFL-T-Netzteil für eine Halogenlampe, Computer Dell Precision T3500, Mikroskop Olympus BX61 mit angeschlossener Kamera Olympus U-CMAD3.
- Öffnen Sie die Duet-Software im ACCORD PLUS automatisierten Scansystem, um den 10x-Vorscan einzurichten. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Online“. Geben Sie eine neue Fall-ID ein und weisen Sie eine Objektträger-ID zu. Klicken Sie auf den Punkt mit der Bezeichnung „BF“. Dies ist die Hellfeld-Option. Wählen Sie als Scan-Option „10x Prescan“. Verwenden Sie „2500x circle“, „10000x circle“ oder „rectangle“. Klicken Sie auf „Set&run“, um den 10x-Vorscan zu starten.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche „OK“, um den 10x-Vorscan auszuführen. Befolgen Sie die Anweisungen, um den Scanvorgang korrekt einzustellen. Klicken Sie auf „Finish“, um den Scan zu starten. Drücken Sie die Registerkarte „Main“, um zum Hauptbildschirm zurückzukehren. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Offline“. Suchen Sie die zugewiesene Fall-ID und Objektträger-ID und klicken Sie auf „Offline Scan“. Klicken Sie in der schwarzen Box im oberen linken Bereich auf einen Pfeil und wählen Sie „10x Prescan“. Navigieren Sie mithilfe der Pfeile (< || Δ >, auch bekannt als „zurück“, „pause“, „play“, „vorwärts“-Tasten) durch die gescannten Bilder.
- Nachdem Sie ein Bild von Interesse gefunden haben, doppelklicken Sie auf den Bildschirm in der Mitte des Zielbereichs und drücken Sie „Snap“. Dadurch wird ein Bild für die spätere Aufnahme markiert. Klicken Sie nach Auswahl aller Ziele auf „Classify“. Wählen Sie „10x Prescan“. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf ein Bild, um die Möglichkeit zu erhalten, die Bilder zu klassifizieren. Wählen Sie „Polytene“.
- Richten Sie den 40x-Vorscan in der Duet-Software ein. Klicken Sie auf „Main“, um zum Hauptmenü zurückzukehren. Wählen Sie erneut „Online“. Wählen Sie einen Objektträger aus. Ändern Sie „BF“ in „FL“. Ändern Sie den Aufgabennamen in „Revisit-X40-RG“. Ändern Sie den Abschnitt direkt unter der letzten Einstellung in „Revisit-ALL“. Klicken Sie auf „Set&Run“. Drücken Sie „OK“. Befolgen Sie erneut die Anweisungen, um die Automatisierung einzurichten. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Start matching views“, um die 10x- und 40x-Bilder abzugleichen. Klicken Sie auf „Finish“, um den Scan zu starten. Klicken Sie danach auf „Classify“ und betrachten Sie die Bilder.
4. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt schematisch die Vorgehensweise zur Herstellung von Chromosomen unter hohem Druck. Dieser Schritt umfasst das Zerquetschen und Flachdrücken der Chromosomen mithilfe eines Dremel-Werkzeugs und einer mechanischen Schraubzwinge sowie die Visualisierung der Chromosomen mittels eines Phasenkontrstmikroskops. Abbildung 2 veranschaulicht die Hybridisierung einer fluoreszenzmarkierten Sonde an die Ziel-DNA auf den Chromosomenpräparaten unter Verwendung eines automatisierten Objektträger-Färbungssystems, den Einsatz eines automatisierten Scanningmikroskops zur Visualisierung und Kartierung der Sonden nach dem FISH-Experiment sowie das Platzieren und Ausrichten genomischer Scaffolds auf den Chromosomen.
Präparationen von polytänen Ovarialnursezellchromosomen aus Weibchen von An. gambiae wurden mithilfe der Hochdrucktechnik angefertigt. Diese Methode beschädigt oder verändert die meisten Chromosomenstrukturen nicht (Abbildung 3). Sie glättet gekrümmte Chromosomen und macht dadurch versteckte Feinbanden sichtbar, die in regulären Präparationen nicht zu erkennen sind (Abbildung 4).
Die in diesem Protokoll verwendeten Sonden sind genomische BAC-DNA-Klone, die aus einer ND-TAM-BAC-Bibliothek stammen, die aus DNA des An. gambiae-Stamms PEST gewonnen wurde. Die genomische DNA für diese Bibliothek wurde aus frisch geschlüpften Larven des ersten Entwicklungsstadiums beider Geschlechter isoliert. Abbildung 5 zeigt die Ergebnisse einer FISH-Analyse unter Verwendung von BAC-Klonen, die an Polytänchromosomen von An. gambiae hybridisiert wurden. Dieses Verfahren wurde mit dem automatisierten Objektträgerfärbungssystem Xmatrx durchgeführt. Anhand einer zytogenetischen Fotokarte für An. gambiae10 wurden zwei BAC-Klone, 102B24 (GenBank: BH372701, BH372694) und BAC 142O19 (GenBank: BH368703, BH368698), den Unterteilungen 16C bzw. 16D des 2R-Arms zugeordnet. Eine BLAST-Suche gegen die AgamP3-Genomassembly des An. gambiae-Stamms PEST14 identifizierte jedoch die Sequenzen, die homolog zu 102B24 und 142O19 sind, in den Unterteilungen 16B bzw. 17A des 2R-Arms (Tabelle 1). Daher kann die Zuordnung zwischen den genomischen Koordinaten und den zytogenetischen Unterteilungen nun anhand unserer Kartierungsdaten korrigiert werden. Die BLAST-Suche gegen die Genom-Assemblies der M-Form und S-Form von An. gambiae ergab, dass sich die beiden BAC-Klone in unterschiedlichen Contigs, jedoch in denselben Scaffolds innerhalb jeder Form befinden (Tabelle 1). Die identifizierten Contigs können nun bestimmten chromosomalen Positionen zugeordnet werden. Darüber hinaus können die identifizierten Scaffolds innerhalb der zytologischen Unterteilungen 16CD korrekt orientiert werden. Interessanterweise betragen die Abstände zwischen den Sequenzen 102B24 und 142O19 in den Scaffolds 1.892.981 bp, 1.658.391 bp und 1.688.426 bp in den Genom-Assemblies des PEST-Stamms, der M-Form bzw. der S-Form. Da der PEST-Stamm ein Hybrid aus der M- und der S-Form ist, liegt dieser Unterschied wahrscheinlich an einer fehlerhaften Assembly des PEST-Genoms.
| BAC (Zugangsnummer) | PEST-Stamm AgamP3 Koordinaten | M-Form Contigs Koordinaten | M-Form Scaffolds Koordinaten | S-Form Contigs Koordinaten | S-Form Scaffolds Koordinaten |
| 102B24 (BH372694) | 2R:AAAB0100 8844_26 (16B) 43.681.342- 43.681.874 | ABKP020247 53,1 32.513- 33.045 | EQ090167.1 1.858.377- 1.858.909 | ABKQ010123 32,1 4.299- 4.832 | EQ099711.1 215.891- 216.424 |
| 102B24 (BH372701) | 2R:AAAB0100 8844_28 (16B) 43.788.213- 43.788.969 | ABKP020247 51,1 24.816- 25.575 | EQ090167.1, 1.772.683- 1.773.442 | ABKQ010123 35,1 27.782- 28.540 | EQ099711.1, 305.514- 306.272 |
| 142O19 (BH368698) | 2R:AAAB0100 8805_5 (17A) 45.428.580- 45.429.264 | ABKP020247 01,1 2.499- 3.185 | EQ090167.1 315.806- 316.492 | ABKQ010123 76,1 49.242- 49.942 | EQ099711.1 1.791.625- 1.792.325 |
| 142O19 (BH368703) | 2R:AAAB0100 8805_8 (17A) 45.560.099- 45.574.323 | ABKP020220 17,1 30.971- 32.469 | EQ090167.1 200.518- 202.016 | ABKQ010123 79,1 27.760- 28.508 | EQ099711.1 1.903.569- 1.904.317 |
Tabelle 1. BLAST-Ergebnisse der BAC-Endsequenzen im Vergleich mit den Genomzusammenstellungen von An. gambiae.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Chromosomenpräparation unter hohem Druck. Mückenovarien sind im korrekten Entwicklungsstadium dargestellt.
Abbildung 2. Ein Schema, das die automatisierte FISH, die Objektträgerabtastung und die Chromosomenkartierung genomischer Scaffolds darstellt.
Abbildung 3. Eine Ausbreitung des Polytänchromosoms 3 von An. gambiae, erhalten mit der Hochdrucktechnik. 3L und 3R markieren die linke bzw. rechte Chromosomenarme an ihren Telomeren. PH und IH zeigen perizentrische bzw. interkalar heterochromatische Regionen an.
Abbildung 4. Vergleich von An. gambiae-Polytänchromosomen, die mit der traditionellen (oben) und der Hochdruckmethode (unten) präpariert wurden. Die Aufnahmen zeigen die Unterteilungen 29A–30E des Arms 3R (A) und 43D–46D des Arms 3L (B).
Abbildung 5. FISH von BAC-Klonen an Polytänchromosomen von An. gambiae. A) Hybridisierung von 102B24 (rotes Signal) mit dem 2R-Arm. B) Zweifarbige FISH von 102B24 (rotes Signal) und 142O19 (blaues Signal) an die Untereinteilungen 16C und 16D des gestreckten 2R-Arms. Pfeile zeigen die Hybridisierungssignale von BAC-Klonen, markiert mit Cy3 (rot) und Cy5 (blau). C – der zentromere Bereich. a/+ zeigt die heterozygote 2La-Inversion. Die Chromosomen wurden mit dem Fluorophor YOYO-1 kontrastgefärbt.
Diskussion
Der kritischste Schritt des Hochdruckverfahrens ist das sachgemäße Zerquetschen von isolierten Ovarnachzellen im Christophers-III-Stadium der Ovarentwicklung13. Eine unsachgemäße Zerquetschung kann zu unzureichend ausgebreiteten Chromosomen führen, was Probleme bei der Bestimmung der Sondenpositionen nach FISH verursachen kann. Werden die Chromosomen zu stark zerquetscht, können sie zerbrechen oder derart in die Länge gezogen werden, dass die Bandmuster verloren gehen. Die Herstellung mehrerer Objektträger führt zu einer konsistenteren Zerquetschung der Präparate mithilfe des Dremel-Werkzeugs, wodurch die Gesamteffizienz der Objektträgerherstellung steigt. Die Hochdrucktechnik wurde ursprünglich für frisch isolierte Speicheldrüsen von D. melanogaster9 entwickelt. Ovarien von Mücken werden jedoch routinemäßig in einer modifizierten Carnoy’schen Fixierlösung (3 Methanol : 1 Eisessig nach Volumen) konserviert, bevor sie für chromosomale Präparationen verwendet werden. Daher haben wir das bestehende Hochdruckprotokoll angepasst, um es für die fixierten polyten Chromosomen der Ovarnachzellen der Malariamücke An. gambiae geeignet zu machen. Da der hohe Druck mittels einer Präzisionsklemmbacke aufgebracht wird, die über eine hochgradig parallele Arbeitsfläche über den gesamten Objektträger verfügt, ist die Herstellung der Chromosomenpräparation deutlich schneller als mit der traditionellen Klopftechnik unter Verwendung eines Radiergummis eines Bleistifts.
Weitere wichtige Schritte umfassen das ausreichende Einweichen der Follikel in 50%iger Propionsäure und das Erhitzen des Objektträgers. Beide Schritte sind entscheidend, um die Chromosomen zu entfalten. Werden sie vernachlässigt, können die Chromosomen nach der Dehydrierung glänzend erscheinen, was zu einer übermäßigen Hintergrundfärbung führen kann, die fälschlicherweise als Signal in der FISH interpretiert wird. Die Hochdruck-Präparationstechnik funktioniert ebenfalls gut mit denselben Lösungen bei der Herstellung von mitotischen Chromosomenpräparationen. Die zusätzliche Ausbreitung und Flachdrückung trägt dazu bei, die Chromosomen besser aus ihren Kernen herauszulösen. Durch gleichmäßigen Druck werden sie entsprechend geebnet, was Messungen und möglicherweise eine verbesserte Auflösung der durch Färbung sichtbaren Banden ermöglicht. Die Einzelheiten zur Isolierung mitotischer Chromosomen aus Mücken sind an anderer Stelle beschrieben15. Obwohl herkömmliche Präparationen durch Quetschen für viele Zwecke ausreichend sind, einschließlich FISH 16 und Immunfärbungen17, verringert die Hochdruckmethode nicht nur die potenzielle Variabilität von Objektträger zu Objektträger, sondern verbessert auch die Gesamtqualität der Chromosomen, was zu einer höheren Detailgenauigkeit bei der Kartierung führt. Dieses Verfahren kann ebenfalls zur Herstellung von Polytänchromosomen-Membranpräparaten für die Laser-Mikrodissektion verwendet werden.
Zu den Einschränkungen der Hochdruckmethode gehören das Zerbrechen der Objektträger und eine übermäßige Dehnung der Chromosomen. Das Zerbrechen der Objektträger kann auftreten, wenn durch den Schraubstock zu großer Druck auf den Objektträger ausgeübt wird; dies lässt sich jedoch durch die im Artikel angegebenen Druckwerte begrenzen. Bei einer übermäßigen Dehnung der Chromosomen besteht die Möglichkeit, dass diese zu stark auseinandergezogen werden und an Auflösung verlieren, falls das Dremel-Gerät über einen längeren Zeitraum auf den Objektträger angewendet wird. Dies kann behoben werden, indem das Gerät nur kurz eingesetzt, anschließend unter dem Mikroskop überprüft und gegebenenfalls bei unzureichender Verteilung der Chromosomen erneut mit dem Dremel-Gerät nachgearbeitet wird.
Ein herkömmliches FISH-Protokoll umfasst eine Reihe von Wasch- und Inkubationsschritten, die gewöhnlich 5–20 Minuten dauern und während der gesamten Versuchsdauer nahezu die volle Aufmerksamkeit eines Forschenden erfordern. Zudem ist die Anzahl der manuell bearbeitbaren Objektträger in einem gegebenen Experiment meist auf wenige Objektträger begrenzt. Im Gegensatz dazu führt ein automatisiertes Färbegerät alle Schritte (einschließlich Waschen, Inkubation, Probenauftrag, Denaturierung, Hybridisierung, Aufbringen und Entfernen der Deckgläser) automatisch durch. Dadurch werden im FISH-Experiment bis zu 6–8 Arbeitsstunden pro Forschenden freigesetzt. Außerdem kann ein automatisiertes FISH-System die Durchsatzleistung erheblich steigern. Beispielsweise ist das Xmatrx-System in der Lage, gleichzeitig bis zu 40 Assays auf Einzelpräparations-Objektträgern und bis zu 80 Assays auf Doppelpräparations-Objektträgern zu bearbeiten. Zu den Einschränkungen dieses Systems gehört, dass es bei einer geringen Anzahl von FISH-Experimenten nicht effizient ist, da große Lösungsvolumina vorbereitet werden müssen. Außerdem kann das im System programmierte FISH-Protokoll für neue Anwendungen Modifikationen und Anpassungen erfordern.
Ein Slide-Scanning-System ist eine automatisierte Version eines fluoreszierenden Mikroskops. Durch die automatische Verstellung des Objekttisches und ein einfaches Mikroskop-Bedienfeld wird die Forscherzeit entlastet und die Bedienung des Mikroskops äußerst vereinfacht. Beispielsweise ermöglicht die Software des ACCORD-PLUS-Scanning-Systems eine einfache Aufnahme mehrerer Fluoreszenzkanäle sowie eine übersichtliche Verwaltung der Bildakquisition. Ein Beispiel hierfür ist die Möglichkeit, statt einer Einzelaufnahme einen Z-Stack aufzunehmen; die Software erfasst dabei einen konfigurierbaren Stapel von Z-Aufnahmen, um sicherzustellen, dass mindestens ein Bild scharf bleibt. Obwohl dieses System vor allem für die Mehrfachbildaufnahme konzipiert ist (viele Zellen auf einem Objektträger), erleichtert es dennoch das Auffinden von Chromosomen auf dem Objektträger im Vergleich zur manuellen Durchsuchung erheblich.
Sowohl das automatisierte Objektträger-Färbungssystem als auch das Scansystem werden routinemäßig in zytogenetischen Laboren für die FISH-Diagnostik chromosomaler Abnormalitäten in menschlichen Zellen eingesetzt. In dieser Studie haben wir ein Protokoll entwickelt, das diese automatisierten Systeme für eine grundlegende Forschungsanwendung nutzt. Das automatisierte Hochdurchsatz-Verfahren zur physikalischen Kartierung kann die schnelle Erstellung physikalischer Chromosomenkarten für jede interessierende Spezies erleichtern. Obwohl wir in diesem Bericht polytäne Chromosomen für die physikalische Kartierung verwendet haben, können auch mitotische Chromosomen mit diesen Systemen eingesetzt werden. Es wäre sinnvoll, das Protokoll an mitotische Chromosomen anzupassen, da die Mehrheit der Organismen keine auswertbaren polytänen Chromosomen ausbildet. Allerdings können polytäne Chromosomen, falls verfügbar, nützliche Informationen über die Zuordnung funktioneller Genomdomänen zur Chromosomenstruktur mit höchster Auflösung liefern. Die organisationsprinzipien polytäner Chromosomen, wie Banden- und Interbandenmuster, wurden kürzlich mit denen regulärer nicht-polytäner (Interphase-)Chromosomen verglichen18. Daher besteht das Potenzial, durch detaillierte physikalische Kartierung an hochkomprimierten Chromosomenpräparationen DNA-Sequenzen spezifischen chromosomalen Strukturen wie Banden, Interbanden, Puffs, Zentromeren, Telomeren und Heterochromatin zuzuordnen und somit chromosomenbasierte Genom-Assemblys zu erstellen.
Offenlegungen
Keine Interessenkonflikte erklärt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch eine Förderung der National Institutes of Health (1R21AI094289) an Igor V. Sharakhov unterstützt. Das Xmatrx Automated Slide Staining System und das ACCORD PLUS Automated Scanning System wurden mit Hilfe des Equipment Trust Fund-Programms, des Fralin Life Science Institute, der Abteilung für Entomologie und der Abteilung für Biochemie der Virginia Tech erworben.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 22x22 mm Mikroskop-Deckgläser | Fisher | 12-544-10 | |
| 18x18 mm Mikroskop-Deckgläser | Fisher | 12-553-402 | |
| Essigsäure | Fisher | A491-212 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | |
| Propionsäure | Sigma-Aldrich | 402907 | |
| Dremel 200 Rotationstool mit Flexwellen-Aufsatz | Rand | 3" Multifunktions-Mini-Schleifbock (mit Drehzahlbegrenzer) | |
| Speziell konstruierte 200 μl Kunststoffspitzen (mit geriffelten Kunststoffkanten) für Dremel-Tool | Pipetman | F171300 | Schneiden und erhitzen Sie das dicke Ende der Pipettenspitzen |
| Zinnbeschichteter Schnellspannbacken-Reiter | Avenger Gold Toolmaker | MTC-200-1 | Präzisionsgeschliffen, quadratisch und parallel innerhalb von 0,00025 |
| Drehmomentschlüssel | Craftsman | 44593 | |
| ThermoBrite Objektträger-Denaturierungs-/Hybridisierungssystem | Abbott Molecular | 30-144110 | |
| 25 mm Barrier-Objektträger | Abbott Molecular | XT108-SL | |
| 25 mm Deckgläser | Abbott Molecular | XT122-90X | |
| Xmatrx Automatisiertes Objektträger-Färbungssystem | Abbott Molecular | 08L46-001 | |
| MZ6 Leica Stereomikroskop | Leica | VA-OM-E194-354 | Ein anderes Stereomikroskop kann verwendet werden |
| Olympus CX41 Phasenkontrastmikroskop | Olympus | CX41RF-5 | Ein anderes Phasenkontrastmikroskop kann verwendet werden |
| ACCORD PLUS Automatisiertes Scansystem | BioView (USA) | BV-5000-ACCP | |
| 10x PBS | Invitrogen | P5493 | |
| 10 % NBF (neutral gepuffertes Formalin) | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 99 % Formamid | Fisher Scientific | BP227500 | |
| Dextran-Sulfat-Natriumsalz | Sigma | D8906 | |
| 20x SSC-Puffer | Invitrogen | AM9765 | |
| Natriumphosphat | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| 50x Denhardt-Lösung | Sigma-Aldrich | D2532 | |
| Natriumazid | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 1 mM YOYO-1-Iodid (491/509) Lösung in DMSO | Invitrogen | Y3601 | |
| ProLong Gold Antifade-Reagenz | Invitrogen | P36930 | |
| dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Fermentas | R0141, R0151, R0161, R0171 | |
| Cy3-dUTP, Cy5-dUTP | GE Healthcare | PA53022, PA55022 | |
| BSA | Sigma | A3294 | |
| DNAPolymerase I | Fermentas | EP0041 | |
| DNase I | Fermentas | EN0521 |
Referenzen
- Genome 10K: a proposal to obtain whole-genome sequence for 10,000 vertebrate species. J. Hered. 100, 659-674 (2009).
- Robinson, G. E., et al. Creating a Buzz About Insect Genomes. Science. 331, 1386-1386 (2011).
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Nachdrucke und Genehmigungen
