Isolierung und Charakterisierung von dendritischen Zellen und Makrophagen aus dem Mausdarm

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Methodik für die schnelle Isolierung von dendritischen Zellen (DCs) und Makrophagen aus dem Darm der Maus. Die phänotypische Charakterisierung von intestinalen DCs und Makrophagen erfolgt mittels mehrfarbiger durchflusszytometrischer Analyse, während eine magnetische Bead-Anreicherung gefolgt von einer Zellsortierung verwendet wird, um hochreine Populationen für funktionelle Studien zu erhalten.

Zusammenfassung

Im Darm befinden sich einzigartige Populationen von angeborenen und adaptiven Immunzellen, die an der Förderung der Toleranz gegenüber kommensalen Pflanzen- und Nahrungsantigenen beteiligt sind, während sie gleichzeitig bereit sind, Entzündungsreaktionen gegen invasive Krankheitserreger auszulösen^1,2. Antigen-präsentierende Zellen, insbesondere DCs und Makrophagen, spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der intestinalen Immunhomöostase über ihre Fähigkeit, die Mikrobiota zu erkennen und angemessen auf sie zu reagieren^3-14. Die effiziente Isolierung von intestinalen DCs und Makrophagen ist ein entscheidender Schritt bei der Charakterisierung des Phänotyps und der Funktion dieser Zellen. Während viele wirksame Methoden zur Isolierung von intestinalen Immunzellen, einschließlich DCs und Makrophagen, beschrieben wurden^6,10,15-24, beruhen viele auf langen Verdauungszeiten, die die Antigenexpression der Zelloberfläche, die Zellviabilität und/oder die Zellausbeute negativ beeinflussen können. Hier beschreiben wir eine Methodik für die schnelle Isolierung einer großen Anzahl lebensfähiger, intestinaler DCs und Makrophagen. Die phänotypische Charakterisierung von intestinalen DCs und Makrophagen erfolgt durch direkte Färbung isolierter Darmzellen mit spezifischen fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörpern für die mehrfarbige durchflusszytometrische Analyse. Darüber hinaus werden hochreine DC- und Makrophagenpopulationen für funktionelle Studien mit CD11c und CD11b magnetisch aktivierten Zellsortierkügelchen mit anschließender Zellsortierung isoliert.

Protokoll

1. Dissektion und Dissoziation von intestinalen Epithelzellen

Vorbereitung von Reagenzien und Ausrüstung:

• Ca²⁺/Mg²⁺-freie PBS (CMF PBS) auf Raumtemperatur erwärmen.
• Erwärmen Sie Ca²⁺/Mg²⁺-freies HBSS mit 5% FBS (CMF HBSS/FBS) und 2mM EDTA auf Raumtemperatur.
• Den Orbital-Shaker auf 37 °C erwärmen.

Hinweis: Die Schritte 1.1 bis 1.7 müssen so schnell wie möglich durchgeführt werden, um das Ausmaß des Zelltods zu minimieren und eine maximale Zellausbeute zu erzielen.

1. Ethanasieren Sie Mäuse in einer CO₂ -Kammer und sprühen Sie 70% Ethanol auf den Bauch und den Thorax.
2. Machen Sie mit einer Schere einen kleinen horizontalen Schnitt in der Mitte des Bauches und schälen Sie die Haut zurück, um das Bauchfell freizulegen.
3. Trennen Sie den Magen vom oberen Dünndarm, indem Sie am Schließmuskel des Pylorus schneiden. Ziehen Sie das Mesenterium mit einer Pinzette weg und schneiden Sie erneut an der ileo-zäkalen Klappe, um den gesamten Dünndarm vom Dickdarm zu befreien. Machen Sie einen Schnitt am Analrand und toupieren Sie das Mesenterium erneut auseinander, bis der Dickdarm frei ist.
4. Den Dickdarm mit einer Schere längs aufschneiden und bei Raumtemperatur Stuhlinhalt und Schleim aus dem Darmlumen in CMF PBS abwaschen.
Verwenden
5. Sie eine Schere und eine Pinzette, um die Peyer-Flecken entlang der antimesenterialen Oberfläche des Dünndarms makroskopisch zu präparieren und den Dünndarm in Längsrichtung aufzuschneiden.
6. Waschen Sie das Dünndarmlumen mit Stuhlinhalt und Schleim in CMF PBS bei Raumtemperatur.
7. Schneiden Sie den Dünn-/Dickdarm separat in ca. 1,5 cm große Stücke und geben Sie sie in separate konische 50-ml-Röhrchen mit 30 ml vorgewärmtem CMF, HBSS/FBS und 2 mM EDTA. Fügen Sie nicht mehr als 1 Darm pro 50 ml konischem Röhrchen hinzu.
8. Jedes konische 50-ml-Röhrchen horizontal in einen Orbitalschüttler geben und 20 Minuten lang bei 37 °C bei 250 U/min schütteln.
9. Legen Sie ein einzelnes Drahtsieb über einen Abfalleimer und gießen Sie den Inhalt jedes 50-ml-Kegelröhrchens hindurch, um die 1,5 cm langen Darmstücke zu gewinnen, und geben Sie sie in separate konische 50-ml-Röhrchen mit 30 ml vorgewärmtem CHBSS/FBS mit 2 mM EDTA.
10. Wiederholen Sie 1.8.

2. Gewebeverdauung und Isolierung von Darmzellen

Vorbereitungen von Reagenzien und Ausrüstung:

• Kollagenaselösung: 1,5 mg/ml Kollagenase Typ VIII, gelöst in vorgewärmtem CMF HBSS/FBS mit 40 μg/ml DNase I.
• Vorgewärmtes CMF HBSS/FBS und 2mM EDTA.
• Vorgewärmter Orbitalschüttler bei 37 °C.
• Eiskaltes CMF HBSS/FBS.

1. Nach der zweiten Runde des Schüttelns den Inhalt jedes konischen 50-ml-Röhrchens durch das Sieb gießen und 1,5 cm große Darmstücke in ein kleines Plastik-Waagschiffchen geben, nachdem das überschüssige Medium mit einem Papiertuch abgetupft wurde.
2. Die 1,5 cm großen Darmstücke mit einer Schere direkt im Hantelboot zügig zerkleinern und den gehackten Darm in 20 ml Kollagenaselösung geben. Legen Sie jedes konische 50-ml-Röhrchen horizontal in einen Orbitalschüttler und verdauen Sie es bei 200 U/min für 10-20 Minuten bei 37 °C. Bitte beachten Sie die untenstehende Diskussion zur Optimierung.
3. Kurz vortexen, um eine gründliche Dissoziation des verbleibenden Darmgewebes zu gewährleisten, und durch ein 100-μm-Zellsieb direkt in ein konisches 50-ml-Röhrchen filtrieren.
4. Jedes konische Röhrchen von 50 ml mit CMF HBSS/FBS auffüllen und bei 1500 U/min für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Wenn bei Dickdarmproben nach der Zentrifugation kein festes Pellet beobachtet wird, sollten die Proben erneut für 3,5 min zentrifugiert werden. Wiederholen Sie diesen Waschschritt noch einmal.
5. Gießen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Zellpellet in eiskaltem CMF HBSS/FBS und legen Sie die Proben auf Eis.
6. Fahren Sie mit Abschnitt 3 für die FACS-Erfassung/-Analyse oder Abschnitt 4 für die Anreicherung von Magnetbeads für die Hochgeschwindigkeits-Zellsortierung fort.

3. Antikörperfärbung für die mehrfarbige durchflusszytometrische Analyse von DCs und Makrophagen

Vorbereitungen von Reagenzien und Ausrüstung:

• Eiskalter CMF PBS.
• Eiskalter Färbepuffer (CMF PBS + 5% FBS).
• Bereiten Sie die Färbung toter Zellen in eiskaltem CMF PBS in einer Verdünnung von 1:1000 mit dem LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit vor.
• Bereiten Sie den Antikörper-Färbecocktail vor, indem Sie die folgenden fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörper (mAbs) zum eiskalten Färbepuffer hinzufügen: CD45-PerCP, CD103-PE, CD11c-APC, MHC-II (I-A^b)-Alexa Fluor 700, CD11b-eFluor 450, F4/80-PE-Cy7.

1. Übertragen Sie die Zellen in ein 5-ml-Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden (FACS).
2. Waschen Sie die Zellen zweimal in eiskaltem CMF PBS.
3. Inkubieren Sie Proben mit toten Zellen 15 Minuten lang im Dunkeln auf Eis.
4. Waschen Sie die Zellen zweimal in eiskaltem CMF PBS.
5. Zellen mit 2.4G2 anti-FcγRIII/II in eiskaltem Färbepuffer für 10 min auf Eis blockieren.
6. Waschen Sie die Zellen in eiskaltem Färbepuffer.
7. Inkubieren Sie die Proben mit einem Antikörper-Färbecocktail für 20 Minuten auf Eis im Dunkeln.
8. Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem Färbepuffer und resuspendieren Sie die Proben in 400 μl eiskaltem Färbepuffer und passieren Sie die 40 μm Filterkappe auf FACS-Röhrchen.
9. Entnahme von Proben auf dem LSR II-Zytometer (BD), wie durch die Gating-Strategie in Abschnitt 5 und Abbildung 1 definiert.

4. Anreicherung von DCs und Makrophagen aus dem Darm

Vorbereitungen von Reagenzien und Ausrüstung:

• Eiskalter Färbepuffer (CMF PBS + 5% FBS).

1. Inkubieren Sie die Einzelzellsuspension aus Schritt 2.5 mit CD11b- und CD11c-MACS-Kügelchen gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Waschen Sie die Zellen mit eiskaltem Färbepuffer und anschließender Zentrifugation.
3. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet in 1 mL eiskaltem Färbepuffer resuspendiert und durch ein 100 μm Zellsieb und anschließend durch ein 40 μm Zellsieb geleitet.
4. Anreicherung für an magnetische Beads gebundene Zellen durch Positivselektion mit der MACS LS-Magnetsäule
.
5. Schritt 4.2 wiederholen und Überstand verwerfen.
6. Inkubieren Sie Zellen mit Oberflächenmarkern mAbs, wie in Schritt 3.7 beschrieben.
7. Mit magnetischen Kügelchen angereicherte Zellen zweimal mit eiskaltem Färbepuffer waschen. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 500 μl eiskaltem Färbepuffer ohne Natriumazid und geben Sie sie durch ein 40 μm Zellsieb in ein FACS-Röhrchen.
8. Fahren Sie mit der FACS-Sortierung auf dem BD ARIA II Cell Sorter fort, um die intestinalen DC- und/oder Makrophagen-Untergruppen von Interesse zu sortieren.

5. Gating-Strategie für LP-APCs

Hinweis: Bitte beachten Sie, dass ungefärbte Darmzellen als Negativkontrolle verwendet werden können, um die korrekte Platzierung der Tore zur Trennung positiver und negativer Populationen zu unterstützen.

1. Wie in Abbildung 1 gezeigt, erstellen Sie ein Punktdiagramm und schließen Sie Zellen aus, die für die Totzellenfärbung positiv sind (Abb. 1A), gefolgt von dem Ausschluss von Dublett-Ereignissen (Abb. 1B und C). Dann wird das Tor auf die interessierenden Zellen entsprechend der Vorwärts- und Seitwärtsstreuung gelegt, wobei darauf geachtet wird, dass Schmutz ausgeschlossen wird (Abb. 1D).
2. Erstellen Sie ein weiteres Dot Plot und ein weiteres Gate auf CD45⁺ und I-A^b+ Zellen, das APCs phänotypisch charakterisiert (Abb. 1E).
3. Analysieren Sie in einem separaten Punktdiagramm die CD11b- und CD11c-Expression, um spezifische DC- und Makrophagen-Untergruppen (R1, R2 und R3; Abb. 1F). Zellen von R1 sind CD11c⁺ CD11b^dumpfe/- Zellen. Die Region R2 ist so abgegrenzt, dass diese Zellen ein ähnliches Maß an Oberflächenexpression für CD11c aufweisen wie in Zellen von R1, aber Zellen von R2 exprimieren auch CD11b. Danach wird die R3-Region für Zellen bestimmt, die ^CD11b+ und CD11c^dull/- sind.
4. Analysieren Sie die Regionen R1, R2 und R3 weiter auf F4/80- und CD103-Expression, um Makrophagen- bzw. DC-Populationen zu unterscheiden. Die CD11c⁺ CD11b^dumpf/- Zellen von R1 exprimieren hohe Spiegel des αE-Integrins, CD103 und niedrige Spiegel von F4/80 (Abb. 1G). CD11b⁺CD11c⁺-Zellen von R2 bestehen aufgrund ihrer dichotomen Expression von CD103 und F4/80 sowohl aus DCs als auch aus Makrophagen (Abb. 1H). Schließlich stellen CD11b⁺CD11c^dumpfe/- Zellen von R3 Makrophagen dar, die auf dem phänotypischen Profil von F4/80⁺ und CD103^- basieren (Abb. 1I)¹⁶.

6. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1. Gating-Strategie für intestinale DCs und Makrophagen. Tote Zellen (A) und Dubletten (B und C) wurden zunächst von der Analyse ausgeschlossen, dann wurden die Dünndarmzellen entsprechend der Vorwärts- und Seitenstreuung (D) angesteuert, und die APCs wurden als CD45⁺I-A,^b+(E) definiert. Makrophagen und DCs wurden durch die Expression von CD11b und CD11c (F) identifiziert. Die CD103- und F4/80-Expression für Zellen, die auf R1 (G), R2 (H) und R3 (I) Populationen vorgesteuert sind, wurde analysiert.

Abbildung 2. Die Zellausbeute und die Qualität der Antikörperfärbung hängen von der Verdauungszeit ab. CD11b- und CD11c-Färbemuster und Gesamtzellausbeute an unter- (A, D), optimal (B, E) oder überverdautem (C, F) Darmgewebe.

Darmzellen wurden aus einem C57BL/6-Maus-Dünndarm isoliert und DCs und Makrophagen wurden mittels FACS auf dem BD LSR II analysiert. Spannung und Kompensation wurden mit ungefärbten und einfach fluorochromgefärbten Splenozyten eingestellt. Tote Zellen (Abb. 1A) und Dubletten (Abb. 1B und C) wurden zunächst von der Analyse ausgeschlossen. Die interessierenden Zellen wurden dann anhand von Vorwärts- und Seitenstreuung analysiert (Abb. 1D), gefolgt von einem Gating an CD45⁺- und I-A^b+-Zellen (Abb. 1E). Danach wurde die CD11b- und CD11c-Expression in den CD45⁺I-A^b+-Zellen untersucht, um drei Regionen (R1, R2 und R3; Abb. 1F). Die CD103- und F4/80-Expression in den drei Regionen wurde ausgewertet, um zwischen DCs bzw. Makrophagen zu unterscheiden. Die CD11c⁺ CD11b^dumpf/- Zellen von R1 exprimierten hohe Spiegel des αE-Integrins CD103 und niedrige Spiegel von F4/80 (Abb. 1G). CD11b⁺CD11c⁺-Zellen von R2 bestanden aufgrund ihrer dichotomen Expression von CD103 und F4/80 sowohl aus DCs als auch aus Makrophagen (Abb. 1H), während CD11b⁺CD11c-dumpfe^/-Zellen von R3 Makrophagen darstellen, die auf dem phänotypischen Profil von F4/80⁺ und CD103^- basieren (Abb. 1I)¹⁶. Makrophagen innerhalb des R2-Gatters und Makrophagen im R3-Tor haben ähnliche Vorwärts- und Seitenstreueigenschaften und sind durch die CD11c-Expression unterscheidbar. Die funktionale Dichotomie dieser Untergruppen ist noch nicht vollständig verstanden.

Die Beziehung zwischen der Dauer der Gewebeverdauung auf die Gesamtzellausbeute und der Expression von CD11b und CD11c ist in Abbildung 2 dargestellt. Darmgewebe, das 3 min lang verdaut wurde (Unterverdauung), ergab eine geringe Gesamtzellzahl (Abb. 2D) und damit nur wenige DCs und Makrophagen, die für die Charakterisierung zur Verfügung standen (Abb. 2A). Die Gewebeverdauung für 11 Minuten führte zu einer robusten Ausbeute an lebenden Zellen (Abb. 2E) mit Populationen von DCs und Makrophagen, die hohe Spiegel an CD11b und CD11c exprimierten und phänotypisch unterschiedlich waren (Abb. 2C). Im Gegensatz dazu führte ein 50-minütiger Verdau (Überverdau) zu einer ähnlichen Zellausbeute im Vergleich zum optimierten Verdau (Abb. 2E und F), jedoch wurde die Abgrenzung verschiedener Zellpopulationen anhand von CD11b und CD11c undurchsichtiger, da die Expression von CD11c abnahm (Abb. 2C) und die Anzahl toter Zellen zunahm (Daten nicht gezeigt).

Diskussion

Abbildung 3. Faktoren, die für die Optimierung der Zellausbeute und der Expression von Oberflächenantigenen wichtig sind. Die Zellausbeute und die Expression von Oberflächenantigenen werden direkt von der Dauer der Gewebeverdauung, den spezifischen Eigenschaften der Kollagenase, dem Grad der Ge...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1X PBS, Ca2+- und Mg2+frei
Hank's balanced salt solution (HBSS) mit phenolroter	Fisher Scientific	SH3001603
Natriumbicarbonat	Sigma-Aldrich	S6014
1M HEPES in 0,85% NaCl	Lonza Inc.	17-737E
Fötales Rinderserum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150H	Hitzeinaktiviertes
0,5M EDTA (pH 8,0)	Cellgro	46-034-CI
Kollagenase Typ VIII	Sigma-Aldrich	C2139
DNase I	Roche Gruppe	14785000	Stammlösung: 100mg/ml
LEBEND/TOT Fixierbares Aqua Dead Cell Stain Kit für 405 nm Anregung	Invitrogen	L34957	Anwendung bei 1:1000
CD45-PerCP mAb (30F11)	BD Biosciences	557235	Verwendung bei 1:100
CD103-PE mAb (M290)	BD Biosciences	557495	Verwendung bei 1:100
fcγ RIII/II mAb (2.4G2)	BD Biosciences	553141	Verwendung bei 1:200
CD11c-APC mAb (N418)	eBioscience	17-0114-82	Verwendung bei 1:100
MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAb	eBioscience	56-5321-82	Verwendung bei 1:100
CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70)	eBioscience	48-0112-82	Verwendung bei 1:200
F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8)	eBioscience	25-4801-82
CD11b Mikrokügelchen	Miltenyi Biotec	130-049-601
CD11c Mikrokügelchen	Miltenyi Biotec	130-052-001
50 mL konische Röhrchen	BD Biosciences	352098
Single Mesh Drahtsieb	Chefmate
Kleine Waage	Fisher Scientific	08-732-116
100 μ m Zell-Sieb	BD Biosciences	352360
40 μ m Zellsieb	BD Biosciences	352340
5 mL Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden	BD Biosciences	352235	Verwendung bei 1:100
MaxQ 4450 Tisch-Orbitalschüttler	Thermo Fisher Scientific, Inc.
LS MACS Säule	Miltenyi Biotec	130-042-401
LSR II	BD Biosciences
FACSAria II	BD Biosciences