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Methodenartikel

Isolierung und Charakterisierung von dendritischen Zellen und Makrophagen aus dem Mausdarm

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DOI:

10.3791/4040

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21. Mai 2012

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Emory University, 2Department of Pathology & Laboratory Medicine, Emory University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Methodik zur schnellen Isolierung von dendritischen Zellen (DCs) und Makrophagen aus der Mausdarmwand. Die phänotypische Charakterisierung der intestinalen DCs und Makrophagen erfolgt mittels mehrfarbiger Durchflusszytometrie, während eine Anreicherung mittels magnetischer Sphären in Kombination mit Zellsortierung hochreine Zellpopulationen für funktionelle Untersuchungen liefert.

Zusammenfassung

Im Darm befinden sich einzigartige Populationen angeborener und adaptiver Immunzellen, die daran beteiligt sind, die Toleranz gegenüber der Kommensalflora und Nahrungsantigenen zu fördern, und gleichzeitig bereitstehen, entzündliche Reaktionen gegen invasive Pathogene auszulösen1,2. Antigenpräsentierende Zellen, insbesondere DCs und Makrophagen, spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der intestinalen Immunhomöostase, da sie in der Lage sind, die Mikrobiota wahrzunehmen und angemessen darauf zu reagieren3–14. Eine effiziente Isolierung intestinaler DCs und Makrophagen ist ein entscheidender Schritt zur Charakterisierung des Phänotyps und der Funktion dieser Zellen. Obwohl bereits viele wirksame Methoden zur Isolierung intestinaler Immunzellen, einschließlich DCs und Makrophagen, beschrieben wurden6,10,15–24, basieren viele dieser Methoden auf langen Verdauungszeiten, die negativ die Expression von Oberflächenantigenen, die Zellviabilität und/oder die Zellausbeute beeinflussen können. Hier beschreiben wir eine Methodik zur schnellen Isolierung großer Mengen lebensfähiger intestinaler DCs und Makrophagen. Die phänotypische Charakterisierung intestinaler DCs und Makrophagen erfolgt durch direktes Anfärben der isolierten Darmzellen mit spezifischen fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörpern für die mehrfarbige Durchflusszytometrie. Darüber hinaus werden hochreine Populationen von DCs und Makrophagen für funktionelle Untersuchungen mittels magnetisch aktivierter Zellsortierperlen gegen CD11c und CD11b sowie anschließender Zellsortierung isoliert.

Protokoll

1. Dissektion und Dissoziation von intestinalen Epithelzellen

Herstellung der Reagenzien und Vorbereitung der Ausrüstung:

  • CMF-PBS (PBS ohne Ca2+/Mg2+) auf Raumtemperatur erwärmen.
  • CMF-HBSS (HBSS ohne Ca2+/Mg2+) mit 5 % FBS (CMF-HBSS/FBS) und 2 mM EDTA auf Raumtemperatur erwärmen.
  • Orbital-Schüttler auf 37 °C vorwärmen.

Hinweis: Die Schritte 1.1 bis 1.7 müssen so schnell wie möglich durchgeführt werden, um den Umfang des Zelltods zu minimieren und eine maximale Zellausbeute zu erzielen.

  1. Töten Sie die Mäuse in einer CO2-Kammer und besprühen Sie den Bauch- und Brustbereich mit 70%igem Ethanol.
  2. Führen Sie mit einer Schere einen kleinen horizontalen Schnitt in der Mitte des Abdomens durch und klappen Sie die Haut zurück, um das Peritoneum freizulegen.
  3. Trennen Sie den Magen vom oberen Dünndarm, indem Sie am Pylorus-Sphinkter schneiden. Lösen Sie das Mesenterium mit einer Pinzette und schneiden Sie erneut am Ileozäkal-Klappenübergang, um den gesamten Dünndarm vom Dickdarm zu lösen. Schneiden Sie am Anusrand und lösen Sie das Mesenterium weiter auf, bis der Dickdarm vollständig frei ist.
  4. Schneiden Sie den Dickdarm mit der Schere längs auf und spülen Sie fäkale Bestandteile und Schleim aus dem Darmlicht in CMF PBS bei Raumtemperatur aus.
  5. Entfernen Sie mit Schere und Pinzette makroskopisch die Peyer-Plaques entlang der antimesenterialen Seite des Dünndarms und schneiden Sie den Dünndarm längs auf.
  6. Spülen Sie das Darmlicht des Dünndarms von fäkalen Bestandteilen und Schleim in CMF PBS bei Raumtemperatur aus.
  7. Schneiden Sie Dünndarm und Dickdarm getrennt in etwa 1,5 cm lange Stücke und geben Sie diese in separate 50-ml-Konischgefäße, die jeweils 30 ml vorgewärmtes CMF HBSS/FBS mit 2 mM EDTA enthalten. Geben Sie nicht mehr als einen Darm pro 50-ml-Konischgefäß hinzu.
  8. Stellen Sie jedes 50-ml-Konischgefäß horizontal in einen Rüttelapparat und rütteln Sie 20 Minuten lang bei 250 U/min und 37 °C.
  9. Platzieren Sie ein einziges feines Metallsieb über einen Abfallbehälter und gießen Sie den Inhalt jedes 50-ml-Konischgefäßes durch, um die 1,5 cm langen Darmstücke zurückzugewinnen. Geben Sie diese in separate 50-ml-Konischgefäße, die jeweils 30 ml vorgewärmtes CHBSS/FBS mit 2 mM EDTA enthalten.
  10. Wiederholen Sie Schritt 1.8.

2. Gewebeverdauung und Isolierung von Darmzellen

Herstellung von Reagenzien und Vorbereitung des Geräts:

  • Kollagenase-Lösung: 1,5 mg/ml Typ VIII-Kollagenase, gelöst in vorgewärmtem CMF HBSS/FBS mit 40 μg/ml von DNase I
  • Vorwärmendes CMF HBSS/FBS und 2 mM EDTA.
  • Vorwärmer orbitaler Schüttler bei 37 °C.
  • Eiskalte CMF HBSS/FBS.
  1. Nach der zweiten Schüttelphase gießen Sie den Inhalt jedes 50-ml-Konischkolbens durch das Sieb und überführen 1,5 cm lange Darmstücke nach dem Vorsichtig-abtupfen überschüssiger Medien mit einem Papiertuch in ein kleines, plastisches Wiegeschälchen.
  2. Verkleinern Sie die 1,5 cm langen Darmstücke mithilfe einer Schere rasch direkt im Wiegeschälchen und geben Sie den zerkleinerten Darm in 20 ml Kollagenase-Lösung. Stellen Sie jeden 50-ml-Konischkolben horizontal in einen Rüttelapparat und inkubieren Sie 10–20 Minuten bei 37 °C mit 200 U/min. Siehe untenstehende Diskussion zur Optimierung.
  3. Vortexen Sie kurz, um eine vollständige Dissoziation verbliebener Darmgewebestücke sicherzustellen, und filtrieren Sie die Suspension direkt durch ein 100-μm-Zellsieb in einen 50-ml-Konischkolben.
  4. Füllen Sie jeden 50-ml-Konischkolben mit CMF HBSS/FBS auf und zentrifugieren Sie 5 Minuten bei 1500 U/min und 4 °C. Falls nach der Zentrifugation bei Kolonproben kein fester Pellet sichtbar ist, sollten die Proben erneut 3,5 Minuten zentrifugiert werden. Wiederholen Sie diesen Waschschritt ein weiteres Mal.
  5. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie den Zellpellet in eiskaltem CMF HBSS/FBS; stellen Sie die Proben anschließend auf Eis.
  6. Fahren Sie mit Abschnitt 3 zur FACS-Aufnahme/-Analyse oder mit Abschnitt 4 zur magnetischen Anreicherung mittels Mikroperlen für die Hochgeschwindigkeits-Zellsortierung fort.

3. Antikörper-Färbung für die mehrfarbige Durchflusszytometrie-Analyse von DCs und Makrophagen

Herstellung von Reagenzien und Vorbereitung des Geräts:

  • Kaltes CMF PBS.
  • Kaltes Färbepuffer (CMF PBS + 5 % FBS).
  • Bereiten Sie die Totzellen-Färbung in kaltem CMF PBS mit einer Verdünnung von 1:1000 unter Verwendung des LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit vor.
  • Bereiten Sie die Antikörper-Färbemischung vor, indem Sie die folgenden mit Fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörper (mAKs) zum kalten Färbepuffer hinzufügen: CD45-PerCP, CD103-PE, CD11c-APC, MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700, CD11b-eFluor 450, F4/80-PE-Cy7.
  1. Überführen Sie die Zellen in ein 5-ml-Rundbodentestgefäß aus Polystyrol (FACS-Röhrchen).
  2. Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem CMF-PBS.
  3. Incubieren Sie die Proben 15 Minuten lang auf Eis im Dunkeln mit einer Totzellen-Färbung.
  4. Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem CMF-PBS.
  5. Blockieren Sie die Zellen mit 2.4G2 Anti-FcγRIII/II in eiskaltem Färbe-Puffer für 10 Minuten auf Eis.
  6. Waschen Sie die Zellen in eiskaltem Färbe-Puffer.
  7. Incubieren Sie die Proben 20 Minuten lang auf Eis im Dunkeln mit einem Antikörper-Färbecocktail.
  8. Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem Färbe-Puffer, resuspendieren Sie die Proben in 400 μl eiskaltem Färbe-Puffer und filtrieren Sie sie durch einen 40-μm-Filterdeckel an den FACS-Röhrchen.
  9. Analysieren Sie die Proben am LSR II-Zytometer (BD) gemäß der in Abschnitt 5 und Abbildung 1 beschriebenen Torgestrategie.

4. Anreicherung von DCs und Makrophagen aus dem Darm

Herstellung von Reagenzien und Vorbereitung des Geräts:

  • Eiskaltes Färbepuffer (CMF PBS + 5 % FBS).
  1. Inkubieren Sie die aus Schritt 2,5 erhaltene Einzelzell-Suspension gemäß Herstelleranweisungen mit CD11b- und CD11c-MACS-Beads.
  2. Waschen Sie die Zellen mit eiskaltem Färbe-Puffer, gefolgt von einer Zentrifugation.
  3. Entfernen Sie das Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 mL eiskaltem Färbe-Puffer; geben Sie die Suspension nacheinander durch einen 100 μm- und einen 40 μm-Zellsieb.
  4. Reichern Sie die an magnetische Beads gebundenen Zellen durch positive Selektion mittels einer MACS LS-Magnet-Säule an.
  5. Wiederholen Sie Schritt 4,2 und entfernen Sie den Überstand.
  6. Inkubieren Sie die Zellen mit den Oberflächenmarkern in Form von mAK, wie in Schritt 3,7 beschrieben.
  7. Waschen Sie die magnetisch angereicherten Zellen zweimal mit eiskaltem Färbe-Puffer. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 500 μL eiskaltem Färbe-Puffer ohne Natriumazid und geben Sie die Suspension durch ein 40 μm-Zellsieb in ein FACS-Röhrchen.
  8. Führen Sie anschließend die FACS-Aufreinigung auf dem BD ARIA II Cell Sorter durch, um intestinale DC- und/oder Makrophagen-Teilpopulationen von Interesse zu sortieren.

5. Gating-Strategie für LP-APC

Hinweis: Beachten Sie, dass ungefärbte Darmzellen als negativer Kontrollansatz verwendet werden können, um die korrekte Platzierung der Tore zur Unterscheidung positiver und negativer Populationen zu unterstützen.

  1. Erstellen Sie wie in Abbildung 1 gezeigt ein Punktediagramm und schließen Sie Zellen aus, die positiv für die Totzellen-Färbung sind (Abb. 1A), gefolgt vom Ausschluss von Doppelereignissen (Abb. 1B und C). Gehen Sie danach gemäß Streuung vorwärts und seitlich auf die Zellen von Interesse und achten Sie darauf, Zelltrümmer auszuschließen (Abb. 1D).
  2. Erstellen Sie ein weiteres Punktediagramm und grenzen Sie zusätzlich CD45+- und I-Ab+-Zellen ein, die phänotypisch antigenpräsentierende Zellen (APCs) charakterisieren (Abb. 1E).
  3. Analysieren Sie in einem separaten Punktediagramm die Expression von CD11b und CD11c, um spezifische DC- und Makrophagen-Subpopulationen zu unterscheiden (R1, R2 und R3; Abb. 1F). Die Zellen von R1 sind CD11c+ CD11bdunkel/--Zellen. Der Bereich R2 ist so abgegrenzt, dass diese Zellen ähnliche Oberflächenexpression von CD11c wie die Zellen von R1 aufweisen, aber zusätzlich CD11b exprimieren. Anschließend wird der Bereich R3 für Zellen festgelegt, die CD11b+ und CD11cdunkel/- sind.
  4. Analysieren Sie die Bereiche R1, R2 und R3 weiter hinsichtlich der Expression von F4/80 und CD103, um Makrophagen- und DC-Populationen zu differenzieren. Die CD11c+ CD11bdunkel/--Zellen von R1 exprimieren hohe Mengen des αE-Integrins CD103 und geringe Mengen von F4/80 (Abb. 1G). Die CD11b+CD11c+-Zellen von R2 setzen sich aus DCs und Makrophagen zusammen, basierend auf ihrer gegensätzlichen Expression von CD103 und F4/80 (Abb. 1H). Schließlich stellen die CD11b+CD11cdunkel/--Zellen von R3 Makrophagen dar, basierend auf dem phänotypischen Profil F4/80+ und CD103- (Abb. 1I)16.

6. Repräsentative Ergebnisse

Streudiagramme der Durchflusszytometrie zur Analyse von Zellpopulationen, einschließlich CD-Markern und Totzellsfärbung.
Abbildung 1. Gating-Strategie für intestinale DCs und Makrophagen. Zunächst wurden tote Zellen (A) sowie Doppelzellen (B und C) von der Analyse ausgeschlossen. Anschließend wurden Zellen aus dem Dünndarm entsprechend dem Forward- und Side-Scatter (D) selektiert, und antigenpräsentierende Zellen (APCs) wurden als CD45+I-Ab+ definiert (E). Makrophagen und DCs wurden anhand der Expression von CD11b und CD11c identifiziert (F). Die Expression von CD103 und F4/80 für Zellen, die zuvor in den Populationen R1 (G), R2 (H) und R3 (I) vorab selektiert wurden, wurde analysiert.

Durchflusszytometriediagramme (A–C) für CD11c, CD11b; Diagramm zum Einfluss der Gewebeverdauung auf die Gesamtanzahl der Zellen (D–F)
Abbildung 2. Die Zellausbeute und die Qualität der Antikörperfärbung hängen von der Verdauerungszeit ab. Färbemuster für CD11b und CD11c sowie die Gesamtzellausbeute bei unter- (A, D), optimal- (B, E) oder überverdautem (C, F) Darmgewebe.

Darmzellen wurden aus dem Dünndarm einer C57BL/6-Maus isoliert, und DCs sowie Makrophagen wurden mittels FACS auf dem BD LSR II analysiert. Spannung und Kompensation wurden mithilfe von nicht angefärbten und mit einzelnen Fluorochromen angefärbten Milzzellen eingestellt. Tote Zellen (Abb. 1A) und Doppelzellen (Abb. 1B und C) wurden zunächst von der Analyse ausgeschlossen. Anschließend wurden die Zellen von Interesse anhand von Forward- und Side-Scatter (Abb. 1D) analysiert, gefolgt von der Gating-Strategie auf CD45+- und I-Ab+-Zellen (Abb. 1E). Danach wurde die Expression von CD11b und CD11c innerhalb der CD45+I-Ab+-Zellen untersucht, um drei Bereiche (R1, R2 und R3; Abb. 1F) abzugrenzen. Die Expression von CD103 und F4/80 in den drei Bereichen wurde bewertet, um jeweils zwischen DCs und Makrophagen zu unterscheiden. Die CD11c+ CD11bdunkel/--Zellen des Bereichs R1 exprimierten hohe Mengen des αE-Integrins CD103 und geringe Mengen von F4/80 (Abb. 1G). Die CD11b+CD11c+-Zellen des Bereichs R2 setzten sich aus DCs und Makrophagen zusammen, basierend auf ihrer gegensätzlichen Expression von CD103 und F4/80 (Abb. 1H), während die CD11b+CD11cdunkel/--Zellen des Bereichs R3 Makrophagen darstellen, basierend auf dem phänotypischen Profil F4/80+ und CD103- (Abb. 1I)16. Makrophagen innerhalb des R2-Gates und Makrophagen im R3-Gate weisen ähnliche Forward- und Side-Scatter-Eigenschaften auf und sind durch die Expression von CD11c unterscheidbar. Die funktionelle Differenzierung dieser Subpopulationen ist weiterhin unvollständig verstanden.

Der Zusammenhang zwischen der Dauer der Gewebeverdauung und der Gesamtzellausbeute sowie der Expression von CD11b und CD11c ist in Abbildung 2 dargestellt. Bei Darmgewebe, das 3 Minuten lang verdaut wurde (Unterverdaung), war die Gesamtzahl der gewonnenen Zellen gering (Abb. 2D), wodurch nur wenige dendritische Zellen (DCs) und Makrophagen zur Charakterisierung verfügbar waren (Abb. 2A). Eine Gewebeverdauung über 11 Minuten führte zu einer hohen Ausbeute an lebenden Zellen (Abb. 2E), wobei Populationen von DCs und Makrophagen hohe Mengen an CD11b und CD11c exprimierten und phänotypisch klar unterscheidbar waren (Abb. 2C). Im Gegensatz dazu ergab eine Verdauung über 50 Minuten (Überverdaung) eine vergleichbare Zellausbeute im Vergleich zur optimierten Verdauung (Abb. 2E und F); die Unterscheidung verschiedener Zellpopulationen mittels CD11b und CD11c wurde jedoch unklarer, da die Expression von CD11c abnahm (Abb. 2C) und die Anzahl an toten Zellen stieg (Daten nicht gezeigt).

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Diskussion

Diagramm zur Optimierung der Zellausbeute: Faktoren wie Kollagenase, Gewebeverdauung, Integrität, Größe.
Abbildung 3. Faktoren, die für die Optimierung der Zellausbeute und der Oberflächenantigenexpression wichtig sind. Die Zellausbeute und die Expression von Oberflächenantigenen werden direkt beeinflusst durch die Dauer der Gewebeverdauung, die spezifischen Eigenschaften der Kollagenase, de...

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Offenlegungen

Keine Interessenkonflikte erklärt.

Danksagungen

Wir danken Aaron Rae (Abteilung für Pädiatrie der Emory University und Flow Core des Children's Healthcare of Atlanta) für die Zellsortierung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch eine NIH-Förderung (AA01787001), einen Career Development Award der Crohn's and Colitis Foundation of America sowie einen Seed-Zuschuss des Emory-Egleston Children's Research Center an T.L.D.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1X PBS, Ca2+- und Mg2+-frei
Hank’s ausgeglichene Salzlösung (HBSS) mit PhenolrotFisher ScientificSH3001603
NatriumbicarbonatSigma-AldrichS6014
1 M HEPES in 0,85 % NaClLonza Inc.17-737E
Fötales Rinderserum (FBS)Atlanta BiologicalsS11150HHitzeinaktiviert
0,5 M EDTA (pH 8,0)Cellgro46-034-CI
Kollagenase Typ VIIISigma-AldrichC2139
DNase IRoche Group14785000Stammlösung: 100 mg/ml
LIVE/DEAD Fixable Aqua Totzellfarbstoff-Kit für 405 nm AnregungInvitrogenL34957Verwenden Sie im Verdünnungsverhältnis 1:1000
CD45-PerCP mAb (30F11)BD Biosciences557235Verwenden Sie im Verdünnungsverhältnis 1:100
CD103-PE mAb (M290)BD Biosciences557495Verwenden Sie im Verdünnungsverhältnis 1:100
FcγRIII/II mAb (2.4G2)BD Biosciences553141Verwenden Sie im Verdünnungsverhältnis 1:200
CD11c-APC mAb (N418)eBioscience17-0114-82Verwenden Sie im Verdünnungsverhältnis 1:100
MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 mAbeBioscience56-5321-82Verwenden Sie im Verdünnungsverhältnis 1:100
CD11b-eFluor 450 mAb (M1/70)eBioscience48-0112-82Verwenden Sie im Verdünnungsverhältnis 1:200
F4/80-PE-Cy7 mAb (BM8)eBioscience25-4801-82
CD11b-MikroperlenMiltenyi Biotec130-049-601
CD11c-MikroperlenMiltenyi Biotec130-052-001
Kegelförmige 50-mL-RöhrchenBD Biosciences352098
Einfacher DrahtsiebfilterChefmate
Kleine WägepfanneFisher Scientific08-732-116
100-μm-ZellsiebBD Biosciences352360
40-μm-ZellsiebBD Biosciences352340
5-mL-Rundbodenröhrchen aus PolystyrolBD Biosciences352235Verwenden Sie im Verdünnungsverhältnis 1:100
MaxQ 4450 Tisch-Orbital-SchüttlerThermo Fisher Scientific, Inc.
LS MACS-SäuleMiltenyi Biotec130-042-401
LSR IIBD Biosciences
FACSAria IIBD Biosciences

Referenzen

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Schlagwörter

GewebedigestionDurchflusszytometriemagnetisch aktivierte ZellsortierungCD11cCD11bZellisolationph notypische Charakterisierung
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