Einzel Oocyte Bisulfit-Mutagenese

Zusammenfassung

Bisulfit-Mutagenese ist der Goldstandard für die Analyse von DNA-Methylierung. Unsere modifizierte Protokoll ermöglicht DNA-Methylierungs-Analyse auf der Ebene einzelner Zellen und wurde speziell für die einzelnen Eizellen entwickelt. Es kann auch für die Spaltung-Embryonen verwendet werden.

Zusammenfassung

Epigenetik umfasst alle vererbbar und reversible Modifikationen an Chromatin, die alter-Gen Zugänglichkeit und damit die primären Mechanismen für die Regulierung der Gentranskription ¹ sind. DNA-Methylierung ist eine epigenetische Modifikation, die überwiegend fungiert als repressiv-Marke. Durch die kovalente Addition einer Methylgruppe an Cytosin in CpG-Dinukleotide, kann es zu rekrutieren weitere Proteine ​​und repressiven Histon-Modifikationen, um Prozesse in kondensierenden Chromatin und Abschaltung von Genen ² beteiligt zu initiieren. DNA-Methylierung ist wichtig für die normale Entwicklung, da sie eine entscheidende Rolle in der Entwicklungsbiologie Programmierung, Zelldifferenzierung, Unterdrückung von retroviralen Elementen, X-Chromosom-Inaktivierung und genomische Prägung spielt.

Eine der mächtigsten Methoden zur DNA-Methylierungs-Analyse ist Bisulfit-Mutagenese. Natriumbisulfit ist ein DNA-Mutagen, die Cytosine desaminiert in Uracile. Nach PCR-Amplifikation und seque ncing werden diese Umwandlung Ereignisse wie Thymine erkannt. Methylierte Cytosine werden aus Desaminierung geschützt und damit als Cytosine bleiben, welche die Identifizierung von DNA-Methylierung bei der einzelne Nukleotid-Ebene ^3. Die Entwicklung des Bisulfit-Mutagenese-Assay wurde von den ursprünglich gemeldeten ^4-6 gegen diejenigen, die mehr sensitive und reproduzierbare ⁷ sind fortgeschritten. Ein wichtiger Fortschritt wurde Einbetten kleiner DNA-Mengen in einem Agarose-Kügelchen, wodurch Schutz der DNA vor der rauen Bisulfit-Behandlung ^8. Damit konnte die Methylierungsanalyse auf Pools von Eizellen und Embryonen im ^{Blastozysten-9} durchgeführt werden. Die anspruchsvollste Bisulfit-Mutagenese-Protokoll auf dem neuesten Stand ist für einzelne Blastozyste-Embryonen ^10. Da jedoch Blastozysten im Durchschnitt 64 Zellen (mit einem Gehalt von 120 bis 720 pg genomischer DNA) haben, ist diese Methode nicht wirksam für die Methylierung Studien zu einzelnen Eizellen oder Embryonen-Spaltung. Zelt "> Aufnehmen von Hinweisen aus Agarose Einbettung von Minuten DNA-Mengen einschließlich Oozyten ^11, hier präsentieren wir eine Methode, bei der Eizellen direkt in einem Agarose-Lyse-Lösung und Wulst unmittelbar nach der Abruf und die Entfernung der Zona pellucida von der Eizelle eingebettet sind. Dies ermöglicht uns, Bypass die beiden wichtigsten Herausforderungen der einzigen Eizelle Bisulfit-Mutagenese:. Schutz einer winzigen Menge von DNA vor dem Abbau und anschließende Verlust während der zahlreichen Schritte Protokoll Wichtig ist, wie Daten aus einzelnen Eizellen gewonnen werden, die Frage der PCR-Bias-Pools innerhalb Außerdem entfällt. , unbeabsichtigte Kontamination Cumulus-Zellen nachweisbar ist, durch diese Methode, da jede Probe mit mehr als einem Methylierungsmuster von der Analyse ausgeschlossen werden kann ^12. Dieses Protokoll bietet ein verbessertes Verfahren für eine erfolgreiche und reproduzierbare Analyse der DNA-Methylierung in der Ebene einzelner Zellen und ist ideal geeignet, für die einzelnen Eizellen sowie Embryonen-Spaltung.

Protokoll

TAG 1

Stellen Sie folgende Lösungen frisch auf den Tag der Eizellenentnahme mit sterilem, destilliertem Wasser wie GIBCO Wasser. Um die Möglichkeit von DNA-Kontamination zu verringern, die Handschuhe wechseln oft und Filterspitzen. Halten Röhrchen entfernt, wenn sie geöffnet abgewinkelt ist und Erinnerung alle Rohre, wenn nicht in Gebrauch ist. Wir empfehlen, dass Lösungen wie n +1 gemacht werden.

3% LMP-Agarose

30 mg niedrigem Schmelzpunkt (LMP) Agarose
bis zu 1 ml H ₂ O GIBCO
lösen bei 70 ° C

Lysis Solution

8 u....

Diskussion

Diese einzelne Eizelle Assay enthält viele Schritte mit einer Zahl, die kritisch sind und bedürfen einer besonderen Pflege. Die erste ist Oozyte Waschen. Es ist besonders wichtig zu waschen Jeder Oocyt mehrmals in frischem Medium fällt nach Hyaluronidase-Behandlung, so viele Kumuluszellen wie möglich zu entfernen. Darüber hinaus bei der Übertragung von Eizellen, um saure Tyrode-Lösung für Zona pellucida Entfernung sicherstellen umgebenden Medium ist klar, von Cumulus-Zellen. Die Eizelle ist sehr klebrig zona nach Entfer.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Eizellenentnahme
Hyaluronidase	Sigma	H4272
Saure Tyrode	Sigma	T1788
Proteinase K	Sigma	P5568
10% IGEPAL	Bioshop	NON999.500
Lysis Solution
Tris, pH 7,5	Bioshop	TRS001.5
LiCl	Sigma	L9650	& Nbsp;
EDTA, pH 8,0	Sigma	E5134
LiDS	Bioshop	LDS701.10
DTT	Invitrogen	P2325
SDS-Lysepuffer
TE pH 7,5	Bioshop (Tris) Sigma (EDTA)	TRS001.5 E5134
10% SDS	Bioshop	SDS001.500
Bisulfit-Konvertierung
Natriumhydroxid	Sigma	S8045
Natriumhydrogensulfit (Natriumbisulfit)	Sigma	243973	;
Hydrochinon	Sigma	H9003
Niedrigen Schmelzpunkt (LMP) Agarose	Sigma	A9414
Mineralöl	Sigma	M8410
M2 Medium	Sigma	M7167
GIBCO destilliertes Wasser	Invitrogen	15230-196
Autoklavierten doppelt destilliertes (dd) Wasser
PCR
Illustra Hot Start Mix RTG	GE Healthcare	28-9006-54
240 ng / ml Hefe-tRNA	Invitrogen	15401-011
5x Grün GoTaq Reaktionspuffer	ProfiMega-	M7911
Innere und äußere verschachtelten Primern	Sigma
Ligation
Promega pGEM-T Easy Vektor	Fisher Scientific	A1360
TA Cloning
Kompetente E. coli Zellen	Zymo Research Corp	T3009
Ausrüstung
Lupen-Mikroskop
70 ° C und 90 ° C Hitze-Blöcke
37 ° C und 50 ° C Wasserbäder (42 ° C für Transformationen)
Rocker
PCR-Maschine