Methodenartikel

Kleine und Wide Angle X-Ray Scattering Studium der biologischen Makromolekülen in Lösung

DOI:

10.3791/4160

⸱

8. Januar 2013

 ,  ,  , 
1Department of Mechanical, Aerospace, and Nuclear Engineering, Rensselaer Polytechnic Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Demonstration der kleinen und Weitwinkel-Röntgenstreuung (SWAXS) Verfahren hat sich in der Studie von biologischen Makromolekülen instrumental. Durch die Verwendung der Instrumente und Verfahren der spezifische Winkel Methoden und Zubereitung, zeigt die experimentellen Daten der SWAXS die atomare und nanoskalige Charakterisierung von Makromolekülen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesem Papier wird Klein-und Weitwinkel-X-ray Scattering (SWAXS) Analyse von Makromolekülen durch Experimentieren unter Beweis gestellt. SWAXS ist eine Technik, bei der Röntgenstrahlen elastisch durch eine inhomogene Probe im nm-Bereich bei kleinen Winkeln (typischerweise 0,1 - 5 °) verteilt sind und große Winkel (typischerweise> 5 °). Diese Technik liefert Informationen über die Form, Größe und Verteilung der Makromoleküle charakteristischen Abstände der teilweise geordneten Materialien, Porengrößen und Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis. Small Angle X-ray Scattering (SAXS) fähig ist, liefert strukturelle Informationen von Makromolekülen zwischen 1 und 200 nm, wohingegen Weitwinkel Röntgenkleinwinkelstreuung (WAXS) kann auch kleinere Bragg Abstands von Samples zwischen 0,33 nm und 0,49 nm aufzulösen basierend auf dem spezifischen System-Setup und Detektor. Der Abstand wird vom Braggschen bestimmt und hängt von der Wellenlänge und Einfallswinkel.

In einer SWAXS Experiment können die Materialien festoder flüssig sein und darf feste, flüssige oder gasförmige Domänen (sogenannte Teilchen) aus dem gleichen oder einem anderen Material in einer beliebigen Kombination. SWAXS Anwendungen sind sehr breit und umfassen Kolloiden aller Art: Metalle, Verbundwerkstoffe, Zement, Öl, Polymere, Kunststoffe, Proteine, Lebensmittel und Pharmazeutika. Für feste Proben wird die Dicke auf ungefähr 5 mm begrenzt.

Die Verwendung von einem Labor-basierte SWAXS Instrument wird in diesem Papier beschrieben. Mit der verfügbaren Software (zB GNOM-ATSAS 2,3 Paket von D. Svergun EMBL-Hamburg und EasySWAXS Software) für die SWAXS System kann ein Experiment durchgeführt, um bestimmte Parameter von Interesse für die gegebene Probe zu bestimmen. Ein Beispiel für ein biologisches Makromolekül Experiment ist die Analyse von 2 Gew.% Lysozym in einer auf Wasser basierenden wässrigen Puffer, der gewählt werden kann und hergestellt durch zahlreiche Methoden. Die Vorbereitung der Probe folgt den Richtlinien unten in der Vorbereitung der Probe Abschnitt. Durch SWAXS Experimentieren,Wichtige Strukturparameter von Lysozym, zB der Gyrationsradius, analysiert werden.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein. Vorbereitung der Probe

  1. Mit einer Nadel, einen Teil der Probe aus dem Probenbehälter zu entfernen. *
  2. Verwenden Sie die Nadel in die Kapillare zu füllen (maximaler Durchmesser von 2,2 mm) mit der Probe. Die Kapillare muss zwischen 2 und 3 cm vom unteren Rand gefüllt.
  3. Schließen Sie die Kapillare durch schmelzendes Wachs auf seiner Spitze.
  4. Lösen Sie das Vakuum Probenhalter aus dem System.
  5. Nehmen Sie die Kapillare durch das geschmolzene Ende (Wachs Ende) und legen Sie die un-fusionierten Ende in den Probenhalter.
  6. Setzen Sie den Halter wieder in das System und festschrauben.

* Feste Proben (einschließlich Pulverproben) direkt in den Probenhalter (keine Kapillarwirkung erforderlich) abgegeben werden, während flüssige Proben in einer Kapillare gestellt werden müssen.

Start-Up des SWAXS Maschine

2. Quelle Kalten Startup Procedure

  1. Schließen Sie den Auslöser, indem die Sicherheit Auslöser.
  2. Schalten Sie den Hauptschalter"ON", indem Sie die grüne Taste.
  3. Überprüfen Sie die Emergency "Shut-Off"-Taste in der ausgefahrenen Position.
  4. Schalten Sie den Netzschalter ein, indem Sie die grüne Taste.
  5. Überprüfen Sie die Verriegelung LED-Licht ist grün und zeigt alle Verriegelungen sind ok.
  6. Warten Sie auf den Touchscreen, um zu laden. Sobald es geladen ist, drücken Sie die "R6" auf der Speisekarte.
  7. Schalten Sie die Standby-Taste auf "ON"-Position.
  8. Drehen Sie den X-ray Key auf "ON"-Position. Das rote X-ray Licht sollte leuchten.
  9. Warten Sie auf den Touchscreen, um Standby-Ebenen (30 kV und 0,4 mA) zu lesen.
  10. Drehen Sie den Standby Sicherheit Key auf "OFF"-Position. Drücken Sie die "Start Cycle"-Taste auf der Unterseite des Touchscreens.
  11. Warten Sie auf den Touchscreen, um Nennleistung (50 kV und 1 mA) zu lesen. Wenn eine andere Leistung gewünscht wird, geben Sie das Konfigurationsfenster mit "R4" auf dem Touchscreen und Eingabe der gewünschten Einstellungen.

3. Chiller Procedure

  1. Schalten Sie das Gerät switch auf die "ON" Position auf der Temperatur Bedienfeld. Eine Kontrollleuchte und die LED-Temperaturanzeige leuchtet.
  2. Schalten Sie den Netzschalter auf die Position "ON" auf dem Kühler.
  3. Warten Sie, bis die Temperatur auf der Anzeige "OFF". Dies ist Standby-Modus.
  4. Drücken und halten Sie die Enter-Taste (Return-Symbol) für ca. 4 Sek. oder bis der Temperatur-Anzeige zeigt eine aktuelle Temperatur.
  5. Um die Temperatur zu ändern, drücken Sie die Aufwärts-oder Abwärtspfeil. Der Sollwert wird über die Temperaturanzeige für ca. 8 Sek. angezeigt werden, bevor es mit dem tatsächlichen Wert zurückkehren.
  6. Drücken Sie die Enter-Taste, sobald die gewünschte Sollwert angezeigt wird. Dieser speichert diesen Wert.
  7. Warten Sie, bis die tatsächliche Temperatur erreicht den gewünschten Sollwert.

HINWEIS: Wenn zu irgendeinem Zeitpunkt die Fehlermeldung "E 01" zeigt sich auf der Temperaturanzeige, folgen Sie den Chiller Shutdown Anweisungen, füllen das Bad-Einheit durch Gießen gereinigtes Wasser in den Tank fill, und führen Sie dann den Kühler Startup Prozedur erneut.

4. Shutdown der Chiller

  1. Drücken Sie "Enter" für ca. 4 Sekunden.
  2. Schalten Sie den Netzschalter auf die Position "OFF".

5. Einschalten des Vakuum-

  1. Stellen Sie sicher, das Vakuum Tür an Ort und Stelle gesichert ist.
  2. Schalten Sie das Vakuum 1 und 2 Knöpfe, um den "ON"-Position.
  3. Warten, bis die VAP5 Vakuummeter liest ein Vakuum von weniger als 1,5 mbar.

6. Detector System Setup

  1. So richten Sie den Gasdruck, ob der Main-Manometer der Reduktion Ventil mindestens 10 bar.
  2. Öffnen Sie das Hauptventil.
  3. Öffnen Sie langsam das Operating Pressure Valve, bis der Druck 8 bar an der Operating Pressure Gauge.
  4. Öffnen Sie das zweite Hauptventil
  5. Um Gasstrom einzustellen, öffnen Sie das Hauptmenü Druckventil durch Drehen des Knopfes in die vertikale Position auf dem Gas Control Panel.
  6. Die Durchflussmengesich mit dem Nadelventil bis der Überdruck liest ca. 8 bar.
  7. Schalten Sie den Netzschalter auf "ON"-Position. Das LED-Licht aufleuchten.
  8. Um die hohe Spannung einzustellen, aktivieren Sie die hohe Spannung durch Drehen der Schalter in die Stellung "ON". Das LED-Licht aufleuchten.
  9. Drehen Sie langsam die Spannung Regler bis etwa 3,5 kV am Manometer erreicht wird. NICHT MEHR 4kV.

7. Kalibrierung

  1. Die experimentellen obigen Schritte werden mit einer Probe bekannter Peaks durchgeführt.
  2. ASA 3,3 wird verwendet, um Graphen der Intensität vs Kanal mit 5 Gipfeln zu erhalten.
  3. Öffnen Sie Menü → Optionen → Geben Kanäle und entsprechenden Intensitäten.
  4. Zum ASA3 "TPF" Registerkarte erste.
  5. Filter ändern, links oben 1 mm Nickel (Strahl-Filter).
  6. Setze die Position 32.000 (Bereich 28.000 bis 32.000, kritische Region rund 28.000) → Gehe zu Position, stellen Sie sicher Vakuum unter 5 mbar, stellen Sie sicher, der Detektor reading zwischen 1k-10K.
  7. Führen Sie für 10 Sekunden für ca. 52 Impulse pro Sekunde.
  8. Ändern Sie den Energie-Fenster (oder messen die Energie-Fenster mit der Probe nur, ohne den Filter Fall). Stellen Sie den Finallauf für 10 sec.
  9. Suchen Sie den Speicherort des Primärstrahls (Kanal 233 zum Beispiel).
  10. Für andere läuft, ändern filtern wieder auf 2 mm Tungsten (W, Strahl-Stopper) und ab 30.000.
  11. Finden Sie die Lage aller anderen Peaks der Proben.
  12. Verwenden ImageJ-Makro-Software SAXS kalibrieren - beim Übergang von Intensität vs Kanal Intensität vs q (oder d-Abstand) (Abbildung 1).
  13. Verwenden ImageJ-Makro-Software WAXS kalibrieren - beim Übergang von Intensität vs Kanal Intensität vs q (oder d-Abstand) (Abbildung 2).

8. Software Procedure

  1. Verwenden Sie die Software ASA 3,3, um die Live-Daten sammeln: Live Data → TPF Registerkarte → Datei speichern.
  2. Für EasySWAXS, auf der Registerkarte Geräteeinstellungen klicken.
  3. Geben Sie die "a", Lambda-und d-Werte sowie das Zentrum der Schwerkraft.
  4. Punkt auswählen Kollimation.
  5. Wählen Kugelsternhaufen Teilchensorte (es sei denn, es ist ein bekannt, dass ein Stab von flach geformten Teilchen sein soll).
  6. Klicken Sie auf die Guinier-Plot Registerkarte. Ein I vs q 2 graph wird angezeigt.
  7. Ziehen Sie die vertikalen Linien zu umgeben einen Teil der annähernd lineare Steigung.
  8. An der Unterseite des Bildschirms wird ein R-Wert angezeigt werden. Neben diesem gibt es eine Validierung erforderlich.
  9. Weiterhin die vertikalen Linien näher zusammen ziehen, bis die Validierung Wert liegt zwischen 1 und 2. Dies ist subjektiv. Der R-Wert oder Trägheitsradius, erhält man eine Schätzung.

9. Quelle Shutdown Vorgehensweise

  1. Überprüfen Sie die Sicherheit und schnelle Fensterläden geschlossen sind.
  2. Schalten Sie die Standby-Taste auf "ON"-Position.
  3. Warten Sie auf den Touchscreen, um Standby-Ebenen lesen.
  4. Presse R5 auf der touchscreen.
  5. Reduzieren Sie den Strom auf 0 A.
  6. Reduzieren Sie die Spannung auf 0 A.
  7. Drehen Sie den X-ray-Taste, um die "OFF"-Position.
  8. Schalten Sie den Hauptschalter auf "OFF", indem Sie den roten Aus-Taste.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Trägheitsradius, Partikelgröße und-form, Struktur in Lösung Faktor, spezifische innere Oberfläche und Porengröße, Gitter Art und Dimension, und der Elektronendichte 1: SAXS und WAXS insgesamt können strukturelle Informationen der Probe durch die folgenden Parameter. SAXS und WAXS kann auch auf die Untersuchung von Protein Dynamik 2 angewendet werden.

Die Strukturinformationen SWAXS Experimenten wird durch Vergleich der experimentell nachgewiesen Spektren und die rec...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die vergleichende Prozedur des SWAXS System ermöglicht zahlreiche Variablen aus experimentellen Analyse bestimmt werden. Die Parameter, die aus der Analyse erreicht werden kann für verschiedene Zwecke gemäß der Probe und Versuchsaufbau verwendet werden. SAXS liefert Informationen über nanoskaligen Größe und Form des Objekts, während WAXS konzentriert sich auf die atomaren und Mikromaßstab Struktur (zB Molekülgitter, Elementarzelle Dimension Symmetrie). Genauer gesagt, für Partikel in verdünnten Lösungen können ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Herrn Dr. Manfred Kriechbaum der Hecus XRS und dem Institut für Biophysik und Nanosystemforschung an der Österreichischen Akademie der Wissenschaften in Graz, Österreich bedanken. LL und XW wurden zum Teil durch US-Department of Energy unterstützt unter NERI-C-Award DE-FG07-07ID14889 und US Nuclear Regulatory Commission, unter Preis-Nr NRC-38-08-950. Die SWAXS Instrument wird zum Teil auch durch die US Department of Energy unterstützt unter Awards DE-NE0000325.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Namen der Produkte Firma
Die System3 Small-und Wide-Angle X-Ray Scattering (SWAXS) Kamera Hecus XRS und IBN,
Graz, Österreich
GNOM ATSAS 2,3 Paket von D. Svergun EMBL-Hamburg

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bernadó, P., Blackledge, M. Structural biology: Proteins in dynamic equilibrium. Nature. 468, 1046-1048 (2010).
  2. Zhang, F., Skoda, M. W. A., Jacobs, R. M. J., Martin, R. A., Martin, C. M., Schreiber, F. Protein Interactions Studied by SAXS: Effect of Ionic Strength and Protein Concentration for BSA in Aqueous Solutions. J. Phys. Chem. B. 111, 251-259 (2007).
  3. Maranas, J. K. The effect of environment on local dynamics of macromolecules. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 12, 29-42 (2007).
  4. Lysozyme in Water [Internet]. , Available from: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/lysozyme/10_analysis2.html (2008-2012).
  5. Stribeck, N. X-Ray Scattering of Soft Matter. , Springer. Heidelberg. (2007).
  6. Mertens, H. D., Svergun, D. I. Structural characterization of proteins and complexes using small-angle X-ray solution scattering. J. Struct. Biol. 172 (1), 128(2010).
  7. Svergun, D. I. Small-angle X-ray and neutron scattering as a tool for structural systems biology. Biol. Chem. 391 (7), 737(2010).
  8. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quat. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).
  9. Bonini, M., Fratini, E., Baglioni, P. SAXS study of chain-like structures formed by magnetic nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Biomimetic and Supramolecular Systems. 27 (5-8), 1377-1381 (2007).
  10. Falletta, E., Ridi, F., Fratini, E., Vannucci, C., Canton, P., Bianchi, S., Castelvetro, V., Baglioni, P. A tri-block copolymer templated synthesis of gold nanostructures. Journal of Colloid and Interface Science. 357 (1), 88-94 (2011).
  11. Glatter, O., Scherf, G., Schillen, K., Brown, W. Characterization of a Poly(ethylene oxide) Poly(propylene oxide) Triblock Copolymer (EO(27)-PO39-EO(27)) in Aqueous-Solution. Macromolecules. 27 (21), 6046-6054 (1994).
  12. Mittelbach, R., Glatter, O. Direct structure analysis of small-angle scattering data from polydisperse colloidal particles. Journal of Applied Crystallography. 31, 600-608 (1998).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Kleinwinkelr ntgenstreuungR ntgenstreuanalyseStrukturparameterTr gheitsradiusLysozym AnalyseSWAXS InstrumentierungGNOM ATSAS SoftwareEasySWAXS Software

Verwandte Artikel