On-Chip-Endothelial Entzündliche Phänotypisierung

Zusammenfassung

Mikrofluidische Strömungskammern durch Photolithographie geätzt und hergestellt von PDMS werden angewendet, um die funktionellen Ergebnisse mit den EG-Dysfunktion und Entzündung zu untersuchen. In einem repräsentativen Experiment, die Fähigkeit der Differential Scherbeanspruchung zu modulieren die Zelladhäsion an Monozyten Cytokin aktiviert EG Monoschichten nachgewiesen wird.

Zusammenfassung

Atherogenese wird durch Stoffwechselstörungen, die zu einem erhöhten Zustand des systemischen Entzündung was zu einer endothelialen Dysfunktion beitragen potenziert. Allerdings sind frühe funktionelle Veränderungen im Endothel, dass die individuelle Höhe des Risikos bedeuten nicht direkt zu klinisch therapeutische Strategie Guide helfen zu beurteilen. Darüber hinaus trägt die Regulierung der Entzündung, die durch lokale Hämodynamik zu dem nicht-zufällige räumliche Verteilung der Atherosklerose, aber die Mechanismen sind schwer in vivo zu beschreiben. Wir beschreiben ein Lab-on-a-Chip-basierten Ansatz zur quantitativen Assay metabolischen Störung der entzündlichen Ereignisse in humanen Endothelzellen (EC) und Monozyten unter genauen Strömungsverhältnisse. Standardmethoden der Soft-Lithographie verwendet werden, um vaskuläre mimetischen mikrofluidischen Kammern (VMMC), die direkt an kultivierten EG Monoschichten gebunden microfabricate. ¹ Diese Vorrichtungen haben den Vorteil der Verwendung von kleinen Mengen von Reagenzien, währendBereitstellung einer Plattform für direkte Abbildung der entzündlichen Ereignissen an der Membran der EG ausgesetzt zu einer gut definierten Scherfeld. Wir haben erfolgreich diese Geräte angewandt, um Zytokin-, ^{2 Lipid-3, 4} und RAGE-induzierte Entzündung in ^fünf menschlichen Aorten-EG (HAEC) zu untersuchen. Hier dokumentieren wir die Nutzung des VMMC zu Assay Monozytenzelllinie (THP-1) Roll-und Festnahme am HAEC Monoschichten, die unter Scher-Differential Eigenschaften bedingt sind und aktiviert durch die inflammatorischen Zytokins TNF-α. Studien wie diese bieten mechanistische Einblicke in atherosusceptibility unter metabolischen Risikofaktoren.

Protokoll

1. Zellkultur und Untergrundvorbereitung

1. Schneiden Sie 3-Zoll-kreisförmigen Substraten aus einem 100 x 20 mm Gewebekulturschale (BD Falcon) mit einer Drehbank. Sterilisieren von Substraten durch Eintauchen in 70% Ethanol. Platz in einer Petrischale und Mantel mit 4 ml Typ-I-Kollagen (100 pg / ml) für 1 Stunde bei Raumtemperatur, dann mit 4 ml 1 x PBS spülen.
2. Suspend menschliche Endothelzellen (HAEC, Passage 4-6) auf 6.5x10 ⁵ Zellen / ml und Samen, indem 1 ml direkt auf das Substrat. In einen 37 ° C, 5% CO _2-Inkubator und ermöglichen Zellen auf dem Substrat 1 h lang anhaften.
3. In 9 ml Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) mit 1x Antibiotika-Antimykotika Lösung zu den Zellen ergänzt. Ändern Medien alle 2 Tage, bis die Zellen 90% Konfluenz erreichen.
4. Pflegen THP-1 Zellen in RPMI 1640 Medium mit 10% FBS und 1x Antibiotika-Antimykotika Lösung ergänzt. Passage Zellen, wenn sie eine Dichte von 1 zu erreichen0 ⁶ Zellen / ml.

2. Zelle Shearing Protokoll

Die Zellen werden in einem benutzerdefinierten Kegel-Platte-Zelle Schervorrichtung (CSD) konditioniert. Angaben zum Gerät und Design-Spezifikationen sind in Tabelle 1 und Abbildung 4 dokumentiert.

1. Bereiten Sie den CSD. Sterilisieren Sie das Kammergehäuse mit Ethanol und Spülen mit sterilem PBS. Erhitzen des Gehäuses auf 37 ° C und Höhe, um sicherzustellen, dass der Kegel senkrecht zu der Zell-Monolayer. Montieren des Substrats mit den Zellen vom Boden des Gehäuses und stellen Sie den Kegel auf die gewünschte Höhe.
2. Verwendung Leibovitz-15 (L-15)-Medium mit Endothelzellen BulletKit als Scherung Medium richtigen pH-Wert in Abwesenheit von CO _{2 zu} halten ergänzt. Um Entzündung stimuliert, fügen Tumornekrosefaktor-α (TNF-α, 0,5 ng / ml) zu dem Medium und Scheren zu injizieren 6 ml in der Vorrichtung über eine Spritze mit einem Einlass-Anschluss, dabei nicht um Luft einzuführenBlasen in der Kammer.
3. Schere Zellen mit einer hohen Größe stationären Scherspannung (HSS, 15 dyn / cm ²⁾ oder eine oszillierende Schubspannung (OSS, 0 ± 5 dyn / cm ^2, 1 Hz) für 4 Stunden. Die gewünschte SS wird durch Drehen des Konus über den Zellen, die genau mit einem Mikro-Schrittmotor, wie zuvor beschrieben gesteuert wird, erreicht ⁶ Die Wand SS an der Oberfläche (τ _w) durch angenähert.:
   
   wobei μ die Viskosität des Mediums ist, ω die Winkelgeschwindigkeit des Kegels, und α ist der Kegelwinkel (0,5 °). Der Kegel Ausrichtung mit dem Substrat innerhalb 0,05 ° bis Präzisionsnivellement und Spalthöhe bei 20 ± 10 mm eingestellt unter Verwendung eines Tiefenmesser Umfangsrichtung und radiale Variation τ _w zu minimieren eingestellt. Das Gerät wurde validiert, um Laminar-Flow-Eigenschaften zu gewährleisten. Entfernen cEllen aus dem Gerät und bereiten Sie für die Analyse von Monozytenadhäsion.

3. Herstellung von PDMS Mikrofluidische Kammer

1. Erhalten Master-Form zum gewünschten Mikrofluidkanal und Kanal Höhe abhängig von der Anwendung. Die Eigenschaften der spezifischen Design im Sinne dieses Protokolls sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Methode für die Erstellung dieser bereits gut in der Literatur dokumentiert. ¹ Kurz gesagt, das Netz der Kanäle wurde entwickelt, unter Verwendung von CAD-Software (Autodesk Inventor) und bei 5000 dpi gedruckt auf Transparenz. Negativen Fotolacks (SU8) auf einem Silizium-Wafer mit einer Dicke von 100 um gesponnen. Die Transparenz überlagert und UV-Licht ausgesetzt. Nicht polymerisierten Photoresists entfernt wird, um die positive Replikat-Master zu erzeugen.
2. Um PDMS Lösung Mix Silikonbasis mit Silikon-Härter 10:1 nach Gewicht in einem Boot zu machen wiegen und rühren Sie mit einem 5 ml serologische Pipette. Achten Sie darauf, den Wänden zu kratzender wiegen Boot zu verhindern, dass zusätzliche Kunststoff-Flocken zur Lösung.
3. Legen Sie die Master-Wafer in einem 100x15mm Petrischale und gießen Sie die PDMS-Lösung in die Schüssel.
4. Decken Sie die Schüssel und legen Sie sie in einen Vakuum-Behälter für 15 Minuten, um Luftblasen zu entfernen. Nach 15 Minuten nehmen Sie die Petrischale heraus und entfernen Sie überschüssiges Luftblasen durch vorsichtiges Einblasen von Luft über die Oberfläche.
5. Platzieren Sie die Petrischale in einem Ofen für 1 Stunde bei 70 ° C Entfernen Sie die Schale und schneiden Sie die Mikrofluidik-Kammern mit einer scharfen Klinge.

4. Montage der Geräte auf Mikroskop

1. Schalten Sie die Lichtquelle zu inversen Mikroskop und setzen Heizung bis 37 ° C. Befestigen Sie einen Schlauch mit einer 10 ml-Spritze und füllen Sie mit destilliertem Wasser so, dass sich keine Blasen. Legen Sie die Spritze in die Spritzenpumpe und eingestellten Durchsatz, eine Mauer zu SS von 1 Dyn / cm ² zu induzieren. Die Wandschubspannung (τ _w) entlang der Mittellinie des Kanals erzeugt wird, angenähert unter Verwendung des StandardGleichung für eine Parallelplatten-Strömungskammer:
   
   wobei μ die Viskosität des Mediums, Q die volumetrische Flußrate ist, h die Kanalhöhe, und w ist die Kanalbreite. Hinweis: da die Kanäle mit endlicher Breite sind die tatsächlichen τ _w mit w abhängig vom Kanal variieren Seitenverhältnis, und Messungen werden mit 25% am nächsten zu den Seitenwänden vermieden. ^1,7
2. Platzieren Sie PDMS Kammer in Wasser und verwenden Sie ein 100 &mgr; Mikropipette um die Luft aus den einzelnen Kanälen zu entfernen. Bringen Vakuum-Adapter, um die Kammer darauf achten, dass das Ventil ausgeschaltet ist.
3. Platzieren Sie Petrischale mit HAEC Monoschicht gegenüber dem Ziel. Legen Sie die PDMS Kammer über der Petrischale und legen Sie es vorsichtig auf der HAEC Monoschicht gleichzeitig sicherzustellen, dass keine Luftblasen zwischen dem Gerät und der Monolage zu bilden. Drehen Sie das Ventil so dass das Vakuum eingeschaltet ist und die Kammer fest angeschlossen ist.
Schnitt 19 Gauge-Nadeln stumpf, so dass es nur 5 mm Metall links. Füllen Sie den Behälter mit Kunststoff-Puffer und in PDMS Kammer Eingang. Wiederholen geeignete Anzahl von Kanälen verwendet werden. Befestigen Sie Schlauch von Spritzenpumpen auf PDMS-Kanal beendet.

5. Monozytenadhäsion Assay unter Scherbeanspruchung

1. Suspend THP-1-Zellen in 2x10 ⁶ Zellen / ml in HBSS ⁺ Ca ² + / Mg ^{2 + +} 0,1% HSA. Aktivieren THP-1-Zellen durch Inkubation mit Stromazellen abgeleiteten Faktor-1 (SDF-1, 50 ug / ml) für 15 min bei Raumtemperatur.
2. Schalten Sie Spritzenpumpe zum Fließen zu etablieren, dann werden 50 ul Zellsuspension zu Reservoir ohne Einbringen von Luftblasen. Sobald Flow voll entwickelt ist, beginnt die Datenerfassung.
3. Ausführen für 5 min bei passende Strömungsgeschwindigkeit Hinzugeben von Puffer zu dem Reservoir, wenn die Lösung zur Neige geht. Weiter fließt Puffer in die Kanäle zu waschen alle ungebundenen Zellen in der Strömung.

6. Datenerfassung und-analyse

1. Erwerben Sie digitale Bildsequenzen bei 3 Bildern / s für 2 min nach voll ausgebildete Strömung entlang der Längsachse des Kanals an 3 Standorten in den Kanal, dabei nicht zu unmittelbar nach Eingang oder vor Austrittsöffnungen oder in der 25% am nächsten der Seite aufzeichnen Wänden.
2. Zähle die Anzahl der Zellen pro Feld verhaftet durch die Identifizierung ihrer Phase-hellen Erscheinungsbild in der gleichen Bildebene als Monolayer.
3. Firm Zelle Verhaftung wird durch die Bewegung definiert <½ Zelldurchmesser in 10 s. Durchschnittliche Daten über 3 zufällige Felder / Kanal und Quantifizierung mittels ImageJ Software.

7. Repräsentative Ergebnisse

Obwohl das Gefäßendothel, wird gleichmäßig auf Agonisten, die eine systemische Entzündung beitragen ausgesetzt, Atherosklerose ist ein Schwerpunkt Krankheit entwickelt, die vorzugsweise an den Stellen der Strömungsstörung in Arterien, woraus folgt räumliche Heterogenität der endothelialen Funktion. ⁸ 9, 10 TNF-α induziert eine gut charakterisierte Reaktion, die in der EG-up-Regulierung der Zelladhäsionsmoleküle (CAMs umfasst ; zB VCAM-1, ICAM-1, E-Selektin) und Chemokine rekrutieren dass Monozyten aus dem Blutkreislauf, ein Markenzeichen des frühen atherosklerotischen Läsion ¹¹ Hämodynamik ein wichtiger Regulator der endothelialen entzündlichen Phänotyp ist ¹² High Größenordnung Schubspannung (HSS..; z. B. 15 dyn / cm ²⁾ oder pulsatilen Scherspannung (PSS, z. B. 15 ± 5 dyn / cm ²⁾ mit Seiten des Widerstandes gegen Atherosklerose in Arterien nach unten zu regulieren TNF-α-induzierte Antworten zugeordnet. Umgekehrt geringer Größe Scherspannung (LSS, zB 2 dyn / cm ²⁾ oder oszillierende Schere (OSS; zB 0 ± 5 dyn / cm ^2), die charakteristisch für Plattformen anfällig vivo verstärken cytokine-induzierte Entzündung. ^{13, 14 vorzusehen} Unsere mikrofluidischen PDMS-Geräte eine Plattform für die Durchführung mechanistische Studien Hypothesen in Bezug auf die Überlagerung von metabolischem Stress mit hydrodynamischen Faktoren bei der Regulation der endothelialen Funktion und Pathologie zu testen. Der Nutzen und die Vielseitigkeit des Ansatzes wird im Großen und Ganzen durch die folgenden repräsentative Ergebnisse dargestellt.

Abbildung 1. Schubspannung differentiell moduliert THP-1-Zell-Adhäsion an TNF-α entzündeten Endothel-Monolayer. Diese Daten erworben wurden unter Verwendung der oben beschriebenen Protokoll detailliert dokumentiert und in dem Video. HAEC Monoschichten wurden gleichzeitig zu einer niedrigen Dosis des inflammatorischen Zytokins TNF-α (0,5 ng / ml, ~ EC ₅₀ für VCAM-1-Hochregulierung) und entweder HSS (15 Dyn / cm ²⁾ oder OSS (0 ± 5 dyn ausgesetzt / cm ^2, 1 Hz) in einem benutzerdefinierten CSD für 4 Stunden, wie beschrieBett im ausführliches Protokoll. THP-1-Zelle Verhaftung wurde unter Scherströmung in einem PDMS Flusskammer quantifiziert. Diese Zelllinie, die den Phänotyp von menschlichen Monozyten imitiert wurde auf seine Reproduzierbarkeit und einfache Verwendung ausgewählt. HSS abgeschwächte die entzündliche Reaktion auf OSS im Vergleich, was zu einer verminderten THP-1-Zelle Verhaftung. Die Daten wurden mittels Student t-Test analysiert und sind als Mittelwert ± SEM von 3 unabhängigen Experimenten dargestellt. Adaptiert mit Erlaubnis aus DeVerse et al. ⁵

Die folgenden Daten zeigen die Vielseitigkeit unseres Ansatzes anhand von Beispielen aus unserer Arbeit veröffentlicht. Abweichungen von dem obigen Protokoll angegeben, wo zutreffend.

Abbildung 2. Die Modulation der Zytokin-induzierten VCAM-1 Expression und Monozytenrekrutierung in einer Schubspannung Gradienten. A) HAEC Monoschichten wurden mit TNF-α (0,3 ng / ml) für 4 h unter flo stimuliertw in einem VMMC ausgebildet basierend auf Hele-Shaw Flußtheorie. ¹⁵ A lineare Abnahme der SS Größe entlang der Mittellinie des Kanals wurde durch die Entwicklung der Seitenwände der Kammer, um mit den Stromlinien einer zweidimensionalen Staupunktströmung zusammenfallen und Formen des Endes erreicht der Kanal sind der ISO-Potentialleitungen. Die Wandschubspannung (τ _w) entlang der Mittellinie des Kanals in einem axialen Abstand von dem Eingang (x) erzeugt wird, gegeben durch:

wobei μ die Viskosität des Mediums, Q die volumetrische Flußrate ist, h die Kanalhöhe ist, w ₁ die Kanaleingang Breite und L die Gesamtlänge Kanallänge. Q gewählt wurde, um einen Gradienten in SS Größenordnung von 16 zu erzeugen Dyn / cm ² am Einlass auf 0 im Staupunkt "a" direkt proximal des outlet. B)-C) VCAM-1-Expression wurde in situ durch Immunfluoreszenz mit Antikörpern konjugiert mit Quantenpunkten und als prozentuale mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von unstimulierten Static Control gemessen. SS nicht modulieren Grundniveau von VCAM-1, welche eine geringe unstimulierten HAEC (graue Dreiecke) ist. Jedoch erhöhte VCAM-1-Expression relativ zu TNF-α an LSS Größen, Spitzenwerte liegen bei etwa 2 Dyn / cm ² und Zurückkehren zu dem TNF-α Baseline oder unten in Scherung Größen> 5 dyn / cm ² (schwarze Quadrate). D) Monozyten (10 ⁶ / ml) wurden bei 2 Dyn / cm ² für 5 min in parallelen Strömungskanälen über Monoschichten wie in A) vorkonditioniert perfundiert. Monozytenrekrutierung an das Endothel quantitativ mit den VCAM-1-Expression bei einer gegebenen Scherbeanspruchung Größe korreliert. Vor allem die Fähigkeit, VCAM-1 Expression und Monozytenrekrutierung mit feiner räumlicher Auflösung in einem monolaye sondierenr zeigten signifikante Unterschiede in einem engen Bereich in SS-Größe, die nicht durch die Anwendung nur einige diskrete Werte der Scherung in getrennten Experimenten wird gebeten. Die Daten wurden mittels ANOVA mit wiederholten Messungen und Differenzen von Newman-Keuls Posttest beurteilt analysiert, * P <0,05 TNF-α aus unter statischen Bedingungen. Die Daten sind Mittelwert ± SEM 3-6 unabhängigen Experimenten. Adaptiert mit Erlaubnis aus Tsou et al. ²

Abbildung 3. Triglycerid-reichen Lipoproteinen (TGRL) modulieren Cytokin-induzierte Entzündung im Verhältnis zu Donor Serumtriglyceridspiegel und VCAM-1-Expression. HAEC Monoschichten wurden mit TNF-α (0,3 ng / ml) für 4 Stunden gleichzeitig mit TGRL (10 mg / dl stimuliert ApoB) aus menschlichen Probanden nach einer fettreichen Mahlzeit in statischer Kultur isoliert. A) VCAM-1-Expression wurde separat in abgehängten EG mittels Durchflusszytometrie gemessenund Monozytenadhäsion quantifiziert mit einem VMMC wie in der detaillierten Protokoll beschrieben. Die Daten sind als% Wechsel von TNF-α dargestellt. Monozytenarrest in direktem Verhältnis zur endothelialen VCAM-1-Expression, die direkt mit der Höhe der Serum-Triglycerid-Donor erhöht. B) Monozytenarrest für eine Teilmenge von pro-inflammatorischen Spender in der Gegenwart eines VCAM-1 blockierenden Antikörpers aufgehoben wurde variiert. Bedeutung von gepaarten Student t-Test wurde ermittelt, bedeutet ± SEM 3-5 unabhängigen Experimenten. Adaptiert mit Erlaubnis von Wang et al. ⁴

Diskussion

Wir beschreiben die Verwendung von mikrofluidischen PDMS Vorrichtungen zur On-Chip-Bewertung der endothelialen entzündlichen Phänotyp durch die Echtzeit-Bildgebung von CAM-Expression und Monozytenadhäsion. Ein großer Vorteil unseres Ansatzes liegt in der Fähigkeit, die Ergebnisse mit einer endothelialen Dysfunktion in Zellen, die Entzündungsmediatoren wie diätetische Lipide und Zytokine unter definierten hydrodynamischen Bedingungen, die Schubspannung spiegeln in atherogenen Gefäßen zu quantifizieren. Die VMMC erleichte...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Artikel	Firma	Katalog-Nummer
100 x 20 mm Petrischalen	BD Falcon	353003
Ethanol 95%	EMD Chemicals	EX0290-1
DPBS	Cellgro	21 bis 031-CV
Typ I-Kollagen-Rat Tail Abgeleitete	Gibco	A10483-01
Menschliche Endothelzellen	Genlantis	PH30405A
Antibiotika-Antimykotika-Lösung	Invitrogen	15240-062
Endothelial BulletKit	Lonza	CC-4176
Endothelial Basal Medium-2	Lonza	CC-3156
10 ml Spritzen	BD Falcon	309604
Polyurethan-Schlauch	Tygon	ABW0001
Leibovitz-15 Medien	Gibco	11415-069
Sylgard 184 Siliconelastomergrundstoff	Dow Corning	184
Sylgard 184 Siliconelastomer Härter	Dow Corning	184
SU8 Fotolack Master-Wafer	UC Davis Pan Lab	N / A
Eclipse-TE200 Inverses Mikroskop	Nikon	Eclipse-TE200
Spritzenpumpe	Harvard Apparatus	PHD2000
19-Gauge-Injektionsnadel	Kendall	8881
THP-1 Monozytenzelllinie	ATCC	TIB-202
HBSS (Hanks gepufferter Kochsalzlösung) mit Ca 2 + / Mg 2 +	Gibco	14025-092
Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF-α)	R & D Systems	210-TA-010
Stroma-Derived Factor - 1 (SDF-1)	R & D Systems	350-NS-010
RPMI 1640	Cellgro	10 bis 040-CV
Human Serum Albumin (HSA)	ZLB Behring	NDC 0053-7680-32