Method Article

A Simple Protocol für das Extrahieren Hämozyten von Wild Caterpillars

DOI:

10.3791/4173

November 15th, 2012

In This Article

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Insect Blutzellen führen viele wichtige Funktionen, sowohl Immun-und Nicht-immune, in allen Phasen des Insekts Entwicklung. Unsere gegenwärtigen Kenntnisstand hemocyte Typen und Funktion kommt von Studien über Insekten genetischen Modellen. Hier stellen wir ein Verfahren zur Extraktion, Quantifizierung und Visualisierung von Blutzellen von wilden Raupen.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Insect Blutzellen (äquivalent zu Säugetieren weißen Blutkörperchen) spielen eine wichtige Rolle in verschiedenen physiologischen Prozessen im gesamten eines Insekts Lebenszyklus 1. In Larvenstadien von Insekten gehören zu den Ordnungen Lepidoptera (Schmetterlinge) und Diptera (true entfernt) werden Blutzellen aus dem Lymphknoten (a spezialisierte hämatopoetische Orgel) oder embryonale Zellen gebildet und kann bis zum erwachsenen Stadium durchgeführt werden. Embryonale Blutzellen in Zellmigration während der Entwicklung und Chemotaxis Regelung bei Entzündungen beteiligt sind. Sie beteiligen sich auch an Zell-Apoptose und sind für Embryogenese 2 unerlässlich. Hämocyten vermitteln den zellulären Arm des Insekts angeborenen Immunantwort, die mehrere Funktionen, wie zum Beispiel Zell-Ausbreitung, Zellaggregation, Bildung von Knötchen, Phagozytose und Einkapselung Eindringlinge 3 umfasst. Sie sind auch verantwortlich für die Koordination bestimmtes Insekt humorale Abwehrmechanismen während der Infektion, wie die produktion von antimikrobiellen Peptiden und anderen Effektormoleküle 4, 5. Hemocyte Morphologie und Funktion wurden vor allem in der genetischen oder physiologischen Insektenmodelle untersucht worden, einschließlich der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster 6, 7, die Moskitos Aedes aegypti und Anopheles gambiae 8, 9 und der Tabakschwärmer Manduca sexta 10, 11. Allerdings wenig Informationen existiert derzeit über die Vielfalt, Klassifizierung, Morphologie und Funktion von Blutzellen in nicht-Modell Insektenarten, vor allem diejenigen aus dem wilden 12 gesammelt.

Hier beschreiben wir eine einfache und effiziente Protokoll zum Extrahieren Blutzellen von wilden Raupen. Wir verwenden vorletzten Larvenstadium Lithacodes Fasciola (gelb-geschultert slug Motten) (Abbildung 1) und Euclea delphinii (spiny Eiche slug) Raupen (Lepidoptera: Limacodidae) und zeigen, dass ausreichende Mengen Hämolymphe (Insekten Blut)können isoliert und Hämozyten Zahlen von einzelnen Larven gezählt. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um effizient zu studieren Hämozyten Typen in diesen Arten sowie in anderen verwandten Lepidoptera Raupen vom Feld geerntet werden, oder er kann ohne weiteres mit immunologischen Tests zur Hämozyten Funktion nach Infektion mit mikrobiellen oder parasitischen Organismen untersuchen 13 kombiniert werden.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein. Materialvorbereitung

  1. Bereiten Nadeln (1-2 um Spitze und 3-4 mm Konus) mit Borosilikatglas Kapillaren und eine Feinpipettenziehvorrichtung. Geräteeinstellungen: Rampe: 561; Geschwindigkeit: 20; Wärme: 560; Verzögerung: 1; Zugkraft: 100; Druck: 500.
  2. Bereiten Sie die Sammlung Lösung: 60% der Grace-Medium (GM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 20% der Gerinnungshemmer Buffer (98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1,7 mM EDTA und 41 mM Zitronensäure, pH 4,5 ergänzt ). Die obige Lösung wird unter sterilen Bedingungen hergestellt frischen und auf Eis gehalten zu allen Zeiten.
  3. Bereiten Sie die Inkubationspuffer Lösung: 90% der GM ergänzt mit 10% FB....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Protokoll beschrieben erlaubt die Erfassung von einem minimalen Volumen von 10-20 ul von Insekten Hämolymphe von einzelnen Raupen. Hämocyten gesammelt unter Verwendung dieses Verfahrens sind frei von Verklumpungen Zelle, Melanisierung Defekte Gewebereste oder anderen Verunreinigungen. Deshalb Hämozyten kann leicht beobachtet und gezählt werden unter dem Mikroskop, und einige Insekten können in wenigen Hosur beobachtet werden. Wir beobachteten, dass die Mehrzahl der in unserer Hämocyten Proben plasmatocytes 3

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Methoden zur Extraktion von Blutzellen aus medizinisch wichtige Insekten und Faltern Modell Insekten wurden bisher 9, 14 berichtet. Hemocyte Extraktionsmethoden sind nach den Insektenarten angepasst, das Entwicklungsstadium der Insekten und ihre morphologischen Merkmale. Beispielsweise kann isoliert von Hämolymphe Manduca Larven leicht durch den gekrümmten Horn snipping nahe dem Ende des Bauches 15 durchgeführt werden. Weil Butzen Raupen (Limacodidae) dieses abdominalen Struktur fehlt, hab.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TMS wurde von der Harlan Trust Fellowship (GWU) in dieser Studie unterstützt. Die Finanzierung für Feldauflistung und Zucht L. Fasciola und E. delphinii wurde von NSF DEB 0642438 zu JTL vorgesehen.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Name des Reagenzes Firma Katalog-Nummer Kommentare
Feinpipettenziehvorrichtung Sutter Instruments P-1000
Borosilikatglasröhrchen Sutter Instruments B100-50-10 OD: 1,0, ID: 0,50 mm
Grace Medium Sigma G8142
Fötales Rinderserum Thermo Fisher Scientific SH3007102 Hitzeinaktiviertem
Dumont Nr. 5 Zange Fine Science Tools 11252-40
Neubauer Zählkammer Hausser Scientific 3200
Plastic tubing Tri-Tech TT-3-32OD OD: 3/32'', ID: 1/32 '
Glass medizinische Spritze Fortuna Optima D-97877 50 ml Volumen
Blunt Ende Nadel Kleinteile NE-162PL-25 16 Gauge x 1 "Länge

References

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 677(2006).
  2. Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hemocyte ExtractionCaterpillar HemolymphInsect Immune ResponseHemocytometer CountingAnesthetizing CaterpillarsShallow Incision TechniqueBuffer Solution InjectionHemolymph CollectionWild Caterpillar AnalysisCellular Immune Assays

Related Articles