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Methodenartikel

Ein Toolkit zur Umwandlung von Kohlenwasserstoffen in wässrigen Umgebungen aktivieren

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DOI:

10.3791/4182

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2. Oktober 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, Delft University of Technology, 2Delft Center for Systems and Control, Delft University of Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Eine nachhaltige auto Regulierung bakteriellen System für die Sanierung von Ölverschmutzungen wurde entwickelt, unter Verwendung von Standard austauschbare DNA Teile (BioBricks). Ein ausgereiftes E. coli Stamm wurde verwendet, um Alkane via β-Oxidation in toxischen wässrigen Umgebungen beeinträchtigen. Die entsprechenden Enzyme aus verschiedenen Arten zeigten Alkan Abbauaktivität. Darüber hinaus wird ein erhöhter Toleranz gegenüber N-Hexan wurde durch Einbringen von Genen aus Alkan-tolerante Bakterien erreicht.

Zusammenfassung

Diese Arbeit schlägt eine Toolkit, das die Umwandlung von Alkanen ermöglicht durch Escherichia coli und präsentiert ein Beweis für das Prinzip ihrer Anwendbarkeit. Das Toolkit besteht aus mehreren Standard-austauschbare Teile (BioBricks) 9 Bewältigung der Umwandlung von Alkanen, Regulation der Genexpression und Überleben in giftige Kohlenwasserstoff-reiche Umgebungen.

Ein Drei-Schritt-Weg für Alkan-Abbau wurde in E. implementiert coli, die Umwandlung von mittel-und langkettige Alkane, ihre jeweiligen Alkanole, Alkanale und letztlich Alkan-Säuren ermöglichen. Letztere wurden über die native β-Oxidationsweg metabolisiert. Um die Oxidation des Mediums Alkane (C5-C13) und Cycloalkanen (C5-C8), vier Gene (alkB2, rubA3, rubA4 und Rubb) der Alkanhydroxylase-System von Gordonia sp erleichtern. TF6 8,21 wurden in E. transformierten coli. Für die Umwandlung vonlangkettige Alkane (C15-C36) wurde der Lada-Gen aus Geobacillus thermodenitrificans umgesetzt. Für die erforderlichen weiteren Schritte des Abbauprozesses wurden ADH und ALDH (aus G. thermodenitrificans) 10,11 eingeführt. Die Aktivität wurde durch ruhende Zelle Assays gemessen. Für jede oxidative Schritt wurde Enzymaktivität beobachtet.

Um den Prozess zu optimieren, wurde die Expression nur unter Bedingungen induziert niedrigen Glucose: ein Substrat-regulierte Promotor, pCaiF, wurde verwendet. pCaiF ist in E. coli K12 und reguliert die Expression der Gene in den Abbau von Nicht-Glucose-Kohlenstoffquelle beteiligt.

Der letzte Teil des Toolkits - Targeting Überleben - umgesetzt wurde unter Verwendung von Lösungsmittel Toleranz Gene, PhPFDα und β, die beide aus Pyrococcus horikoshii OT3. Organische Lösemittel induzieren können Zellstress und verringerte Überlebensfähigkeit durch negativ affecting Proteinfaltung. Als Chaperone, verbessern PhPFDα und β das Protein Faltvorgang zB unter Anwesenheit von Alkanen. Die Expression dieser Gene führte zu einer verbesserten Toleranz Kohlenwasserstoff durch eine erhöhte Wachstumsrate (bis 50%) in den Anwesenheiten von 10% n-Hexan im Kulturmedium dargestellt beobachtet.

Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass das Toolkit E. ermöglicht coli zu konvertieren und tolerieren Kohlenwasserstoffe in wässriger Umgebung. Als solche ist sie ein erster Schritt hin zu einer nachhaltigen Lösung für die Öl-Sanierung mit Hilfe eines synthetischen Biologie Ansatz.

Einleitung

Ölverschmutzung gehört zu den schwerwiegendsten Ursachen für Umweltkontamination und beeinträchtigt Ökosysteme, Unternehmen und Gemeinschaften erheblich 3. Beispielsweise sind Lösungen erforderlich, um der anhaltenden Ölverschmutzung entgegenzuwirken, die aus den Tailingschwänzen der Ölsande in Alberta, Kanada, stammt. Während des Verfahrens zur Gewinnung von Öl aus Ölsanden wird Bitumen, eine halbfeste, oxidierte Form von Öl, mithilfe von thermischen Rückgewinnungstechniken entfernt, die etwa 3,1 Barrel Wasser pro Barrel Öl verbrauchen 1. Das mit Öl kontaminierte Prozesswasser, das hauptsächlich aus einem lokalen Fluss stammt, wird nach der Bitumengewinnung in Absetzbecken gespeichert. Eine effizientere Wiederverwendung des Prozesswassers ist erforderlich, um den Frischwasserbedarf zu verringern. Um die Bitumengewinnung zu erleichtern und sicherzustellen, dass die vorgeschriebenen Qualitätsstandards für Gewässer an nachgeschalteten Standorten zum Schutz aquatischer Ökosysteme eingehalten werden, entwickeln sich die Verfahren zur Aufbereitung des Prozesswassers rasant weiter 3.

Zur Behandlung von Umweltverschmutzung durch organische Verbindungen werden derzeit biotechnologische Sanierungsverfahren unter Verwendung von Mikroorganismen befürwortet 1. Alkane bilden die häufigste Kohlenwasserstoffgruppe im Rohöl und enthalten 5 bis 40 Kohlenstoffatome pro Molekül 7, 21. Bekanntermaßen können viele Bakterien Alkane unterschiedlicher Kettenlänge durch schrittweise Oxidation der terminalen Methylgruppe abbauen, wobei zunächst Alkohole, dann Aldehyde und schließlich Fettsäuren entstehen 8. In diesem iGEM-Projekt wurden mehrere Enzyme aus verschiedenen Organismen exprimiert und charakterisiert sowie über den BioBrick-Standard und die Registry of Standard Biological Parts verfügbar gemacht.

Das gut untersuchte Alkan-Hydroxylase-System von Gordonia sp. TF6 ermöglicht den initialen Oxidationsschritt von C5-C13-Alkanen sowie von C5-C8-Cycloalkanen unter Beteiligung von mindestens vier Komponenten: alkB2 (Alkan-1-Monooxygenase), rubA3, rubA4 (zwei Rubredoxine) und RubB (Rubredoxin-Reduktase) 8, 21. Die Oxidation langkettiger Alkane (von C15 bis C36) wird durch ladA vermittelt, eine Flavoprotein-Alkan-Monooxygenase aus Geobacillus thermodinitrificans NG-80-2 7, 15, 18, 22. LadA bildet einen katalytischen Komplex mit Flavinmononukleotid (FMN), der atomaren Sauerstoff zur Oxidation nutzt. Dies führt zur Umwandlung von Alkanen in die entsprechenden primären Alkanole. Die Alkohole werden anschließend durch Alkohol- und Aldehyddehydrogenasen zu Fettsäuren oxidiert, die leicht in den β-Oxidationsweg eintreten können 7, 21. Eine zinkunabhängige Alkoholdehydrogenase aus dem thermophilen Bakterium Geobacillus thermoleovorans B23 oxidiert mittelkettige Alkanole unter Verwendung von NAD+ als Cofaktor zu den entsprechenden Alkanalen 10. Die Aldehyddehydrogenase desselben Bakteriums kann den NAD+-abhängigen letzten Schritt der mittelkettigen Oxidation katalysieren 11.

Um die Induktionskosten zu senken und die optimale Proliferation des bakteriellen Systems aufrechtzuerhalten, wurde der Promotor pCaiF aus E. coli charakterisiert. Dieser Promotor kann die Expression der Komponenten des Kohlenwasserstoffabbauwegs regulieren und wird durch cAMP-Crp-Spiegel gesteuert, die wiederum von der Glukosekonzentration abhängen6. Bei hohen extrazellulären Glukosekonzentrationen in der Umgebung war der zelluläre cAMP-(zyklisches Adenosinmonophosphat-)Spiegel aufgrund der Hemmung der Adenylatzyklase als Nebeneffekt des PTS-vermittelten Glukosetransports niedrig. Umgekehrt stieg bei Limitierung (niedrigen Glukosekonzentrationen) der cAMP-Spiegel an, wodurch Crp an cAMP bindet und den Komplex cAMP-Crp bildet, der an pCaiF bindet und die Transkription der downstream gelegenen Komponenten aktiviert6, 14.

Wildtypische E. coli-Stämme vertragen nur moderate Konzentrationen von Kohlenwasserstoffen. Um das Toolkit zu vervollständigen, musste die Toleranz gegenüber Kohlenwasserstoffen berücksichtigt werden. Es sind mehrere organische Lösungsmittel resistente Bakterien bekannt, die in wässrigen Zweiphasensystemen mit Lösungsmitteln überleben können12. Molekulare Komponenten, die eine erhöhte Toleranz vermitteln, sind Chaperone, die die korrekte Faltung von Proteinen unterstützen. Es wurde gezeigt, dass das Prefoldin-System aus Pyrococcus horikoshii OT3, bestehend aus den Proteinen phPFDα und phPFDβ, die Toleranz gegenüber Kohlenwasserstoffen erhöht17.

Der Alkankonvertierungs-Baukasten wurde nach dem BioBrick-Prinzip konstruiert, das im Registry of Standard Biological Parts dokumentiert ist 9. BioBricks sind Plasmide, die eine spezifische funktionelle Sequenz enthalten, die von 4 vordefinierten Restriktionsstellen flankiert wird. Die BioBrick-Sequenzen können flexibel erweitert werden, wodurch der Aufbau biologischer Systeme mit neuen Funktionen ermöglicht wird.

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Protokoll

Ein. BioBrick Assembly

  1. BioBricks aus der Registry von Standard Biological Teile sind durch iGEM Hauptquartier zur Verfügung gestellt. Um eine neue BioBrick aus bestehenden BioBricks konstruieren, verdauen den Spender BioBrick (bis zu 1,0 ug) mit den Enzymen EcoRI und SpeI zur Positionierung der Donor Teil stromabwärts des Akzeptors Teil. Digest mit XbaI und PstI für die Positionierung des Spenders Teil stromaufwärts des Akzeptors Teil. Hinzufügen eines dritten entsprechenden Restriktionsenzym, das in der Hauptkette des Spenders schneidet. Führen Verdauungen in einem Gesamtvolumen von 20-25 ml mit dem geeigneten Puffer, nach dem Lieferanten (Endkonzentration 1x). Verwenden Sie 5 Einheiten / ug DNA für die Restriktionsenzyme.
  2. Verdauen Akzeptor BioBrick entweder mit EcoRI und XbaI oder SpeI und PstI.
  3. Inkubieren der Verdauungen für (mindestens) eine Stunde bei 37 ° C. Inaktivieren die Restriktionsendonukleasen durch Hitze, Inkubation bei 80 ° C für 10 min und zentrifugieren kurz.
  4. Ligieren der verdauten BioBrickTeile (Donor und Akzeptor) zusammen. Da XbaI und SpeI generieren kompatible DNA-Enden wird ein gemischtes Website erstellt, die nicht mit einem Restriktionsenzym zu einem neuen "kombinierte" BioBrick, dass von den 4 Standard-Restriktionsstellen flankiert geschnitten werden. In dem Ligationsgemisch die endgültige DNA-Konzentration ist vorzugsweise ~ 100 ng / ul. Führen die Ligationsreaktion in einem Gesamtvolumen von 10-15 ml mit der T4 Ligationspuffer (Endkonzentration 1x) und T4-Ligase (1 Unit / ug DNA).
  5. Inkubieren der Ligationsansatz bei 16 ° C für mindestens 3 Stunden.
  6. Führen Transformation Reaktion mit circa die Hälfte der Ligationsgemisch.
  7. Bestätigen Sie die BioBrick korrekt zu sein mit Sequenzierung.
  8. Um eine neue BioBrick aus synthetisierten DNA-Konstrukt, ändern die Gene für die Synthese für eine optimale Expression in E. coli mittels der Website JCat Werkzeug ( http://www.jcat.de/ ). Weitere Änderungen in Übereinstimmung mit den Anforderungen des B ioBrick Standard. Diese Standardisierung impliziert, dass jeder BioBrick einer DNA-Sequenz von Interesse durch ein Präfix und gefolgt von einem Zusatz besteht. Das Präfix und Suffix sind Sequenzen, die vordefinierte Restriktionsstellen, die abwesend sind in den verbleibenden Plasmid-Sequenz enthalten. Diese Standard-Restriktionsstellen machen es möglich, austauschen und erweitern die BioBrick Einsätze flexibel 9. Das Präfix und Suffix haben die folgenden Sequenzen:
Name Folge Kommentar
Präfix 5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAG3'
5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG 3' Wenn das folgende Teil eine kodierende Sequenz oder ein Teil, der mit "ATG" beginnt
Suffix 5 'TACTAGTAGCGGCCGCTGCAG 3'
ove_title "> 2. Alkane Conversion Resting Zell-Assay, In Vivo

Dieser Assay wurde basierend auf der Methode von Fujii et al. (2004) beschriebenen Verfahren durchgeführt.

  1. Kultur E. coli Zellen, die das Alkanhydroxylase-System ( BBa_K398014 ) und Zellen, die einen leeren Vektor ( BBa_J13002 ) in 5 ml LB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika über Nacht.
  2. Übertragen 500 ul der Übernachtkultur in 50 ml frisches LB (mit Antibiotikum) und inkubieren, bis die Zelle Trübung eine OD (optische Dichte) von 0,3 bei 600 nm.
  3. Zentrifuge für 10 min bei 4.000 rpm und das Pellet in 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4).
  4. Zentrifugieren für 10 min bei 4.000 rpm und das Pellet in 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer nun enthaltenden E2 Salze und 0,66% v / v Glycerin (Stickstoff-Mangelerscheinungent medium).
  5. Messung der Trübung Zelle (OD 600).
  6. Planen Zell-Gemisch von 6 ml Aliquots in 25 ml geschlossenen Kappe Glaskolben und No-Zellkontrollen (E2 Salze + 0,66% v / v Glycerol).
  7. Fügen Sie 100 nmol von Alkan zu jeder Flasche.
  8. Inkubieren der Mischungen bei 37 ° C für 24 h (verkürzen, wenn höhere Raten erzielt werden).
  9. Messen Sie die OD 600 nach Inkubation.
  10. Extrahieren der Kohlenwasserstoffe in den Kulturmedien durch Ethylacetat und bestimmen Kohlenwasserstoffkonzentration in Zellkultur durch Gaschromatographie (siehe Protokoll 3).
  11. Berechnen den Abbau von Biomasse pro Zeiteinheit durch Teilen der Gesamtmenge des Alkans durch die gesamte Biomasse in jedem Kolben (konvertieren OD 600 auf Trockenmasse) umgerechnet. Teilen des Ergebnisses durch die Versuchsdauer ergibt die Abbauaktivität pro Biomasse pro Zeiteinheit. Der Durchschnitt wird aus drei einzelnen Läufe genommen.

3. Alkan Conversion-Enzym-Assay, InVitro

Dieser Assay wurde im Wesentlichen nach der Methode von Li et al. (2008) beschriebenen Verfahren durchgeführt.

  1. Kultur E. coli-Zellen, die Lada-Gen ( BBa_K398017 ) und Zellen, die einen leeren Vektor ( BBa_J13002 ) in 50 ml LB-Medium mit entsprechenden Antibiotika über Nacht.
  2. Übertragen 500 ul der Übernachtkultur in 50 ml frisches LB (mit Antibiotikum) und inkubieren, bis die Zelle Trübung erreicht eine optische Dichte von 0,6 bei 600 nm.
  3. Zentrifuge 10 min bei 4000 rpm (4 ° C) und das Pellet in 5 ml 50 mM Tris-Puffer.
  4. Beschallen (Cell Disruptor, LA Biosystems) wurden die Zellen bei 40% Einschaltdauer mit einer Leistung Steuerung von 4, halten Sie die Lösung auf Eis für die gesamte Dauer.
  5. Zentrifugieren der resultierenden Mischung für 5 Minuten bei 4000 rpm bei 4 & dzB, C, um die Zelltrümmer zu entfernen. Den Überstand in ein frisches Röhrchen.
  6. Bestimmen die Gesamtproteinkonzentration der Zellextrakte nach Bradford. Hinweis: Verwenden Sie Glasfläschchen, die Erhöhung der Hintergrund und / oder Verlust des Proteins zu verhindern.
  7. Vorbereiten einer Mischung, enthaltend 100 ml 0,1% v / v Alkan und 50 mM Tris-HCl-Puffer.
  8. Das Gemisch wird bei 100 ° C für 5 min. Hinweis: Führen Sie diesen Schritt nur für mittel-bis langfristige Alkane mit hohem Siedepunkt. (ZB C 16: 287 ° C).
  9. Um eine optimale Löslichkeit des Alkans zu erreichen, für 1 min und noch warm, bis eine homogene, viskose Mischung erhalten beschallen.
  10. Hinzufügen 1mM von NADH, 1 mM FMN, 1 mM MgSO 4 und 0,01 v / v Triton X-100.
  11. Bereiten Sie 6 ml Aliquots in 25 ml geschlossener Kappe Kolben.
  12. Hinzufügen ausreichender Mengen von Zellextrakt (abhängig von Bradford-Assays, Endkonzentration von 5 mg Protein / l). Bereiten Sie eine nicht-Protein-Kontrolle.
  13. Inkubieren bei 60 ° C (für eine optimale Enzymatic Aktivität) für 24 Stunden.
  14. Extrahieren der Kohlenwasserstoffe in den Kulturmedien durch Ethylacetat und bestimmen Kohlenwasserstoffkonzentration in Zellkultur durch Gaschromatographie (siehe Protokoll 3).
  15. Berechnen den Abbau von Biomasse pro Zeiteinheit durch Teilen der Gesamtmenge des Alkans durch Gesamtprotein umgewandelt hinzugefügt zu jedem Kolben (durch Bradford Eichkurve). Weitere Division durch Versuchsdauer ergibt die Abbauaktivität pro Einheit des zellulären Proteins pro Zeiteinheit. Der Durchschnitt wird aus drei einzelnen Läufe genommen.

4. Ethylacetat Hydrocarbon Extraction und Konzentrationsmessung

  1. Alkane werden aus der wässrigen Lösung durch Zugabe von 2,5 ml Ethylacetat (apolaren solvant) bis 6 ml experimentelle Lösung extrahiert. Ein interner Standard wird zum Lösungsmittel in einer Konzentration von 0,1% (v / v) zugegeben. Der Standard (z. B. Cyclo-decan) variiert in Abhängigkeit von der erwarteten Bereich der Spitzen von Interesse.
  2. Optional: Add TritonX-100 zu der wässrigen Mischung und Zentrifugieren der Proben für 10 min bei 4.000 UpM, um eine ordnungsgemäße zweiphasige System zu erhalten.
  3. Vortex die Mischung für 5 sec (1.500 rpm) und bei Raumtemperatur inkubieren, bis die beiden Phasen getrennt.
  4. Entfernen einer maximalen Menge der organischen Schicht (oben) und Trocknen des Lösungsmittels unter Verwendung von wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet.
  5. Entfernen MgSO 4 durch Filtration (0,2 pm) und übertragen das Filtrat in Gaschromatographen Fläschchen für Messungen oder bei -20 ° C.
  6. Bestimmen Sie die Konzentration durch Gaschromatographie unter Verwendung einer CP-SIL 5CB Säule (Länge = 5 m). Jeweils 10 ul Probe im Split-Modus (1:10, 230 ° C). Setzen der Säule Gasströmung auf 1 ml / min (Helium). Im folgenden Ofentemperatur Programm wird verwendet:
    Rate Temperatur [° C] Zeit [min]
    0 50 7,5
    50 90 1,0
    50 110 2,0
    50 130 2,0
    50 145 2,0
    50 160 2,0
    50 170 2,0
    50 185 2,0
    50 210 2,0
    50 250 2,0
    50 320 2,0
  7. Integrieren Gipfeln und korrigieren die Konzentrationen gegenüber dem internen Standard.

5. Alkohol / Aldehyd-Dehydrogenase-Aktivitäts-Assay

Dieser Assay wurde im Wesentlichen nach der Methode von Kato et al beschriebenen Verfahren durchgeführt.(2010).

  1. Kultur E. coli Zellen, die das ADH ( BBa_K398018 ) oder ALDH ( BBa_K398030 )-Gen und Zellen, die einen leeren Vektor ( BBa_J13002 ) in 50 ml LB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika über Nacht.
  2. Übertragen 500 ul der Übernachtkultur in 50 ml frisches LB (mit Antibiotikum) und inkubieren, bis die Zelle Trübung erreicht eine optische Dichte von 0,6 bei 600 nm.
  3. Zentrifuge 10 min bei 4000 rpm bei 4 ° C und das Pellet in 5 ml 50 mM Tris-Puffer.
  4. Beschallen die Zelle bei 40% Einschaltdauer mit einer Leistung Kontrolle 4 (halten Sie die Lösung auf Eis während der Ultraschallbehandlung).
  5. Zentrifugieren der resultierenden Mischung für 5 Minuten bei 4000 rpm bei 4 ° C, um Zelltrümmer zu entfernen.
  6. Bestimmen Sie die zutal Proteinkonzentration der Zellextrakte nach Bradford (Hinweis: Verwenden Sie ein Glasfläschchen, um Protein-Bindung zu verhindern).
  7. Legen Sie eine 96-Well-Platte mit 180 ul 57 mM Glycin-Puffer, der NAD (Endkonzentration 1 mM, pH 9,5) in jedes Well.
  8. Hinzufügen 5 ul des Alkohols (Aldehyd), um in die Vertiefungen getestet werden. Anmerkung: Wärme langkettige Alkohole vor Beginn des Assays, um eine Flüssigkeit haben. Für jede Alkohol (Aldehyd) eine Kontrolle ohne Substrat sollte hinzugefügt (negative Kontrolle) werden. Zusätzlich wird eine Blindlösung, die eine Mischung aus Puffer und dem Substrat ohne Zellextrakt.
  9. Vorheizen Platte des Plattenlesers (Tecan Magellan v7.0) für 15 min bei 37 ° C bis Äquilibrierung des Systems zu ermöglichen.
  10. Hinzufügen ausreichender Mengen von Zellextrakt (abhängig von Bradford-Assays, Endkonzentration von 5 mg Protein / l). Bereiten Sie eine nicht-Protein-Kontrolle.
  11. Messung der NADH-Produktion mit einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 340 nm alle 2-3 Min. für 1 Stunde bei 37 ° C
  12. Berechnen den NADH-Produktionsrate von der Steigung der OD (340 nm). Berücksichtigen Sie das Licht Weglänge und des Extinktionskoeffizienten von NADH von 6220 M -1 cm -1. Unterteilen den NADH-Produktionsrate von der Gesamtmenge an Protein hinzugefügt, um die Aktivität des Dehydrogenaseumsetzung im Zellextrakt (U / mg gesamten Zellproteins) exprimieren. Berechnen des Mittelwertes und der Standardabweichung aus drei unabhängigen Läufen.

6. pCaiF Charakterisierung

  1. Kultur E. coli Zellen, die das Konstrukt pCaiF-GFP ( BBa_K398331 ) und Zellen, die den Promotor alleine ( BBa_K398326 ) über Nacht in 5 ml LB-Medium über Nacht die entsprechenden Antibiotika.
  2. Beimpfen 5 ml M9 mit 10 g / l Glukose und Antibiotika mit 50 ul der Übernachtkultur und wachsen über Nacht.
  3. Subkultur 50 ul der Übernacht-Auswuchs in 5 ml frisches M9 mit 10 g / l und inkubieren, bis die Zelle Trübung erreicht eine optische Dichte von 0,2 bei 600 nm aufweist.
  4. Laden einer Platte mit 96 Vertiefungen mit 100 ml frisches M9-Medium, das die gewünschte Menge an Kohlenstoffquelle zum Prüfen in jeder Vertiefung. Führen Dreifachversuche der statistischen Auswertung und fügen Sie die entsprechenden negativen Kontrollen (Wildtyp E. coli K12).
  5. Fügen Sie 5 ul der Übernachtkultur den Medium mit Brunnen.
  6. Messung der Wachstumskurve (OD 600) und GFP-Fluoreszenz (485 nm Anregung und 520 Emission) unter Verwendung eines Plattenlesegeräts alle 10 min für 18 Stunden bei 37 ° C unter konstantem Schütteln inkubiert.
  7. Berechnen Sie die Wachstumsrate und die spezifische GFP Inhalte aus den jeweiligen Messungen und vergleichen Sie die Kontrolle. Berechnen des Mittelwertes und der Standardabweichung von mindestens drei unabhängigen Experimenten.

7. Toleranz Assay

  1. KulturE. coli, PhPFDα und β-Gen ( BBa_K398406 ) über Nacht in 5 ml LB-Medium und den entsprechenden Antibiotika. E. coli exprimierenden Lada Gen ( BBa_K398017 ) als negative Kontrolle verwendet.
  2. Subkultur 10 ul der Übernacht-Auswuchs in frisches 5 ml LB (mit Antibiotikum) und inkubieren, bis die Zelle Trübung erreicht eine optische Dichte von 0,3 bis 0,4 bei 600 nm aufweist.
  3. Verdünnen Sie die Kulturen mit frischem Medium, bis eine OD 600 von 0,1 erreicht ist.
  4. Laden einer Platte mit 96 Vertiefungen mit 180 ul M9 Medium mit den entsprechenden Antibiotika und die korrekte Endkonzentration der toxischen Verbindung (zB 0, 4, 8, 10% n-Hexan) in dreifacher Ausfertigung. Weil Alkan-Wasser-Gemischen zu zweiphasigen Systemen führen können ist es notwendig, geeignete Bedienelemente auf der Platte haben (zB dUNTERSCHIEDLICHE Stämme und die jeweiligen leere Experimente).
  5. Fügen Sie 20 ul der Kultur (Kontrolle) in die Vertiefungen.
  6. Messung der Biomassekonzentration (OD 600) unter Verwendung eines Plattenlesegeräts alle 10 min für 24 Stunden bei 37 ° C unter konstantem Schütteln inkubiert.
  7. Berechnen Sie die Wachstumsraten aus den jeweiligen Messungen für die verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen und im Vergleich zu der negativen Kontrolle. Berechnen des Mittelwertes und der Standardabweichung von mindestens drei unabhängigen Läufen.

8. Homolog Interaction Mapping

  1. Die Anwendung HIM wurde entwickelt, um Protein-Abfragen auf einer PostgreSQL-Server mit dem STRING-Datenbank (kostenlos für den akademischen Gebrauch) 20 durchzuführen. Das Homologe Interaktion Mapping-Anwendung identifiziert interagierende Proteine ​​in der ursprünglichen Wirtsorganismus mit dem STRING-Datenbank. Die Sequenzen der entsprechenden Gene sind in Wechselwirkung einer BLAST-Suche, um homologe Gene in den Zielorganismus finden verwendet. Cytoscape 4 verwendet wird, um das Ergebnis der Zuordnung zu visualisieren. : Die HIM-Software-Tool kann unter folgender Adresse heruntergeladen werden https://github.com/jcnossen/InteractionHomologMapping.
  2. Um eine Zuordnung durchführen, (1) geben Sie die BioBrick ID und die Anwendung wird automatisch die Teilsequenz Daten aus der Registry von Standard Biological Parts 9 oder (2) Geben (Paste) der Sequenzdaten in der Anwendung.
  3. Verwenden Sie den STRING Database Website, um die String-Protein-ID für die eingegebenen Aminosäuresequenz zu finden.
  4. Ein Protein mit hoher Homologie wird unter Verwendung BLAST. Anschließend wird die Anwendung listet jeden bekannten interagierende Protein in der Quelle Organismus und sucht nach Homologen im Wirtsorganismus (zB E. coli).
  5. Export resultierenden vermeintlichen Interaktion Liste Text oder Cytoscape.

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Ergebnisse

Alkanumwandlung

Die Aktivität der drei Oxidationsschritte vom Alkan zur jeweiligen Fettsäure wurde mithilfe von Ruhezellen-Assays und Enzymaktivitätsmessungen bewertet. Die Ergebnisse werden entsprechend den Reaktionen des Stoffwechselwegs dargestellt: (1) Alkan-Hydroxylase, (2) Alkohol-Dehydrogenase und (3) Aldehyd-Dehydrogenase.
Für den ersten Schritt wurden verschiedene Plasmide für mittelkettige und langkettige Alkane konstruiert. Das Plasmid

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Diskussion

Die BioBrick Prinzip wird ein Fahrwerk für den Abbau von Alkanen zu konstruieren und einen Beweis des Prinzips für die einzelnen Komponenten des Toolkits wurde erhalten. Mehrere Tests werden vorgeschlagen, um die in vivo und in-vitro-Aktivität von Alkan abbauenden Stoffwechselenzyme messen. Die vorliegende Arbeit demonstriert erfolgreich eine Reihe von Methoden, die verwendet werden, um Enzymaktivitäten und Ausdruck in der Wirtsorganismus E. bestimmt werden kann coli nach der Implemen...

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Offenlegungen

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

Die Experimente in diesem Video-Artikel ausgeführt wurden für den internationalen Genetically Engineered Machine Wettbewerb 9 entwickelt. Die Autoren danken iGEM Teammitglieder Luke Bergwerff, Pieter TM van Boheemen, Jelmer Cnossen, Hugo F. Cueto Rojas und Ramon van der Valk für die Unterstützung in der Forschung. Wir danken Han de Winde, Stefan de Kok und Esengül Yıldırım für hilfreiche Diskussionen und Hosting dieser Forschung. Diese Arbeit wurde von der TU Delft University Department of Biotechnology, The Delft Bioinformatik-Labor, TU Delft Department of Bionanoscience, Oil Sands Leadership Initiative (OSLI), Stud studentenuitzendbureau, Niederlande Genomics Initiative, Kluyver Centre, Nederlandse Vereniging Biotechnologische (Stichting Biotechnology Nederland) unterstützt , DSM, Geneart, Greiner Bio-One und Genencor.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
E. coli K12New England BiolabsC2523H
OktanFluka74822
HexadecanFluka52209
Octanol-1Fluka95446
Dodecanol-1Sigma-Aldrich126799
HexanSigma-Aldrich296090
NADHSigma-AldrichN4505
FMNSigma-AldrichF2253
MgSO4J.T. Baker Casno7487 889
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
T4-LigaseNew England BiolabsM0202L
Gaschromatograph
ZellzerreiberLA BiosystemsCD-019
SpektralphotometerAmersham Pharmaciaspec 2000
PlattenreaderTecan Group Ltd.Magellan v7.0
Brutschrank Innova, 44
BioBrickTM K398014: BBa_J23100-BBa_J61100-alkB2-BBa_J61100-rubA3-BBa_J61100-rubA4- BBa_J61100-rubBTechnische Universität Delft, Abteilung für Biotechnologie oder Registrierung standardisierter biologischer BauteileBBa_K398014Alkan-Hydroxylase-System
Resistenz: Chloramphenicol
BioBrickTM K398027: BBa_R0040-BBa_B0034-ladA Technische Universität Delft, Abteilung für Biotechnologie oder Registry of Standard Biological PartsBBa_K398027ladA-Protein-Generator
Resistenz: Chloramphenicol
BioBrickTM K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-ADH Technische Universität Delft, Fachbereich Biotechnologie oder Registrierung standardisierter biologischer BauteileBBa_K398018ADH-Generator
Resistenz: Chloramphenicol
BioBrickTM K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-ALDH Technische Universität Delft, Fachbereich Biotechnologie oder Registrierung standardisierter biologischer BauteileBBa_K398030ALDH-Generator
Resistenz: Chloramphenicol
BioBrickTM K398326: pCaiF Technische Universität Delft, Abteilung für Biotechnologie oder Registry of Standard Biological PartsBBa_K398326pCaiF-Promotor
Resistenz: Chloramphenicol
BioBrickTM K398331: pCaiF-BBa_B0032-BBa_I13401Technische Universität Delft, Fachbereich Biotechnologie oder Registrierung standardisierter biologischer BauteileBBa_K398331pCaiF-Messgerät
Resistenz: Chloramphenicol
BioBrickTM K398406: BBa_J23002-BBa_J61107-phPFDα-BBa_J61107- Technische Universität Delft, Fachbereich Biotechnologie oder Registrierung standardisierter biologischer BauteileBBa_K398406Cluster für Lösungsmitteltoleranz
Resistenz: Chloramphenicol

Referenzen

  1. Allen, E. W. Process water treatment in Canada's oil sands industry: I: Target pollutants and treatment objectives. J. Environ. Eng. Sci. 7, 123-138 (2008).
  2. Alon, U. An Introduction to Systems Biology: Design Principles of Biological Circuits. , CRC Press. (2007).
  3. Center, O. P. Understanding Oil Spills and Oil Spill Response. , (1999).
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