Ein Toolkit zur Umwandlung von Kohlenwasserstoffen in wässrigen Umgebungen aktivieren

Zusammenfassung

Eine nachhaltige auto Regulierung bakteriellen System für die Sanierung von Ölverschmutzungen wurde entwickelt, unter Verwendung von Standard austauschbare DNA Teile (BioBricks). Ein ausgereiftes E. coli Stamm wurde verwendet, um Alkane via β-Oxidation in toxischen wässrigen Umgebungen beeinträchtigen. Die entsprechenden Enzyme aus verschiedenen Arten zeigten Alkan Abbauaktivität. Darüber hinaus wird ein erhöhter Toleranz gegenüber N-Hexan wurde durch Einbringen von Genen aus Alkan-tolerante Bakterien erreicht.

Zusammenfassung

Diese Arbeit schlägt eine Toolkit, das die Umwandlung von Alkanen ermöglicht durch Escherichia coli und präsentiert ein Beweis für das Prinzip ihrer Anwendbarkeit. Das Toolkit besteht aus mehreren Standard-austauschbare Teile (BioBricks) ⁹ Bewältigung der Umwandlung von Alkanen, Regulation der Genexpression und Überleben in giftige Kohlenwasserstoff-reiche Umgebungen.

Ein Drei-Schritt-Weg für Alkan-Abbau wurde in E. implementiert coli, die Umwandlung von mittel-und langkettige Alkane, ihre jeweiligen Alkanole, Alkanale und letztlich Alkan-Säuren ermöglichen. Letztere wurden über die native β-Oxidationsweg metabolisiert. Um die Oxidation des Mediums Alkane (C5-C13) und Cycloalkanen (C5-C8), vier Gene (alkB2, rubA3, rubA4 und Rubb) der Alkanhydroxylase-System von Gordonia sp erleichtern. TF6 ^8,21 wurden in E. transformierten coli. Für die Umwandlung vonlangkettige Alkane (C15-C36) wurde der Lada-Gen aus Geobacillus thermodenitrificans umgesetzt. Für die erforderlichen weiteren Schritte des Abbauprozesses wurden ADH und ALDH (aus G. thermodenitrificans) ^10,11 eingeführt. Die Aktivität wurde durch ruhende Zelle Assays gemessen. Für jede oxidative Schritt wurde Enzymaktivität beobachtet.

Um den Prozess zu optimieren, wurde die Expression nur unter Bedingungen induziert niedrigen Glucose: ein Substrat-regulierte Promotor, pCaiF, wurde verwendet. pCaiF ist in E. coli K12 und reguliert die Expression der Gene in den Abbau von Nicht-Glucose-Kohlenstoffquelle beteiligt.

Der letzte Teil des Toolkits - Targeting Überleben - umgesetzt wurde unter Verwendung von Lösungsmittel Toleranz Gene, PhPFDα und β, die beide aus Pyrococcus horikoshii OT3. Organische Lösemittel induzieren können Zellstress und verringerte Überlebensfähigkeit durch negativ affecting Proteinfaltung. Als Chaperone, verbessern PhPFDα und β das Protein Faltvorgang zB unter Anwesenheit von Alkanen. Die Expression dieser Gene führte zu einer verbesserten Toleranz Kohlenwasserstoff durch eine erhöhte Wachstumsrate (bis 50%) in den Anwesenheiten von 10% n-Hexan im Kulturmedium dargestellt beobachtet.

Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass das Toolkit E. ermöglicht coli zu konvertieren und tolerieren Kohlenwasserstoffe in wässriger Umgebung. Als solche ist sie ein erster Schritt hin zu einer nachhaltigen Lösung für die Öl-Sanierung mit Hilfe eines synthetischen Biologie Ansatz.

Einleitung

Ölverschmutzung gehört zu den schwerwiegendsten Ursachen für Umweltverschmutzung und wirkt sich stark auf Ökosysteme, Unternehmen und Gemeinden ^{aus 3}. Zum Beispiel sind Lösungen erforderlich, um die anhaltende Ölverschmutzung zu bekämpfen, die von den Ölsanden in den Abwässern in Alberta, Kanada, ausgeht. Während des Prozesses der Ölgewinnung aus Ölsanden wird Bitumen, eine halbfeste oxidierte Form von Öl, mit thermischen Rückgewinnungstechniken entfernt, die etwa 3,1 Barrel Wasser pro einem einzigen Barrel Öl verbrauchen ¹. Mit Öl verunreinigtes Prozesswasser, das hauptsächlich aus einem lokalen Fluss stammt, wird nach der Bitumengewinnung in Absetzbecken gelagert. Ein effektiveres Recycling von Prozesswasser ist erforderlich, um den Bedarf an Frischwasseraufnahme zu reduzieren. Um die Bitumengewinnung zu erleichtern und sicherzustellen, dass die flussabwärts gelegenen Standorte die Wasserqualitätsrichtlinien zum Schutz aquatischer Ökosysteme erfüllen, entwickeln sich die Prozesswasseraufbereitungen rasch weiter ³.

Um die Verschmutzung durch organische Verbindungen zu behandeln, werden derzeit biologische Sanierungstechnologien mit Mikroorganismen gefördert ¹. Alkane sind die am häufigsten vorkommende Familie von Kohlenwasserstoffen im Erdöl und enthalten 5 bis 40 Kohlenstoffatome pro Molekül ^{7, 21}. Es ist bekannt, dass viele Bakterien Alkane unterschiedlicher Länge durch sequentielle Oxidation der terminalen Methylgruppe abbauen, wobei zunächst Alkohole, dann Aldehyde und schließlich Fettsäuren gebildet ^{werden 8}. Im Rahmen dieses iGEM-Projekts wurden mehrere Enzyme aus verschiedenen Organismen exprimiert und charakterisiert und über den BioBrick-Standard und das Registry of Standard Biological Parts zur Verfügung gestellt.

Das gut untersuchte Alkan-Hydroxylase-System von Gordonia sp. TF6 erleichtert den ersten Oxidationsschritt von C_{5-C 13-Alkanen} zusammen mit dem von C_{5-C 8} Cycloalkanen unter Verwendung von mindestens vier Komponenten: alkB2 (Alkan-1-Monooxygenase), rubA3, rubA4 (zwei Rubredoxine) und RubB (Rubredoxinreduktase) 8, ²¹. Es wird berichtet, dass die Oxidation von langkettigen Alkanen (im Bereich von C₁₅ bis C₃₆) durch ladA, eine Flavoprotein-Alkan-Monooxygenase aus Geobacillus thermodinitrificans NG-80-2 ^{7, 15, 18, 22}, durchgeführt wird. LadA bildet einen katalytischen Komplex mit Flavinmononukleotid (FMN), der atomaren Sauerstoff zur Oxidation verwendet. Dies führt zur Umwandlung von Alkanen in das entsprechende Primäralkanol. Die Alkohole werden ferner durch Alkohol- und Aldehyddehydrogenasen zu Fettsäuren oxidiert, die ohne weiteres in den β-Oxidationsweg ^{7, 21} eintreten. Eine zinkunabhängige Alkoholdehydrogenase aus dem thermophilen Bakterium Geobacillus thermoleovorans B23 oxidiert mittelkettige Alkanole in ihre jeweiligen Alkanäle, wobei NAD⁺ als Cofaktor ¹⁰ verwendet wird. Aldehyddehydrogenase aus demselben Bakterium ist in der Lage, den NAD⁺-abhängigen letzten Schritt in der mittelkettigen Oxidation zu katalysieren ¹¹.

Um die Induktionskosten zu senken und eine optimale Vermehrung des bakteriellen Systems zu gewährleisten, wurde der Promotor pCaiF aus E.coli charakterisiert. Dieser Promotor kann die Expression der Komponenten des Kohlenwasserstoffabbauwegs regulieren und wird durch den cAMP-Crp-Spiegel reguliert, der wiederum vom Glukosespiegel abhängt ⁶. Bei hohen extrazellulären Glukosekonzentrationen in der Umwelt war der zelluläre cAMP-Spiegel (zyklisches Adenosinmononukleotidphosphat) durch die Hemmung der Adenylylcyclase als Nebenwirkung des PTS-vermittelten Glukosetransports niedrig. Umgekehrt stieg während der Begrenzung (niedrige Glukosekonzentrationen) der cAMP-Spiegel an und Crp band an cAMP, wodurch der Komplex cAMP-Crp gebildet wurde, der pCaiF band und die Transkription der nachgeschalteten Komponenten ^{aktivierte 6, 14}.

Wildtyp E. coli kann nur moderate Konzentrationen von Kohlenwasserstoffen tolerieren. Um das Toolkit zu vervollständigen, musste die Toleranz gegenüber Kohlenwasserstoffen berücksichtigt werden. Es ist bekannt, dass mehrere organische, lösungsmitteltolerante Bakterien in zweiphasigen Wasser-Lösungsmittel-Systemen überleben ¹². Molekulare Komponenten, von denen bekannt ist, dass sie die Toleranz erhöhen, sind Chaperone, die die korrekte Faltung von Proteinen erleichtern. Es wurde gezeigt, dass das Prefoldin-System aus Pyrococcus horikoshii OT3, bestehend aus den Proteinen phPFDα und phPFDβ, die Kohlenwasserstofftoleranz erhöht ¹⁷.

Das Alkan-Umwandlungs-Toolkit wurde nach dem BioBrick-Prinzip entwickelt, das im Registry of Standard Biological Parts ⁹ dokumentiert ist. BioBricks sind Plasmide, die einen spezifischen funktionellen Einsatz enthalten, der von 4 vordefinierten Restriktionsstellen flankiert wird. Die BioBrick-Einsätze sind flexibel erweiterbar und ermöglichen so den Bau biologischer Systeme mit neuen Funktionen.

Protokoll

Ein. BioBrick Assembly

1. BioBricks aus der Registry von Standard Biological Teile sind durch iGEM Hauptquartier zur Verfügung gestellt. Um eine neue BioBrick aus bestehenden BioBricks konstruieren, verdauen den Spender BioBrick (bis zu 1,0 ug) mit den Enzymen EcoRI und SpeI zur Positionierung der Donor Teil stromabwärts des Akzeptors Teil. Digest mit XbaI und PstI für die Positionierung des Spenders Teil stromaufwärts des Akzeptors Teil. Hinzufügen eines dritten entsprechenden Restriktionsenzym, das in der Hauptkette des Spenders schneidet. Führen Verdauungen in einem Gesamtvolumen von 20-25 ml mit dem geeigneten Puffer, nach dem Lieferanten (Endkonzentration 1x). Verwenden Sie 5 Einheiten / ug DNA für die Restriktionsenzyme.
2. Verdauen Akzeptor BioBrick entweder mit EcoRI und XbaI oder SpeI und PstI.
3. Inkubieren der Verdauungen für (mindestens) eine Stunde bei 37 ° C. Inaktivieren die Restriktionsendonukleasen durch Hitze, Inkubation bei 80 ° C für 10 min und zentrifugieren kurz.
4. Ligieren der verdauten BioBrickTeile (Donor und Akzeptor) zusammen. Da XbaI und SpeI generieren kompatible DNA-Enden wird ein gemischtes Website erstellt, die nicht mit einem Restriktionsenzym zu einem neuen "kombinierte" BioBrick, dass von den 4 Standard-Restriktionsstellen flankiert geschnitten werden. In dem Ligationsgemisch die endgültige DNA-Konzentration ist vorzugsweise ~ 100 ng / ul. Führen die Ligationsreaktion in einem Gesamtvolumen von 10-15 ml mit der T4 Ligationspuffer (Endkonzentration 1x) und T4-Ligase (1 Unit / ug DNA).
5. Inkubieren der Ligationsansatz bei 16 ° C für mindestens 3 Stunden.
6. Führen Transformation Reaktion mit circa die Hälfte der Ligationsgemisch.
7. Bestätigen Sie die BioBrick korrekt zu sein mit Sequenzierung.
8. Um eine neue BioBrick aus synthetisierten DNA-Konstrukt, ändern die Gene für die Synthese für eine optimale Expression in E. coli mittels der Website JCat Werkzeug ( http://www.jcat.de/ ). Weitere Änderungen in Übereinstimmung mit den Anforderungen des B ioBrick Standard. Diese Standardisierung impliziert, dass jeder BioBrick einer DNA-Sequenz von Interesse durch ein Präfix und gefolgt von einem Zusatz besteht. Das Präfix und Suffix sind Sequenzen, die vordefinierte Restriktionsstellen, die abwesend sind in den verbleibenden Plasmid-Sequenz enthalten. Diese Standard-Restriktionsstellen machen es möglich, austauschen und erweitern die BioBrick Einsätze flexibel ^9. Das Präfix und Suffix haben die folgenden Sequenzen:

Name	Folge	Kommentar
Präfix	5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAG3'
	5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG 3'	Wenn das folgende Teil eine kodierende Sequenz oder ein Teil, der mit "ATG" beginnt
Suffix	5 'TACTAGTAGCGGCCGCTGCAG 3'

ove_title "> 2. Alkane Conversion Resting Zell-Assay, In Vivo

Dieser Assay wurde basierend auf der Methode von Fujii et al. (2004) beschriebenen Verfahren durchgeführt.

1. Kultur E. coli Zellen, die das Alkanhydroxylase-System ( BBa_K398014 ) und Zellen, die einen leeren Vektor ( BBa_J13002 ) in 5 ml LB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika über Nacht.
2. Übertragen 500 ul der Übernachtkultur in 50 ml frisches LB (mit Antibiotikum) und inkubieren, bis die Zelle Trübung eine OD (optische Dichte) von 0,3 bei 600 nm.
3. Zentrifuge für 10 min bei 4.000 rpm und das Pellet in 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4).
4. Zentrifugieren für 10 min bei 4.000 rpm und das Pellet in 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer nun enthaltenden E2 Salze und 0,66% v / v Glycerin (Stickstoff-Mangelerscheinungent medium).
5. Messung der Trübung Zelle (OD _600).
6. Planen Zell-Gemisch von 6 ml Aliquots in 25 ml geschlossenen Kappe Glaskolben und No-Zellkontrollen (E2 Salze + 0,66% v / v Glycerol).
7. Fügen Sie 100 nmol von Alkan zu jeder Flasche.
8. Inkubieren der Mischungen bei 37 ° C für 24 h (verkürzen, wenn höhere Raten erzielt werden).
9. Messen Sie die OD ₆₀₀ nach Inkubation.
10. Extrahieren der Kohlenwasserstoffe in den Kulturmedien durch Ethylacetat und bestimmen Kohlenwasserstoffkonzentration in Zellkultur durch Gaschromatographie (siehe Protokoll 3).
11. Berechnen den Abbau von Biomasse pro Zeiteinheit durch Teilen der Gesamtmenge des Alkans durch die gesamte Biomasse in jedem Kolben (konvertieren OD ₆₀₀ auf Trockenmasse) umgerechnet. Teilen des Ergebnisses durch die Versuchsdauer ergibt die Abbauaktivität pro Biomasse pro Zeiteinheit. Der Durchschnitt wird aus drei einzelnen Läufe genommen.

3. Alkan Conversion-Enzym-Assay, InVitro

Dieser Assay wurde im Wesentlichen nach der Methode von Li et al. (2008) beschriebenen Verfahren durchgeführt.

1. Kultur E. coli-Zellen, die Lada-Gen ( BBa_K398017 ) und Zellen, die einen leeren Vektor ( BBa_J13002 ) in 50 ml LB-Medium mit entsprechenden Antibiotika über Nacht.
2. Übertragen 500 ul der Übernachtkultur in 50 ml frisches LB (mit Antibiotikum) und inkubieren, bis die Zelle Trübung erreicht eine optische Dichte von 0,6 bei 600 nm.
3. Zentrifuge 10 min bei 4000 rpm (4 ° C) und das Pellet in 5 ml 50 mM Tris-Puffer.
4. Beschallen (Cell Disruptor, LA Biosystems) wurden die Zellen bei 40% Einschaltdauer mit einer Leistung Steuerung von 4, halten Sie die Lösung auf Eis für die gesamte Dauer.
5. Zentrifugieren der resultierenden Mischung für 5 Minuten bei 4000 rpm bei 4 & dzB, C, um die Zelltrümmer zu entfernen. Den Überstand in ein frisches Röhrchen.
6. Bestimmen die Gesamtproteinkonzentration der Zellextrakte nach Bradford. Hinweis: Verwenden Sie Glasfläschchen, die Erhöhung der Hintergrund und / oder Verlust des Proteins zu verhindern.
7. Vorbereiten einer Mischung, enthaltend 100 ml 0,1% v / v Alkan und 50 mM Tris-HCl-Puffer.
8. Das Gemisch wird bei 100 ° C für 5 min. Hinweis: Führen Sie diesen Schritt nur für mittel-bis langfristige Alkane mit hohem Siedepunkt. (ZB C _16: 287 ° C).
9. Um eine optimale Löslichkeit des Alkans zu erreichen, für 1 min und noch warm, bis eine homogene, viskose Mischung erhalten beschallen.
10. Hinzufügen 1mM von NADH, 1 mM FMN, 1 mM MgSO ₄ und 0,01 v / v Triton X-100.
11. Bereiten Sie 6 ml Aliquots in 25 ml geschlossener Kappe Kolben.
12. Hinzufügen ausreichender Mengen von Zellextrakt (abhängig von Bradford-Assays, Endkonzentration von 5 mg Protein / l). Bereiten Sie eine nicht-Protein-Kontrolle.
13. Inkubieren bei 60 ° C (für eine optimale Enzymatic Aktivität) für 24 Stunden.
14. Extrahieren der Kohlenwasserstoffe in den Kulturmedien durch Ethylacetat und bestimmen Kohlenwasserstoffkonzentration in Zellkultur durch Gaschromatographie (siehe Protokoll 3).
15. Berechnen den Abbau von Biomasse pro Zeiteinheit durch Teilen der Gesamtmenge des Alkans durch Gesamtprotein umgewandelt hinzugefügt zu jedem Kolben (durch Bradford Eichkurve). Weitere Division durch Versuchsdauer ergibt die Abbauaktivität pro Einheit des zellulären Proteins pro Zeiteinheit. Der Durchschnitt wird aus drei einzelnen Läufe genommen.

4. Ethylacetat Hydrocarbon Extraction und Konzentrationsmessung

1. Alkane werden aus der wässrigen Lösung durch Zugabe von 2,5 ml Ethylacetat (apolaren solvant) bis 6 ml experimentelle Lösung extrahiert. Ein interner Standard wird zum Lösungsmittel in einer Konzentration von 0,1% (v / v) zugegeben. Der Standard (z. B. Cyclo-decan) variiert in Abhängigkeit von der erwarteten Bereich der Spitzen von Interesse.
2. Optional: Add TritonX-100 zu der wässrigen Mischung und Zentrifugieren der Proben für 10 min bei 4.000 UpM, um eine ordnungsgemäße zweiphasige System zu erhalten.
3. Vortex die Mischung für 5 sec (1.500 rpm) und bei Raumtemperatur inkubieren, bis die beiden Phasen getrennt.
4. Entfernen einer maximalen Menge der organischen Schicht (oben) und Trocknen des Lösungsmittels unter Verwendung von wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet.
5. Entfernen MgSO ₄ durch Filtration (0,2 pm) und übertragen das Filtrat in Gaschromatographen Fläschchen für Messungen oder bei -20 ° C.
6. Bestimmen Sie die Konzentration durch Gaschromatographie unter Verwendung einer CP-SIL 5CB Säule (Länge = 5 m). Jeweils 10 ul Probe im Split-Modus (1:10, 230 ° C). Setzen der Säule Gasströmung auf 1 ml / min (Helium). Im folgenden Ofentemperatur Programm wird verwendet:

   Rate	Temperatur [° C]	Zeit [min]
   0	50	7,5
   50	90	1,0
   50	110	2,0
   50	130	2,0
   50	145	2,0
   50	160	2,0
   50	170	2,0
   50	185	2,0
   50	210	2,0
   50	250	2,0
   50	320	2,0

7. Integrieren Gipfeln und korrigieren die Konzentrationen gegenüber dem internen Standard.

5. Alkohol / Aldehyd-Dehydrogenase-Aktivitäts-Assay

Dieser Assay wurde im Wesentlichen nach der Methode von Kato et al beschriebenen Verfahren durchgeführt.(2010).

1. Kultur E. coli Zellen, die das ADH ( BBa_K398018 ) oder ALDH ( BBa_K398030 )-Gen und Zellen, die einen leeren Vektor ( BBa_J13002 ) in 50 ml LB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika über Nacht.
2. Übertragen 500 ul der Übernachtkultur in 50 ml frisches LB (mit Antibiotikum) und inkubieren, bis die Zelle Trübung erreicht eine optische Dichte von 0,6 bei 600 nm.
3. Zentrifuge 10 min bei 4000 rpm bei 4 ° C und das Pellet in 5 ml 50 mM Tris-Puffer.
4. Beschallen die Zelle bei 40% Einschaltdauer mit einer Leistung Kontrolle 4 (halten Sie die Lösung auf Eis während der Ultraschallbehandlung).
5. Zentrifugieren der resultierenden Mischung für 5 Minuten bei 4000 rpm bei 4 ° C, um Zelltrümmer zu entfernen.
6. Bestimmen Sie die zutal Proteinkonzentration der Zellextrakte nach Bradford (Hinweis: Verwenden Sie ein Glasfläschchen, um Protein-Bindung zu verhindern).
7. Legen Sie eine 96-Well-Platte mit 180 ul 57 mM Glycin-Puffer, der NAD (Endkonzentration 1 mM, pH 9,5) in jedes Well.
8. Hinzufügen 5 ul des Alkohols (Aldehyd), um in die Vertiefungen getestet werden. Anmerkung: Wärme langkettige Alkohole vor Beginn des Assays, um eine Flüssigkeit haben. Für jede Alkohol (Aldehyd) eine Kontrolle ohne Substrat sollte hinzugefügt (negative Kontrolle) werden. Zusätzlich wird eine Blindlösung, die eine Mischung aus Puffer und dem Substrat ohne Zellextrakt.
9. Vorheizen Platte des Plattenlesers (Tecan Magellan v7.0) für 15 min bei 37 ° C bis Äquilibrierung des Systems zu ermöglichen.
10. Hinzufügen ausreichender Mengen von Zellextrakt (abhängig von Bradford-Assays, Endkonzentration von 5 mg Protein / l). Bereiten Sie eine nicht-Protein-Kontrolle.
11. Messung der NADH-Produktion mit einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 340 nm alle 2-3 Min. für 1 Stunde bei 37 ° C
12. Berechnen den NADH-Produktionsrate von der Steigung der OD (340 nm). Berücksichtigen Sie das Licht Weglänge und des Extinktionskoeffizienten von NADH von 6220 M ^-1 cm ^-1. Unterteilen den NADH-Produktionsrate von der Gesamtmenge an Protein hinzugefügt, um die Aktivität des Dehydrogenaseumsetzung im Zellextrakt (U / mg gesamten Zellproteins) exprimieren. Berechnen des Mittelwertes und der Standardabweichung aus drei unabhängigen Läufen.

6. pCaiF Charakterisierung

1. Kultur E. coli Zellen, die das Konstrukt pCaiF-GFP ( BBa_K398331 ) und Zellen, die den Promotor alleine ( BBa_K398326 ) über Nacht in 5 ml LB-Medium über Nacht die entsprechenden Antibiotika.
2. Beimpfen 5 ml M9 mit 10 g / l Glukose und Antibiotika mit 50 ul der Übernachtkultur und wachsen über Nacht.
3. Subkultur 50 ul der Übernacht-Auswuchs in 5 ml frisches M9 mit 10 g / l und inkubieren, bis die Zelle Trübung erreicht eine optische Dichte von 0,2 bei 600 nm aufweist.
4. Laden einer Platte mit 96 Vertiefungen mit 100 ml frisches M9-Medium, das die gewünschte Menge an Kohlenstoffquelle zum Prüfen in jeder Vertiefung. Führen Dreifachversuche der statistischen Auswertung und fügen Sie die entsprechenden negativen Kontrollen (Wildtyp E. coli K12).
5. Fügen Sie 5 ul der Übernachtkultur den Medium mit Brunnen.
6. Messung der Wachstumskurve (OD ₆₀₀₎ und GFP-Fluoreszenz (485 nm Anregung und 520 Emission) unter Verwendung eines Plattenlesegeräts alle 10 min für 18 Stunden bei 37 ° C unter konstantem Schütteln inkubiert.
7. Berechnen Sie die Wachstumsrate und die spezifische GFP Inhalte aus den jeweiligen Messungen und vergleichen Sie die Kontrolle. Berechnen des Mittelwertes und der Standardabweichung von mindestens drei unabhängigen Experimenten.

7. Toleranz Assay

1. KulturE. coli, PhPFDα und β-Gen ( BBa_K398406 ) über Nacht in 5 ml LB-Medium und den entsprechenden Antibiotika. E. coli exprimierenden Lada Gen ( BBa_K398017 ) als negative Kontrolle verwendet.
2. Subkultur 10 ul der Übernacht-Auswuchs in frisches 5 ml LB (mit Antibiotikum) und inkubieren, bis die Zelle Trübung erreicht eine optische Dichte von 0,3 bis 0,4 bei 600 nm aufweist.
3. Verdünnen Sie die Kulturen mit frischem Medium, bis eine OD ₆₀₀ von 0,1 erreicht ist.
4. Laden einer Platte mit 96 Vertiefungen mit 180 ul M9 Medium mit den entsprechenden Antibiotika und die korrekte Endkonzentration der toxischen Verbindung (zB 0, 4, 8, 10% n-Hexan) in dreifacher Ausfertigung. Weil Alkan-Wasser-Gemischen zu zweiphasigen Systemen führen können ist es notwendig, geeignete Bedienelemente auf der Platte haben (zB dUNTERSCHIEDLICHE Stämme und die jeweiligen leere Experimente).
5. Fügen Sie 20 ul der Kultur (Kontrolle) in die Vertiefungen.
6. Messung der Biomassekonzentration (OD ₆₀₀₎ unter Verwendung eines Plattenlesegeräts alle 10 min für 24 Stunden bei 37 ° C unter konstantem Schütteln inkubiert.
7. Berechnen Sie die Wachstumsraten aus den jeweiligen Messungen für die verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen und im Vergleich zu der negativen Kontrolle. Berechnen des Mittelwertes und der Standardabweichung von mindestens drei unabhängigen Läufen.

8. Homolog Interaction Mapping

1. Die Anwendung HIM wurde entwickelt, um Protein-Abfragen auf einer PostgreSQL-Server mit dem STRING-Datenbank (kostenlos für den akademischen Gebrauch) ²⁰ durchzuführen. Das Homologe Interaktion Mapping-Anwendung identifiziert interagierende Proteine ​​in der ursprünglichen Wirtsorganismus mit dem STRING-Datenbank. Die Sequenzen der entsprechenden Gene sind in Wechselwirkung einer BLAST-Suche, um homologe Gene in den Zielorganismus finden verwendet. Cytoscape ⁴ verwendet wird, um das Ergebnis der Zuordnung zu visualisieren. : Die HIM-Software-Tool kann unter folgender Adresse heruntergeladen werden https://github.com/jcnossen/InteractionHomologMapping.
2. Um eine Zuordnung durchführen, (1) geben Sie die BioBrick ID und die Anwendung wird automatisch die Teilsequenz Daten aus der Registry von Standard Biological Parts ⁹ oder (2) Geben (Paste) der Sequenzdaten in der Anwendung.
3. Verwenden Sie den STRING Database Website, um die String-Protein-ID für die eingegebenen Aminosäuresequenz zu finden.
4. Ein Protein mit hoher Homologie wird unter Verwendung BLAST. Anschließend wird die Anwendung listet jeden bekannten interagierende Protein in der Quelle Organismus und sucht nach Homologen im Wirtsorganismus (zB E. coli).
5. Export resultierenden vermeintlichen Interaktion Liste Text oder Cytoscape.

Ergebnisse

Alkan-Umwandlung

Die Aktivität der drei Oxidationsschritte vom Alkan zur jeweiligen Fettsäure wurde mit Hilfe von Ruhezell-Assays und Enzymaktivitätsmessungen bewertet. Die Ergebnisse werden nach den Signalwegreaktionen (1) Alkanhydroxylase, (2) Alkoholdehydrogenase und (3) Aldehyddehydrogenase dargestellt.
Für den ersten Schritt wurden verschiedene Plasmide für mittel- und langkettige Alkane konstruiert. Das Plasmid BBa_K39...

Diskussion

Die BioBrick Prinzip wird ein Fahrwerk für den Abbau von Alkanen zu konstruieren und einen Beweis des Prinzips für die einzelnen Komponenten des Toolkits wurde erhalten. Mehrere Tests werden vorgeschlagen, um die in vivo und in-vitro-Aktivität von Alkan abbauenden Stoffwechselenzyme messen. Die vorliegende Arbeit demonstriert erfolgreich eine Reihe von Methoden, die verwendet werden, um Enzymaktivitäten und Ausdruck in der Wirtsorganismus E. bestimmt werden kann coli nach der Implemen...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
E. coli K12	New England Biolabs	C2523H
Octane	Fluka	74822
Hexadecan	Fluka	52209
Octanol-1 Fluka		95446
Dodecanol-1	Sigma-Aldrich	126799
Hexan	Sigma-Aldrich	296090
NADH	Sigma-Aldrich	N4505
FMN	Sigma-Aldrich	F2253
MgSO4	J.T. Baker Casno	7487 889
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
T4 Ligase	New England Biolabs	M0202L
Gaschromatograph
Zelldisruptor	LA Biosystems	CD-019
Spektralphotometer	Amersham pharmacia	spec 2000
Plattenleser	Tecan Group Ltd.	Magellan v7.0
Inkubator	Innova, 44
BioBrickTM K398014: BBa_J23100-BBa_J61100-alkB2-BBa_J61100-rubA3-BBa_J61100-rubA4- BBa_J61100-rubBTechnische	Universität Delft in der Abteilung für Biotechnologie oder Register für biologische Standardteile	BBa_K398014	Alkan-Hydroxylase-System Beständigkeit: Chloramphenicol
BioBrickTM K398027: BBa_R0040-BBa_B0034-ladA	Technische Universität Delft am Institut für Biotechnologie oder Register biologischer Standardteile	BBa_K398027	ladA Protein Generator Beständigkeit: Chloramphenicol
BioBrickTM K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-ADH	Technische Universität Delft am Institut für Biotechnologie oder Register für biologische Standardteile	BBa_K398018	ADH generator Beständigkeit: Chloramphenicol
BioBrickTM K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-ALDH	Technische Universität Delft am Institut für Biotechnologie oder Register für biologische Standardteile	BBa_K398030	ALDH generator Beständigkeit: Chloramphenicol
BioBrickTM K398326: pCaiF	Technische Universität Delft am Institut für Biotechnologie oder Register biologischer Normteile	BBa_K398326	pCaiF Promotor Beständigkeit: Chloramphenicol
BioBrickTM K398331: pCaiF-BBa_B0032-BBa_I13401	Technische Universität Delft in der Abteilung für Biotechnologie oder Register biologischer Normteile	BBa_K398331	pCaiF Messgerät Beständigkeit: Chloramphenicol
BioBrickTM K398406: BBa_J23002-BBa_J61107-phPFDα -BBa_J61107-	Technische Universität Delft am Institut für Biotechnologie oder Register biologischer Normteile	BBa_K398406	Solvent tolerance cluster Beständigkeit: Chloramphenicol