Um Zygoten zu reinigen S. cerevisiae Wurden haploiden Zellen der entgegengesetzten Paarungstyp ausgeführt, um rot oder grün fluoreszierende Proteine, Co-inkubierten um Zygote Formation ermöglichen, und fraktioniert über eine Durchflusszytometrie-basiertes Protokoll auszudrücken. Das hoch angereicherte Fraktion ermöglicht anschließenden "-schaftlichen" Studien, die Verwertung von ersten Nachkommen, und systematische Untersuchung der Zygote Morphogenese.
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Methodenartikel
Durchflusszytometrie-basierte Reinigung von
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Zygoten sind wesentliche Zwischenprodukte zwischen haploiden und diploiden Zustände im Lebenszyklus vieler Organismen, einschließlich Hefe (Abbildung 1) 1. S. cerevisiae Zygoten resultieren aus der Fusion von haploiden Zellen unterschiedlicher Paarungstyp (MATa, MATalpha) und führen zu entsprechenden stabilen Diploide erzeugen, die nacheinander so viele wie 20 diploiden Nachkommen als ein Ergebnis ihrer asymmetrischen auffallend mitotische Teilungen 2. Zygote Bildung wird durch eine komplexe Abfolge von Ereignissen orchestriert: In diesem Prozess binden lösliche Paarungsfaktoren an Rezeptoren verwandt, Auslösung Rezeptor-vermittelten Signalkaskaden, die Unterbrechung des Zellzyklus und gipfeln erleichtern Zell-Zell-Fusion. Zygoten kann als ein Modell für die Vorläufer-oder Stammzellen-Funktion sein.
Obwohl viel über die Bildung von Zygoten gelernt und obwohl Zygoten wurden verwendet, um Zellen molekulare Fragen von allgemeinem signif untersuchenicance fast alle Studien haben den Einsatz der Paarung Mischungen, in denen Zygoten mit einer Mehrheit der Bevölkerung von haploiden Zellen 3-8 vermischt sind. Viele Aspekte der Biochemie der Zygote Bildung und der anhaltenden Lebens der Zygote bleiben daher unerforscht.
Berichte der Reinigung von Hefe Zygoten beschreiben Protokolle auf ihren Sedimentationseigenschaften 9 basiert, aber diese Sedimentation-basierten Verfahren nicht erzielen fast 90% Reinheit in unseren Händen. Darüber hinaus hat es den Nachteil, dass Zellen auf Sorbit hypertonischen freiliegen. Wir haben daher eine vielseitige Reinigungsverfahren entwickelt. Zu diesem Zweck waren Paare von haploiden Zellen, rot oder grün fluoreszierende Proteine coinkubiert um Zygote Formation, zu verschiedenen Zeiten geerntet und die resultierenden Zygoten wurden unter Verwendung eines auf Basis der Durchflusszytometrie Sortier-Protokoll zu ermöglichen. Diese Technik bietet eine bequeme visuelle Beurteilung der Reinheit und Reifung. Die durchschnittliche Reinheitder Fraktion beträgt ca. 90%. Gemäß der Zeitsteuerung der Ernte können Zygoten unterschiedlicher Reifegrade rückgewonnen werden. Die gereinigten Proben bieten eine bequeme Ausgangspunkt für "-schaftlichen" Studien, für die Wiederherstellung der ursprünglichen Nachkommen und für eine systematische Untersuchung dieser Progenitorzellen.
Protokoll
Ein. Haploid Cell Growth
- Wachsen S. cerevisiae-Zellen aus dem S288C Hintergrund (BY4741) unter Standardbedingungen 10.
- Transform Haploiden entweder Ausdruck von zwei auffälligen Fluoreszenzmarker 10. Die Markierungen der Wahl sind lösliche GFP im Zytoplasma exprimiert (pEG220, URA3/YIp, linearisiert mit BglII 11) und eine einzige ribosomalen Protein, RPL25 mit mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, aus A. Johnston) fusioniert. Wir erwarten, dass gleich zwei-color Aufreinigungsprotokolle konnte Verwendung anderer hell fluoreszierende Proteine, die von den haploiden parentalen Zellen synthetisiert werden können. Alter....
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Diskussion
Die Verfügbarkeit von gereinigtem Zygoten sollten biochemische Untersuchungen einschließlich Transkriptom, Proteom und Lipidomics sowie Untersuchung der Mechanismen, durch die Zygoten unterziehen Zellzyklus re-entry, Zellwand Umbau, angehende und Vererbung Eigenschaften, etc. Alternativ zu erleichtern, könnte Zygoten die ausgehend werden mit Stämmen, die charakteristische Mutationen in einem oder beiden Elternteilen. Darüber hinaus können die gereinigten Zygoten, wie für haploide oder diploide Zellen, können in Medium, .......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Wir danken Dr. R. Michael Sramkoski für die Hilfe bei der Durchflusszytometrie, Dr. Purnima Jaiswal und Dr. Di Wu für frühere Eingang und Ilya Aylyarov Hilfe zu den Illustrationen. Unterstützt durch NIH Grant R01GM089872 und Cytometry & Imaging Microscopy Core Facility des Case Comprehensive Cancer Center (P30 CA43703).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Reagenz / Equipment | Quelle | Katalog-Nummer | |
| pEG220, URA3/YIp, kodierend cytoplasmatischen GFP 11) | E. Grote | ||
| pAJ1661, URA3/CEN, Kodierung RPL25 fusioniert mCherry | A. Johnston | ||
| Fisher FB120 Sonicator | Fisher Scientific | ||
| Polypropylenröhrchen mit Sieb cap | BD Falcon | Ref 352235 | |
| Gekühlte Mikrozentrifuge | Tomy | MRX-150 | |
| Durchflusszytometrie Abtrennlösung | Biosure | 1027 | |
| ICYT Reflection Modell Durchflusszytometer | Sony | ||
| DeltaVision Dekonvolution Mikroskop | Applied Precision | ||
| Upright Epifluoreszenzmikroskop | Leica | ||
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-07 | |
| CSM Glukose Formulierung Hinweise: Für Agarplatten, einfach zählen 2% Agar (Difco) | 10 |
Referenzen
- Herskowitz, I., Oshima, Y. Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , Cold Spring Harbor Press. 181-210 (1981).
- Muller, I. Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae. Antonie Van ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
