Differenziert Functional Roles of Gene Expression von Immun-und Nicht-Immunzellen in Mouse Colitis von Bone Marrow Transplantation

Zusammenfassung

Knochenmarktransplantation bietet eine Möglichkeit, um den Genotyp der Knochenmark stammende Zellen zu ändern. Wenn das Gen von Interesse an beiden Knochenmark stammende Zellen und nicht-Knochenmark stammende Zellen exprimiert wird, kann die Knochenmarktransplantation Knochenmark stammende Zellen zu einem anderen Genotyp ändern, ohne die nicht-Knochenmark stammende Zellen Genotyp.

Zusammenfassung

Um die Rolle von einem Gen in der Entwicklung einer Kolitis verstehen, verglichen wir die Antworten von Wildtyp-Mäusen und Gen-von-Interesse-defizienten Knockout-Mäuse zu ulcerosa. Wenn die Gen-von-Interesse in beiden Knochenmark stammende Zellen und nicht-Knochenmark stammende Zellen des Wirts exprimiert wird, jedoch ist es möglich, die Rolle eines Gens von Interesse in Knochenmark stammende Zellen und nicht-Knochenmark differenzieren abgeleiteten Zellen durch Knochenmarktransplantation Technik. Um das Knochenmark stammende Zellen Genotyps von Mäusen zu verändern, wurden die ursprünglichen Knochenmark des Empfängers Mäusen durch Bestrahlung zerstört und dann durch neue Spender-Knochenmark verschiedener Genotypen ersetzt. Wenn Wildtyp-Mäusen Spender-Knochenmark, um Knockout-Mäuse transplantiert wurde, konnten wir erzeugen knockout Mäuse mit Wildtyp-Gen-Expression in Knochenmark stammende Zellen. Alternativ wurde bei Knockout-Mäusen Spender-Knochenmark zu Wildtyp-Empfängermäuse, Wildtyp-Mäusen ohne Gen-of-interest Ausdruck transplantiertaus Knochenmark stammenden Zellen produziert wurden. Allerdings kann eine Knochenmarktransplantation nicht 100% abgeschlossen. Daher verwendeten wir cluster of differentiation (CD) Moleküle (CD45.1 und CD45.2) als Marker von Spender und Empfänger-Zellen, den Anteil der Spender-Knochenmark-abgeleiteten Zellen in Empfängermäuse und der Erfolg der Knochenmarktransplantation verfolgen. Wildtyp-Mäuse mit CD45.1 Genotyp und Knockout-Mäusen mit CD45.2 Genotyps verwendet wurden. Nach der Bestrahlung des Empfängers Mäusen wurden die Donor Knochenmarkzellen von unterschiedlichen Genotypen in die Empfänger-Mäuse infundiert. Wenn der neue Knochenmark zu übernehmen ihre Immunität regeneriert wurden die Mäuse durch chemische Mittel (Dextran Natriumsulfat, 5% DSS) herausgefordert, Kolitis zu induzieren. Hier zeigten auch die Methode ulcerosa in Mäusen zu induzieren und zu bewerten, die Rolle des Gens von Interesse aus dem Knochenmark stammenden Zellen exprimiert. Wenn die Gen-von-Interesse aus den Knochen abgeleiteten Zellen spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der Erkrankung (z. B. colitis) kann der Phänotyp der Empfängermäuse mit Knochenmarktransplantation signifikant verändert werden. Am Ende der Colitis Experimenten abgeleitete das Knochenmark Zellen in Blut und Knochenmark mit Antikörper wurden gegen CD45.1 und CD45.2 bezeichnet und deren Mengenverhältnis der Existenz könnte verwendet werden, um den Erfolg der Knochenmarktransplantation mittels Durchflusszytometrie ausgewertet werden. Erfolgreiche Knochenmarktransplantation sollte eine überwiegende Mehrheit der Donorgenotyp (in der Bezeichnung des CD-Molekül Marker) über Empfänger Genotyp sowohl im Knochenmark und Blut des Empfängers Mäusen.

Protokoll

Ein. Before-you-Start Technische Überlegungen

1. Wir empfehlen die Verwendung sowohl C57/BL6 Wildtyp-Mäusen und-Knockout-Mäusen für das Experiment, weil Mäuse mit entsprechenden CD-Moleküle von den großen Maus-Anbieter erworben werden kann.
2. Da es schwierig ist, die Wildtyp-Mäusen und Knockout-Mäusen gewonnen Spenderzellen nach Knochenmarktransplantation zu verfolgen, ist es notwendig, CD45.1 Mäuse verwenden, um Wildtyp-Mäusen darstellen. (CD45.1 C57/SJL WT Mäusen Jackson Laboratories stock # 002014).
3. Die meisten Mauskolonien sind CD45.2. Unsere Knockout-Mäuse gehören CD45.2 Genotyp (alternativ ein CD45.2 WT Mäusen Quelle: Jackson Laboratories stock # 000664). Die Bestimmung der CD45.1 oder CD45.2 Genotyp kann mit Durchflusszytometrie von Knochenmark und peripheren Blut, wie in Abschnitt 7 in diesem Protokoll erwähnt werden.
4. Mäuse nach der Bestrahlung wurden Immunität beeinträchtigt. Halten Mäuse in pathogenfreien Einrichtung.
5. Betrieb der Strahler erfordert besondere Sicherheit clearance und Ausbildung. Um Zeit im Training und Genehmigungsprozesse zu sparen, ist es am besten mit einem Labor mit qualifizierten Techniker in der Lage, um die Strahler bedienen ist zusammenzuarbeiten.
6. Viele Institutionen haben Durchflusszytometrie Labors mit erfahrenen Technikern. Um Probleme mit der Durchflusszytometrie zu minimieren, ist es besser, Ihre Durchflusszytometrie Experiment Plan mit dem erfahrenen Techniker besprechen, bevor Sie beginnen.
7. Mäuse wurden auf diese Weise (10 Mäuse pro Gruppe) zugeordnet:

Gruppe		Knochenmark Spender zum Empfänger	Behandlung
A	BM Austausch	CD45.1 WT CD45.2 KO	DSS Kolitis
B			Wasser normalen Kontrolle
C	BM Austausch	CD45.2 KO CD45.1 WT	DSS ulcerosa
D			Wasser normalen Kontrolle
E	Schein	CD45.1 WT CD45.1 WT	DSS Kolitis
F			Wasser normalen Kontrolle
G	Schein	CD45.2 KO CD45.2 KO	DSS Kolitis
H			Wasser normalen Kontrolle

* Eine kurze Darstellung Versuchsprotokoll ist in Abbildung 1 gezeigt.

2. Empfängermäuse Bestrahlung

1. Mäuse gezüchtet und gehalten Erreger-einrichtung. Ort Mäuse in autoklavierten Bestrahlung pie mit Filter. Legen Sie eine Maus in jedem Steckplatz der Bestrahlung pie. Setzen Sie den Kuchen in den Strahler und vergewissern Sie sich die Drehscheibe und Kuchen drehen.
2. Schalten Sie die Luftpumpefür die Belüftung. Schließen Sie den Strahler Tür und verriegeln Sie ihn.
3. Bestrahlen der Mäuse mit 1000 rad (was äquivalent zu 10 Gy) etwa 10 min (je nach Strahlungsquelle und Halbwertszeit). Von diesem Zeitpunkt sind die bestrahlten Mäusen immunschwache und schwach Immunität gegen Infektion. Nach der Bestrahlung, nehmen Sie den Kuchen aus und legen Sie in einem sterilen Behälter für den Transport zum Biosicherheitswerkbank in Tierhaltung. Vermeiden Sie es, die Mäuse zu externen Umfeld Wahrscheinlichkeit einer Infektion zu minimieren.
4. In Biosicherheitswerkbank, übertragen Sie die Mäuse in autoklavierten Mäusekäfige mit autoklaviertem Betten (4 Mäuse pro Käfig Neuen steriles Wasser mit sulfatrim Federung -. 3,12 ml pro 100 ml Wasser).
5. Wickeln Sie die Wasserflasche mit Aluminiumfolie als die Antibiotika lichtempfindlich sind. Schütteln Sie die sulfatrim Flasche mit gut mischen, bevor Sie ihn in den Käfig.

3. Spender-Knochenmark Extraction

1. Opfern Mäusen mit Kohlendioxid oder isoflurANCE und dann eintauchen in 1:200 Lysol Lösung. Sprühen Sie die Mäuse mit 70% Ethanol, um die Haut befeuchten und zu sezieren offenen Knochen.
2. Weichen Sie die Dissektion Instrumente in 70% Ethanol für die Sterilisation.
3. Führen Sie die Dissektion in einer biologischen Sicherheitswerkbank. Verwenden Sie die sterile Präparation Instrumente, um die Humerus, Femur, Tibia und Fibula Knochen, frei von Befestigung Muskeln und Bänder aussetzen.
4. Schneiden Sie beide Enden der Knochen, die rote Knochenmark zeigen. Halten die Knochen mit einer Pinzette. Spülen Sie das rote Knochenmark mit kaltem PBS mit 3 ml Spritze und 25G Nadeln in eine Petrischale. Spülen von beiden Enden der Knochen mehr Knochenmarkszellen ergeben.
5. Verwenden Sie 6 ml Spritzen und 18G1 / 2 Nadeln rotes Knochenmark Stecker durch wiederholtes Aufsaugen und brechen. Übertragen Knochenmark mit 50 ml Falcon-Röhrchen.
6. Drehen Sie das Knochenmark in 1.800 rpm für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen, Pellet resuspendieren durch Vortexen für 5-10 sec.
7. Verdünnte 10X RBC Lysepuffer mit sterilem Wasser. Anzeiged 1X RBC-Lyse-Puffer (5 ml pro Donor-Maus), Wirbel wieder für 5 sec und halten genau 3 min bei Raumtemperatur.
8. Nach 3 min, füllen Sie die Röhrchen mit 20 ml kaltem PBS, um die Lyse und mischen zu stoppen. Gießen Sie den Inhalt durch ein 40 um Zellsieb direkt in ein neues 50 ml-Falcon-Röhrchen.
9. Spülen Sie die Original-Röhren mit 5 ml PBS und Transfer zum Zellsieb als gut. Anfang bis zu 50 ml mit PBS und mischen.

4. Zählen Bone Marrow Donor Cells

1. Fügen Sie 100 ul Trypanblau in ein Eppendorf-Röhrchen und 100 ul des Knochenmarks Suspension auf einem Eppendorf-Röhrchen und mischen. Pipettieren Sie die gefärbte Zelle Mischung auf eine Zählkammer.
2. Die Menge der Zellen wird durch Gesamtwohnfläche Knochenmark Zellzahl im Falconröhrchen = ungefärbten Zellzahl in 16 Quadrate x 2 (aufgrund Trypanblau Verdünnung) x 10.000 x 50 ml berechnet
3. Abzentrifugieren der Knochenmarkzellen in 50 ml Falcon-Röhrchen bei 2.000 UpM für 5 min bei 4 ° C.
4. Entfernen Sie den Überstand. Basierendauf die gesamten Zellzahlen, das Pellet mit PBS auf 1 x 10 ⁸ Zellen pro ml

5. Infusion Empfängermäuse

1. Wärmen Sie die Empfänger-Mäuse auf einem Heizkissen und unter einer Wärmelampe. Legen Sie die Empfänger-Mäuse in restrainer. Jeweils 1 x 10 ⁷ Zellen pro Maus in 100-200 ul intravenös.
2. Die Injektion von Spender-Knochenmark muss zwischen 4-24 Stunden nach der Bestrahlung durchgeführt werden.
3. Halten Sie sich auf 4 injizierten Mäusen pro Käfig. Pflegen Sie die injiziert Empfängermäuse in autoklavierten Käfige mit Antibiotika behandelte Wasser für die ersten 4 Wochen in pathogenfreien Tierhaltung und ließ die Mäuse wieder Immunität. Veränderung Käfigen, Antibiotika-behandelten Wasser und Nahrung alle 4 Tage auf Hygiene zu halten.

6. Induktion von Colitis und Evaluierung von Colitis

1. 4 Wochen nach der Bestrahlung und Knochenmarktransplantation, regelmäßig Wasser zu wechseln, ohne Antibiotika und halten die Mäuse für weitere 2 Wochen zu ihrer normalen zurückgewinnenDarmflora.
2. 6 Wochen nach der Knochenmark-Injektion zu messen ursprünglichen Körpergewichts. Einige Mäuse sind 5% Dextransulfat im Trinkwasser ad libitum zu Colitis induziert gegeben. Einige Mäuse werden regelmäßig Trinkwasser nur als normale Kontrollgruppe gegeben.
3. 5 Tage später, zurückzutreten peripheren Blut, Transfer zum Heparin-beschichteten Röhrchen (Vacutainer) und halten im Eis. Pool das Blut aus 4 Mäusen 1 Tube. Kombinieren Sie 300 ul Blut mit 300 ul Zellfärbung buffer = 600 ul. Teilen Sie das Blut bis 5 Eppendorf-Röhrchen mit jeweils 100 ul.
4. Opfern die Mäuse mit Kohlendioxid oder Isofluran. Bewerten makroskopischen Schäden Noten (siehe anderen JOVE Video Veröffentlichung für Details ^1). Messen Veränderung des Körpergewichts. Measure Darm Länge und Dicke mit digitalen Messschieber. Beachten Hocker Textur (hart, weich oder blutig). Bestimmen Sie auf okkultes Blut im Stuhl mit Hemooccult. Dissect Doppelpunkt Gewebe und fixieren Formalin für H & E-Färbung.
5. Dissect 1 Femur bone pro Maus, extrahieren Knochenmark und spülen das Knochenmark mit kaltem PBS über 25G Nadel und 1 ml Spritze. Pool 4 Knochenmark-Stecker an ein Rohr und halten im Eis.
6. Gießen Sie das Knochenmark zur Petrischale, Scher das Knochenmark Stecker mit 18G Nadel und 5 ml Spritze mehrmals, bis kein Knochenmark-Stecker vorhanden ist.
7. Spin down mit 1.500 rpm für 5 min bei 4 ° C. Überstand entfernen und resuspendieren mit 600 ul Zellfärbung Puffer. Teilen Sie die resuspendierten Knochenmark 5 Eppendorf-Röhrchen mit jeweils 100 ul.

7. Quality Inspection of Bone Marrow Transplantation mittels Durchflusszytometrie

1. Beschriften Sie jedes Probenröhrchen von Blut oder Knochenmark # 1-5:
2. Vorbereiten der Antikörpermischung für jede jeweilige Rohr in der Dunkelheit.

Nr. 1 Kein Antikörper
# 2 30 ul FITC Isotypenkontrolle + 30 ul PE Isotypenkontrolle + 15 ul CD16/32 Blockierung
# 3 30 ul FITC CD45.1 Ab + 15 ul CD16/32 Blockierung
# 4 30 ul PECD45.2 Ab + 15 ul CD16/32 Blockierung
# 5 30 ul FITC CD45.1 Ab + 30 ul PE CD45.2 Ab + 15 ul CD16/32 Blockierung

Fügen Sie nichts zu Blut oder Knochenmark Probe Nr. 1

Add 5 ul Antikörper Mischung Nr. 2 zu jedem Blut oder Knochenmark Probe # 2

Add 3 ul Antikörper Mischung # 3 zu jedem Blut oder Knochenmark Probe # 3

Add 3 ul Antikörper Mischung # 4 zu jedem Blut oder Knochenmark Probe # 4

Add 5 ul Antikörper Mischung Nr. 5 zu jedem Blut oder Knochenmark Probe # 5

3. Halten Sie im Dunkeln in Eis für 30 min.
4. 2 ml 1X RBC Lysepuffer in jedes Röhrchen. Halten Sie im Dunkeln auf Eis für 15 min.
5. Abzentrifugieren der Zellen bei 1500 rpm, 5 min bei 4 ° C. (GH 3,8 Rotor, 1.500 rpm = 350 xg) Überstand entfernen. Das Pellet mit 500 ul Zell-Färbepuffer bei Dunkelheit, dann Wirbel kurzzeitig.
6. Überprüfen Sie die CD45.1 (entspricht WT) und CD45.2 (die KO) in der immungefärbten Blut und Knochenmark-Proben mittels Durchflusszytometrie. Wählen FITC zu WT CD45.1 und PE darstellen KO CD45.2 darstellen.
7. Analysieren Sie die Durchflusszytometrie Ergebnisse FlowJo Software. Berechnen Sie das Verhältnis von FITC: PE-Verhältnis oder PE: FITC-Verhältnis zu ermitteln, ob Donorgenotyp dominanten Genotypen in Blut und Knochenmark.

Ergebnisse

Wenn das Gen-of-Interest spielt eine bedeutende Rolle in Immunzellen bei der Entwicklung ulcerosa, Empfangen die Mäuse Knochenmark von unterschiedlichen Genotyp durch Knochenmarktransplantation (WT KO oder KO zu WT) sollte eine veränderte Reaktion auf DSS Kolitis. Einer der wichtigsten Parameter zur Bestimmung der Schwere von ulcerosa ist die H & E-Färbung der Colon-Geweben. Colongewebe Struktur ändert und Entzündungszeichen kann quantitativ durch H & E Histologie Scoring-System ausgewertet werden. Kriterien für...

Diskussion

Diese Knochenmarktransplantation Ansatz ist geeignet für immunologische Forschung von Colitis, Infektionen, Krebs, Fettleibigkeit und andere Krankheiten. Dieses Experiment Knochenmarktransplantation ist erforderlich, wenn das Gen-von-Interesse in beiden Knochenmark stammen und nicht-Knochenmark stammende Zellen und das Gen-von-Interesse vermutet wird, um Krankheiten durch Zellen aus entweder Population vermitteln exprimiert wird. Zum Beispiel wird gezeigt, antimikrobiellen Peptids Cathelizidin zu modulieren akute Koliti...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer
Zelle Färbepuffer	BioLegend	# 420201
10X RBC Lysispuffer	BioLegend	# 420301
FITC Maus Isotyp-Kontrolle	BioLegend	# 400207
PE Maus Isotyp-Kontrolle	BioLegend	# 400211
PE-anti-Maus CD45.2	BioLegend	# 109807
FITC-Anti-Maus CD45.1	BioLegend	# 110705
Anti-Maus-CD16/32 blockieren	BioLegend	# 101301
40 um Zellsieb	Fisherbrand	# 22363547
PBS 1X	MP Biomedicals	# 1860454
Heparin	Fisherbrand	# BP2425
Sulfatrim (SMZ)	Qualitest	NC9242720 (Fischer)
Lysol IC	Andwin Scientific	NC9745686 (Fischer)
Vaccutainer	BD	# 8000813
Maus restrainer	Braintree Scientific	# TV-150
Irradiator	JL Shepherd and Associates	Mark I 68A
Durchflusszytometer	BD	BD FACSCanto II
Durchflusszytometer Reagenzglas	Falke	# 352052
Digitaler Messschieber	Fisherbrand	14-648-17
Hemoccult ICT	Beckman Coulter	G0328QW