Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

A Novel Surgical Ansatz intratracheale Verabreichung von Wirkstoffen in einem Fetal Mouse Model

16.2K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/4219

⸱

31. Oktober 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Virology and Gene Therapy, KU Leuven, 2Department of Woman and Child, KU Leuven, 3Neurobiology and Gene Therapy, KU Leuven, 4Division of Nuclear Medicine, KU Leuven, 5Biomedical NMR Unit/ MoSAIC, KU Leuven

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir entwickelten eine neuartige chirurgische Ansatz für intratracheale Verabreichung von Wirkstoffen in die Maus Fötus. Die Transportroute ist effizienter bei der Ausrichtung der fetalen Mauslungen als der üblicherweise verwendete intra-Fruchtwasser Injektion. Dieses Verfahren hat sich nicht in einem Mausmodell wurden bisher beschrieben.

Zusammenfassung

Pränatalen pulmonalen Verabreichung von Zellen, Gene oder pharmakologische Mittel könnte die Grundlage für neue therapeutische Strategien für eine Vielzahl von genetischen und erworbenen Erkrankungen. Abgesehen von angeborenen oder ererbten Abnormalitäten mit der Anforderung für eine langfristige Expression des Gens geliefert, mehrere nicht-ererbte Kindstod, wo kurzfristige Genexpression oder pharmakologische Intervention ist ausreichend, um therapeutische Wirkungen zu erzielen, werden als potentielle zukünftigen Indikationen für diese berücksichtigt Ein solcher Ansatz. Kandidaten Krankheiten, für die Anwendung von kurzfristigen frühe Behandlung konnte die transiente neonatalen Mangel an Surfactant Protein B Bewirken Atemnotsyndroms bei Neugeborenen oder 1,2 hyperoxischen Verletzungen des neonatalen Lunge 3 sein. Candidate Krankheiten, für dauerhafte therapeutische Korrektur sind Cystic Fibrosis (CF) 4, genetische Varianten von Tensid Defizite 5 und α1-Antitrypsin-Mangel 6. <p class = "jove_content"> Im Allgemeinen ist ein wichtiger Vorteil der pränatalen Gentherapie die Fähigkeit zur therapeutischen Intervention früh in der Entwicklung beginnen, auf oder sogar vor der klinischen Manifestation des Patienten und verhindert so irreparable Schäden für den Einzelnen. Darüber hinaus haben fötalen Organen eine erhöhte Zellteilungsrate um erwachsenen Organen, die eine effizientere Gen oder Stammzelle Transfer in den Fötus ermöglichen kann verglichen. Darüber hinaus wird in utero Gentransfer durchgeführt werden, wenn die Person das Immunsystem nicht vollständig ausgereift. Daher sollte die Transplantation von Zellen oder heterologe Supplementierung eines nicht-funktionellen oder abwesend Protein mit einer korrekten Version nicht verursachen Immunsystem Sensibilisierung gegenüber der Zelle, Vektor oder Transgen Produkt, das kürzlich hat sich der Fall sein mit sowohl zelluläre und Gentherapien 7 .

In der vorliegenden Studie untersuchten wir das Potenzial, das direkt auf den fetalen Luftröhre in einem Maus-modell. Diese Vorgehensweise ist in den Einsatz in größeren Tiermodelle wie Kaninchen und Schafe 8, und auch in einer klinischen Umgebung 9, sondern muss vorher nicht Date in einem Maus-Modell durchgeführt. Bei der Untersuchung des Potenzials der fetalen Gentherapie für genetische Erkrankungen wie CF, ist der Maus-Modell sehr nützlich als erste Proof-of-concept wegen der breiten Verfügbarkeit der verschiedenen transgenen Maus-Stämme, die gut dokumentiert Embryogenese und fetale Entwicklung, weniger strenge ethische Vorschriften, kurz Schwangerschaft und die große Wurfgröße.

Verschiedene Zugangswege beschrieben worden, um die fetale Nager Lungenkrebs gezielt, einschließlich intra-Fruchtwasser Injektion 10-12, (Ultraschall-geführte) intrapulmonalen Injektion 13,14 und intravenöser Verabreichung in den Dottersack Schiffen 15,16 oder Nabelschnur 17. Unsere neuartige chirurgische Verfahren ermöglicht es Forschern, die Mittel der Wahl direkt in den fötalen Maus Luftröhre, die ermöglicht injizierenfür eine effizientere Abgabe an die Atemwege als existierende Techniken 18.

Protokoll

Ein. Mating von Mäusen auf gewünschte Schwangerschaft Stufe zu erhalten

Es paaren schwangeren NMRI-Mäuse, so dass sie 18 Tage (E18) schwangeren (insgesamt Gestation E19.5) zum Zeitpunkt der Operation sind. Vor und nach der Operation werden sie in Filteraufsatz Käfigen bei normaler Raumtemperatur und normalem Tageslicht mit freiem Zugang zu Wasser und Futter untergebracht.

2. Fetal intratracheale (IT) Injection (Abbildung 1)

  1. Zunächst den schwangeren NMRI Maus Vollnarkose mit 1,5% Isofluran in einer Mischung von O 2 bei 1,5 l / min. Das Niveau von Isofluran ist abhängig vom Alter und Beanspruchung der Maus, aber im Allgemeinen Isofluran sollte auf einem Niveau, dass die Tiere stellt in der Narkose Zustand sein. Dann legen Sie die schwangere Maus auf einem Heizkissen (37 ° C), um die Körpertemperatur während der Aufrechterhaltung Chirurgie.
  2. Die ganze Operation wird durch zwei Chirurgen durchgeführt. Ein Chirurg führt die Dissektion der schwangeren Maus und anschließender Belichtung the Fötus intratracheale Injektion. Der zweite Chirurg führt die fetale intratracheale Injektion selber. Der chirurgische Eingriff wird mit sterilen Instrumenten und eine aseptische Technik.
  3. Desinfizieren Sie den Bauch mit Povidon Jod und führen Sie eine mediane Laparotomie, um die schwangere Gebärmutter aussetzen. Exteriorisieren ein Uterushorn zu einer Zeit und die Anzahl der Fruchtblasen. Einem Fetus pro Hupe ist und betrieben gewählt basierend auf der optimalen Position für Exteriorisation des fötalen Kopfes in nachfolgenden Schritten. Der am besten geeignete Fötus durch Visualisierung durch die Gebärmutterwand ausgewählt. Die Nase des fetalen Kopfes sollte in Richtung der Chirurg, der in die Luftröhre nach dem Aussetzen der fetalen Kopfes und Befestigung nach hinten wird injiziert (wie im nachfolgenden Schritt 2.5 erläutert) zeigen.
  4. Zuerst eine 6-0 Polypropylen (Prolene) Tabaksbeutelnaht von ca. 1 cm im Durchmesser durch die Gebärmutterwand und den fetalen Membranen (Fruchtwasser membrane und parietalen Dottersack) über den Bereich, wo später der fetalen Kopfes wird durch ausgesetzt werden. Diese Naht hält den Fötus in der Gebärmutter von den Schultern ab fixiert. Weiter, stellen einen Einschnitt in die Gebärmutter im Tabaksbeutelnaht von ca. 0,8 cm mit einer scharfen Schere.
  5. Drücken Sie vorsichtig den Kopf und den Hals des Fötus durch die hysterotomy. Ziehen Sie den Tabaksbeutelnaht sanft eng um den Hals und fixieren Sie ihn mit 2 Micro-Mosquito Zange. Die fetalen Kopfes in Hyperextension durch einen 5-0 Polyglactin 910 (Vicryl) Naht auf zwei Zangen in den Mund um den Oberkiefer gehalten.
  6. Unter stereoskopische zoom Mikroskopie (x10 Vergrößerung) der fetalen Luftröhre ist visualisiert, indem eine vertikale Hautschnitt über scharfe und stumpfe Präparation. Der Einschnitt im Halsbereich ist etwa 5 mm lang. Es ist eine oberflächliche Inzision, wie das darunter liegende Gewebe weiter seziert wird mit stumpfen Dissektion die Luftröhre gelangen.
  7. unter direkter Sicht durch die stereoskopische Zoom-Mikroskop, injizieren ein Gesamtvolumen von 30 ul Substanz (z. B. fluoreszierende Kügelchen oder viralen Vektor) in die Luftröhre mit einem 50 ul Hamilton Glass Spritze mit einer 30 G spitzen Nadel. Nach Entfernen der Nadel, gewährleistet eine minimale Auslaufzeit des eingespritzten Flüssigkeit eine korrekte Injektion. Der Schnitt ist nicht nach der Injektion geschlossen.
  8. Um den Kopf in der Gebärmutter zu ersetzen, sanften Druck auf die Nase. Der Hals geht zuerst zurück in den Uterus, gefolgt von dem Kopf. Die Nase geht in letzte. Als nächstes schließen Sie die hysterotomy durch Anziehen der Tabaksbeutelnaht. Dann spritzen insgesamt rund 0,5 ml einer physiologischen Lösung in die Amnionhöhle um Oligohydramnion verhindern. Um dies zu tun, legen Sie eine Nadel in den Schnitt im Inneren der Geldbörse String. Als nächstes schließen Sie die Naht um die Nadel, nach denen Kochsalzlösung injiziert wird. In einem letzten Schritt, die Nadel zurückzuziehen, gefolgt durch vollständiges Schließen der pUrse String.
  9. Schließen der mütterlichen Bauchwand (Bauchfell und innere und äußere Muskelschicht) und der Haut mit einem 5:0 Vicryl fortlaufenden Naht in zwei getrennten Schichten. Danach infiltrieren den Schnitt mit 0,2% Xylocain zur postoperativen Schmerzlinderung. Es wird empfohlen, Buprenorphin (0,05 - 0,1 mg / kg SC oder IP) verwenden, zur postoperativen Schmerzlinderung. Weder prophylaktische Tokolytika noch Antibiotika verwendet werden. Die Mäuse werden auf einem Heizkissen gehalten (37 ° C), bis sie vollständig zurückgewonnen (ca. 1 Std.).

3. Fetal Intra-Fruchtwasser (IA) Injection

  1. Siehe 2.1
  2. Desinfizieren Sie den Bauch mit Povidon Jod und führen Sie eine mediane Laparotomie, um die schwangere Gebärmutter aussetzen. Exteriorisieren ein Uterushorn zu einer Zeit und die Anzahl der Fruchtblasen.
  3. IA Injektion kann auf allen Feten durchgeführt werden, da sie weniger Zeit in Anspruch nimmt durchzuführen. Weiterhin ist die Position des Fötus nicht kritischcal intratracheale Injektion verglichen. Da die Gebärmutterwand ist semi-transparent, sind die fetalen Strukturen wie der Kopf, Gliedmaßen und Schwanz und Plazenta Position gut sichtbar.
  4. Unter Verwendung der gleichen Nadel und Spritze nach oben (2,7), einzuspritzen 30 ul Substanz in der Nähe des fetalen Mund. Dies kann am einfachsten entweder zwischen dem Kopf und Vorderbeine fötalen oder zwischen den unteren Extremitäten und dem Schwanz erfolgen. Die Injektion erfolgt erst nach sorgfältiger Überprüfung der Position der Nadel zu gewährleisten, dass keine fötalen Strukturen in Kontakt mit der Spitze zum Zeitpunkt der Injektion durchgeführt.
  5. Der Uterus wird im Abdomen positioniert und die Bauchdecke und die Haut geschlossen, wie oben beschrieben (2,9).

4. Bewertung von Injected Föten und Cross-Förderung

  1. Töte den Damm mit einem zugelassenen Euthanasie Verfahren 36 Stunden nach der fetalen Eingriffe (bei E19.5). Genickbruch ohne zusätzlicheNarkose wäre die beste Methode zu sein, wie alle anderen Formen der Sterbehilfe, die Anästhesie (zB Isofluran, Pentobarbital) umfassen wird betäuben oder sogar töten die Föten, die Sie zu allen Zeiten zu vermeiden wäre. Bringt die operierten-on Föten per Kaiserschnitt. Die operierten Föten in der Gebärmutter durch ihre Position identifiziert. Fruchtblasen sind nummeriert, beginnend am Eierstock Ende des Uterus bicornis.
  2. Nach der Anlieferung werden die folgenden Kriterien verwendet werden, um die Lebensfähigkeit der Föten zu beurteilen: das Vorhandensein von (1) einem Herzschlag, (2) pink Hautfarbe (versus zyanotisch) und (3) spontanen Bewegungen. Legen Sie nur Welpen Erfüllung dieser Kriterien in einer Pflegemutter Wurf mit einen Tag alten Welpen. Aus Erfahrung wissen wir, dass Welpen mit einem schwachen Herzschlag, cyanotic Hautfarbe und / oder minimale spontane Bewegungen werden oft nicht überleben aufgrund der Ablehnung der Pflegemutter Einstreu oder durch mütterliche Kannibalismus.
  3. Nach der Lieferung ofa sichtbaren Farbstoff über IT oder IA Injektion (zB rot fluoreszierenden Molekülen), ist es möglich, eine korrekte Injektion durch die Anwesenheit dieses Farbstoffes versichern (rosa Farbe aus den eingespritzten roten fluospheres) im Thoraxbereich (durch direkte Injektion in den Lungen nach IT Injektion oder durch Inhalation in die Lunge nach IA Injektion) oder Bauchhöhle (durch Ingestion). Dies ist möglich aufgrund der Tatsache, dass neugeborene Mäuse halbtransparent sind damit für die in vivo Beurteilung der Lungen und Magen.
  4. Markieren Sie die korrekt injiziert Welpen mit chinesischen Ink subkutan über dem Schwanz Basis. Legen Sie alle Welpen, die den Anforderungen in 4.2 in der Pflegemutter Wurf genannten erfüllen.
  5. Um eine maximale Akzeptanz und das Überleben der operierten-on Welpen zu gewährleisten, lassen Sie nicht mehr als 10 Welpen insgesamt in der Pflegemutter Wurf (beide ihr eigenes 1 Tag alte Jungtiere, sowie die Cross-gefördert Welpen). Bevor Sie das operierte-on pups in der Pflegemutter Wurf, decken Sie sie in Einstreu aus der Pflegemutter, die sowohl ihren Kot und Urin, um nicht-vertraute Gerüche zu überdecken.
  6. Setzen Sie den Käfig in einer ruhigen Umgebung und nicht stören die Sänfte für mindestens 12 Stunden (über Nacht).
  7. Am folgenden Tag, sorgfältig prüfen die Überlebensrate der Förderung durch Zählen alle Welpen, die Unterscheidung zwischen der Pflegemutter Welpen und den operierten-on Welpen (markiert mit chinesischen Tusche und im Durchschnitt kleiner als die anderen Welpen). Minimieren Sie die Manipulation der Zeit diese Welpen zur Ablehnung durch die Mutter zu vermeiden und Hypothermie zu vermeiden. Im Allgemeinen, wenn Welpen haben keine Milch in den Magen (was sichtbar ist aufgrund der semi-transparenten Charakter des neugeborenen Welpen), ist die Prognose sehr schlecht für weitere Überleben der Tiere.

5. Repräsentative Ergebnisse

Das Gesamtkonzept des Experiments ist in Figur dargestellte 2.

Bestimmung der optimalen Volumen für intratracheale Injektion

Um die optimale Lautstärke für IT Injektion zu bestimmen, wir empirisch wählten verschiedene Volumina von 10, 20 bis 30 ul (n = 3/volume). Für eine einfache Erkennung, entschieden wir uns für rot fluoreszierende Moleküle (fluospheres, Molecular Probes, Leiden, Niederlande) im Format 100 nm zu injizieren. Nach Injektion in IT E18 alten Föten wurden die Lungen 24 Stunden später, in 4% Paraformaldehyd über Nacht bei 4 ° C und 6 um gefrorene Schnitte wurden geerntet fixiert. Kerne und Aktinfilamente wurden mit Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgien) und Alexa Fluor 488 Phalloidin (Invitrogen, Merelbeke, Belgien) jeweils für 20 Minuten bei Raumtemperatur gefärbt. Konfokale Bilder wurden unter Verwendung eines Biorad Radiance 2100 Konfokales Mikroskop mit LaserSharp2000.6 Software von Carl Zeiss. Die relative Fluoreszenz (Verhältnis von roten zu blauer Fluoreszenz repräsentiert fluospheres und nukleare staining, jeweils) wurde mit Hilfe ImageJ Online-Software (Abbildung 3). Obwohl zum Zeitpunkt der Fetalchirurgie, ein Rückfluss nur nach der Injektion von 30 ul erfaßt wurde, was auf einen Überschuß von Flüssigkeiten injiziert, gab 30 ul die höchste Menge an Fluoreszenzsignal im Lungenparenchym ermittelt durch Messung der relativen Fluoreszenz (Varianzanalyse quantifiziert Vergleiche für jedes Paar unter Verwendung des Student-t-Test, * p <0,05, *** p <0,001).

Quantitative Beurteilung fluospheres in Lungengewebe und Bioverteilung des Magen-Darm-Trakts

Weiter, wollten wir die Effizienz von Targeting der fetalen Lunge nach IT Maus gegen IA Injektion vergleichen. Dazu wurden 30 ul fluospheres der fetalen Mauslunge entweder nach IT oder IA Injektion in E18 schwangere NMRI-Mäuse (n = 5 pro Gruppe) geliefert. IT Injektion führte zu einer signifikant höheren Lieferung fluospheres der fetalen Lunge im Vergleich zum IA. Route (1,43 ± 0,56 und 0,05 ± 0,02 relative Fluoreszenz (Verhältnis von fluospheres Hoechst bzw. Analyse der Varianz, Student-t-Test, *** p <0,001) (Abb. 4 ac). Unbehandelte Kontrolle Feten wurden zur Normalisierung der fluoreszierenden verwendet Hintergrundsignal. Die Gastrointestinaltrakt war sowohl für die IT und den Tieren injiziert IA (Abbildung 4 d) positiv ist. keine rote Fluoreszenz in anderen Geweben aus behandelten Föten oder in den negativen Kontrolltiere (Daten nicht gezeigt) beobachtet.

Vergleich intratracheale und intra-Fruchtwasser Injektion nach rAAV2/6.2 vermittelten Gentransfer in der fetalen Lunge

Nach Vergleich beider Versandmethoden durch Einspritzen Fluoreszenzmolekülen, wollten wir die Effizienz der Transduktion viraler und anschließende Auswertung nach Genexpression IT und IA Injektion mit rAAV-Vektoren. rAAV2/6.2 Kodierung firefly Luciferase (Fluc) (3x10 10 GC / Fötus)unter der Kontrolle des Hühner-β-Aktin (CBA) Promotor IT (n = 8) oder IA (n = 6) in der fetalen NMRI Mäusen E18 injiziert. Nach Kaiserschnitt und Förderung, überlebenden Welpen wurden durch nicht-invasive Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) verfolgt und überwacht Fluc Aktivität (Photonen / Sekunde, p / s) bei 1 Woche alt (Abbildung 5). Die Gesamtmenge Photonenfluss für die IT-Gruppe war signifikant höher als der in der IA-Gruppe und die negative Kontrolle (Varianzanalyse, Vergleichen für jedes Paar mittels Student-t-Test, * p <0,05). Die durchschnittliche BLI Signal in der IA-Gruppe nicht signifikant höher als in der negativen Kontrollgruppe.

Unterscheidung zwischen einer richtigen und einer falschen fetalen intratracheale Injektion

Unterscheidung zwischen einer richtigen und einer incorrectI.T. Injektion kann auf mehreren Ebenen bewertet werden. Zum Zeitpunkt der Operation, während der Injektion in der fetalen Luftröhre, wird kein Widerstand bemerkt werden, wenn die needlE ist in der Luftröhre positioniert. Allerdings wird ein höherer Widerstand bemerkt beim Einspritzen in den paratracheal Raum werden. Zweitens bei Kaiserschnitt wie der Fötus ist halbtransparent ist es möglich, die Lungen und anschließend die Anwesenheit eines sichtbaren Farbstoff (z. B. Tusche, fluoreszierende Moleküle) zu sehen. Eine letzte Möglichkeit, um eine korrekte Injektion Beurteilung durch optische Bildgebung und genauer Biolumineszenz-Bildgebung. BLI ist eine elegante System zum nichtinvasiven Folgemaßnahmen Genexpression des Reportergens Luciferase, aber die räumliche Auflösung und anatomischer Informationen begrenzt sind. Magnetic Resonance Imaging (MRI) bietet eine hohe Auflösung, tomographische Bilder mit detaillierten anatomischen Informationen. Daher untersuchten wir die Kombination von BLI mit MRI, ein Überlagerungsbild, das die Oberfläche BLI Signal mit einer Visualisierung der tieferen anatomischen Strukturen (innere Organe) verbindet erhalten. Unser Ziel war es hierzu genauer in vivo Informationen der lokalensierung der Genexpression in der Lage sein, eine korrekte aus einer falschen IT Injektion unterscheiden.

Kombiniert BL-MR-Bilder wurden auf mehreren Tieren injiziert IT mit rAAV2/6.2 CBA-Fluc und CBA-LacZnls (3x10 10 GC / Fötus für jeden Vektor, n = 10) bei einer Woche nach Alter (Abbildung 6) erworben. BL Bildgebung offenbart ein Signal ausgehend von dem Hals und dem Brustbereich. Co-Registrierung der MRI mit BLI befindet Luciferase-Genexpression in der pulmonalen Region nach einer korrekten Injektion (Abbildung 6 a), jedoch in den Hals-und Bauchbereich nach einer falschen Injektion (Abb. 6b). Histologische Analyse durch X-gal-Färbung bestätigt die in vivo Co-Registrierung.

Überleben nach intratracheale und intra-Fruchtwasser Injektion

  1. Fluorospheres
    Das Überleben bis zur Auslieferung des E18 alten NMRI Föten injiziert IT oder IA mit 30 ul 100 nm rot fluorescent Moleküle betrug 100% in beiden Gruppen und wurde als die Anzahl von injizierten Föten lebendig zu dem Zeitpunkt der Ernte definierten, 24 Stunden nach dem chirurgischen Eingriff fetalen (Tabelle 1).
  2. rAAV-Vektor
    Das Überleben der Lieferung von Föten injiziert IT oder IA, mit rAAV2/6.2, die als die Anzahl der Föten lebend zum Zeitpunkt der Kaiserschnitt 36h Beitrag fetalen Injektion definiert ist, lag bei 85,3% und 86,3% (Tabelle 1). Die frühen neonatalen Überlebensrate betrug 53,3% (IT) und 74,5% (IA) verbunden sind, und durch Korrelieren der Anzahl von Jungtieren lebendig 1 Tag nach der Förderung mit der anfänglichen Anzahl von Föten injiziert berechnet. Um diese endgültigen Überlebensraten zu erhalten, optimiert wir die chirurgische Prozedur perioperative Protokoll durch Verwendung (1) inhalative Isofluran Anästhesie als anstelle der Verabreichung einer Mischung aus Ketamin (75 mg / kg IP) und Medetomidin (1 mg / kg IP) , (2) ein Heizkissen zu Unterkühlung während der Operation zu verhindern, (3),eine stereoskopische Zoom-Mikroskop und (4) die Betreiber immer mehr Erfahrung mit dem chirurgischen Eingriff.

figure-protocol-1
Abbildung 1. Intratracheale Injektion in E18 fetalen Mäusen. In dieser Abbildung sind die wichtigsten Schritte des chirurgischen Eingriffs für die fetale IT Injektion dargestellt. In einem ersten Schritt ein Uterushorn wird exteriorisiert. In einem nächsten Schritt wird eine Tabaksbeutelnaht durch die Gebärmutterwand geleitet und die fötalen Membranen (Amnionmembran und parietalen Dottersack) über den Bereich, wo später der fötalen Kopfes wird durch freigelegt werden. Anschließend werden der Kopf und der Hals des Fötus durch die Hysterotomie exteriorisiert, woraufhin der fötalen Kopfes in Überstreckung wird von einem 5:0-Polyglactin 910 Nahtmaterial auf zwei Zangen zwischen den Backen gehalten wird. Unter stereoskopische Mikroskopie Zoom (x10 Vergrößerung) der fetalen Luftröhre ist, indem sie einen vertikalen Hals Incis visualisiertion mit scharfen und stumpfen Dissektion. In einem letzten Schritt wird ein Gesamtvolumen von 30 ul des Stoffes in die Luftröhre unter direkter Sicht durch die stereoskopische Zoom-Mikroskop injiziert.

figure-protocol-2
Abbildung 2. Allgemeiner Überblick des Experiments.

figure-protocol-3
Abbildung 3. Bestimmung der optimalen Volumen für intratracheale Injektion. Um das optimale Volumen für IT Injektion bestimmen, 10, 20 oder 30 bemessen ul (n = 3/volume) rotes fluospheres 100 nm E18 alten Föten wurden verabreicht und die Lungen wurden 24 h geerntet später. Kerne und Aktinfilamente wurden mit Hoechst 33258 und Alexa Fluor 488 Phalloidin bzw. gefärbt. Die relative Fluoreszenz (Verhältnis von roten zu blauer Fluoreszenz repräsentiert fluospheres und Kernfärbung jeweils) wurde mit Hilfe ImageJ Online-Software. Mittelwert ± SD, Varianzanalyse, Vergleiche für jedes Paar unter Verwendung des Student-t-Test, * p <0,05, *** p <0,001.

figure-protocol-4
Abbildung 4. Quantitative Beurteilung fluospheres in Lungengewebe und Bioverteilung des Magen-Darm-Trakt. 30 ul roten fluospheres wurden dem fetalen Mauslunge nach (a) IT oder (b) IA Injektion in E18 schwangeren NMRI-Mäuse, die Effizienz der Targeting vergleiche gelieferte die fetale Mauslunge. Unbehandelten Kontrolle Feten wurden zur Normalisierung der fluoreszierenden Hintergrund-Signal verwendet. Kerne und Aktinfilamente wurden mit Hoechst 33258 und Alexa Fluor 488 Phalloidin gefärbt sind. (C) Die relative Fluoreszenz (Verhältnis von roten zu blauer Fluoreszenz repräsentiert fluospheres und Kernfärbung jeweils) wurde mit Hilfe ImageJ Online-Software. (d) Der Magen-Darm-Trakt positiv war sowohl für die IT und den IA injiziert Tiere. Mittelwert ± SD, Varianzanalyse, Student-t-Test, *** p <0,001. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

figure-protocol-5
Abbildung 5. Vergleich intratracheale und intra-Fruchtwasser Injektion nach rAAV2/6.2 vermittelten Gentransfer in der fetalen Lunge. BLI Signal an 1 Woche nach der Injektion von rAAV2/6.2 (3 × 10 10 GC / Fötus CBA-Fluc) mit entsprechenden Quantifizierung von insgesamt Photonenfluss . Alle Tiere gescannt wurden, durch schwarze Trennwände, die Streuung von Photonen an benachbarte Tiere zu vermeiden. Die Pseudo-Skala zeigt die Photonenfluss pro Sekunde, Pro Quadratzentimeter pro Steradiant (p / s / cm 2 / sr). Messungen wurden in einer 4,3 cm 2 rechteckige Region von Interesse erhalten. Mittelwert ± SD, Varianzanalyse, Vergleiche für jedes Paar unter Verwendung des Student-t-Test, * p <0,05. Abbildung adaptiert aus Carlon et al., 2010. Abdruck mit freundlicher Genehmigung von Macmillan Publishers Ltd: [Molecular Therapy] (doi: 10.1038/mt.2010.153), Urheberrecht (2010). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

figure-protocol-6
Abbildung 6. Unterscheidung zwischen einer richtigen und einer falschen fetalen intratracheale Injektion nach rAAV2/6.2 vermittelten Gentransfer in der fetalen Lunge. Kombiniert BL-MR-Bildern auf mehreren Tieren erworben wurden injiziert IT mit rAAV2/6.2 CBA-Fluc und CBA-LacZnls (3x10 10 GC / Feten für jeden vector) an einer Woche Alter. BL Bildgebung offenbart ein Signal ausgehend von dem Hals und dem Brustbereich. Co-Registrierung der MRI mit BLI befindet Luciferase-Genexpression in der pulmonalen Region nach einer korrekten Injektion (a), jedoch in den Hals-und Bauchbereich nach einer falschen Injektion (b). Die histologische Analyse bestätigte die in vivo Co-Registrierung. Maßstab = 100 um. Von Carlon et al., 2010 angepasst Figur. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Injektionsstoff Injection-Methode Überleben bis zur Lieferung einer Überlebensrate der Förderung b Frühe neonatale Überlebensrate c
fluospheres IT 100 (8/8) na na
IA 100 (5/5) na na
rAAV2/6.2 IT 85,3 (64/75) 62,5 53,3 (40/75)
IA 86,3 (44/51) 86,4 74,5 (38/51)

Tabelle 1. Überleben nach FETAL intratracheale und intra-Fruchtwasser Injektion. Ein Überleben bis zur Auslieferung, dh nach Fetalchirurgie und Kaiserschnitt, bevor die Förderung. B Pups wurden nur gefördert, wenn sie rosa sind, bewegen und normal atmet. C Die frühe neonatale Überlebensrate ausgedrückt in Abhängigkeit von der anfänglichen Anzahl von Jungtieren injiziert. Abkürzungen: IT intratracheale Injektion; IA Intra-Fruchtwasser Injektion; na nicht anwendbar.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Kritische Schritte

  • Die Maus Sorte haben wir entschieden, mit zu arbeiten ist NMRI Mäuse, weil sie eine reiche Zahl an Jungtieren (durchschnittliche Wurfgröße 14,4 ± 1,8, eigene Daten), tolerieren Eingriffe gut und haben gute mütterliche Eigenschaften.
  • Platzieren des Tabaksbeutelnaht durch die Gebärmutterwand und den fetalen Membranen ist ein kritischer Schritt, wie Sie wollen nur die fetalen Kopfes und nicht die Schultern aussetzen, sonst Neupositionierung ist es fast unmöglich, ohne Trauma.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

MC und avdp sind Doktoranden durch Zuschüsse aus dem Institut zur Förderung von Innovation durch Wissenschaft und Technologie in Flandern (IWT-Vlaanderen) unterstützt. JT hat einen Teilzeit Clinical Research Fellowship (KOOR) von UZ Leuven. DV ist ein Doktorand durch einen Zuschuss von der KU Leuven, DBOF/10/062 unterstützt. MMDC ist ein Doktorand durch einen Zuschuss aus Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq) und Erasmus Mundus unterstützt. Forschung wurde von IWT-Vlaanderen finanziert, die von der EG-Finanzhilfe DIMI (LSHB-CT-2005 bis 512.146) und durch die In-vivo Molecular Imaging Research Gruppe (IMIR) von der KU Leuven. Wir würden gerne die UPenn Vector Core von James M. Wilson für ihre freundliche Gabe des AAV6.2 Verpackungen Plasmid für rAAV-Vektor Produktion gegründet anerkennen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Name des Reagenzes Firma Katalog-Nummer Kommentare (optional)
NMRI-Mäuse Janvier, Le Genest St Isle, Frankreich
Isofluran Isoba, Intervet / Schering-Plough Animal Health, Milton Keynes, UK
Prolene 6-0 Ethicon, Groot Bijgaarden, Belgien
Vicryl 5-0 Ethicon, Groot Bijgaarden, Belgien
50 ul Hamilton Glass Spritze, Modell 1710,5 TLLX SYR Hamilton, Reno, NV, USA 5495-20
30G spitzen Nadel Hamilton, Reno, NV, USA 7762-03
2% Xylocain AstraZeneca, Zoetermeer, Niederlande

Referenzen

  1. Willson, D. F., Notter, R. H. The future of exogenous surfactant therapy. Respir. Care. 56, 1369-1388 (2011).
  2. Abdel-Latif, M. E., Osborn, D. A. Intratracheal Clara cell secretory protein (CCSP) administration in preterm infants with or at risk of respiratory distress syndrome. Cochrane Database Syst. Rev. CD008308, (2011).
  3. Thebaud, B. Vascular endothelial growth factor gene therapy increases survival, promotes lung angiogenesis, and prevents alveolar damage in hyperoxia-induced lung injury: evidence that angiogenesis participates in alveolarization. Circulation. 112, 2477-2486 (2005).
  4. Griesenbach, U., Alton, E. W. Gene transfer to the lung: lessons learned from more than 2 decades of CF gene therapy. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 128-139 (2009).
  5. Aneja, M. K., Rudolph, C. Gene therapy of surfactant protein B deficiency. Curr. Opin. Mol. Ther. 8, 432-438 (2006).
  6. Flotte, T. R., Mueller, C. Gene therapy for alpha-1 antitrypsin deficiency. Hum. Mol. Genet. 20, R87-R92 (2011).
  7. Roybal, J. L., Santore, M. T., Flake, A. W. Stem cell and genetic therapies for the fetus. Semin Fetal Neonatal Med. 15, 46-51 (2010).
  8. Peebles, D. Widespread and efficient marker gene expression in the airway epithelia of fetal sheep after minimally invasive tracheal application of recombinant adenovirus in utero. Gene Ther. 11, 70-708 (2004).
  9. Deprest, J., Gratacos, E., Nicolaides, K. H. Fetoscopic tracheal occlusion (FETO) for severe congenital diaphragmatic hernia: evolution of a technique and preliminary results. Ultrasound Obstet. Gynecol. 24, 121-126 (2004).
  10. Buckley, S. M. Intra-amniotic delivery of CFTR-expressing adenovirus does not reverse cystic fibrosis phenotype in inbred CFTR-knockout mice. Mol. Ther. 16, 819-824 (2008).
  11. Davies, L. A. Adenovirus-mediated in utero expression of CFTR does not improve survival of CFTR knockout mice. Mol. Ther. 16, 812-818 (2008).
  12. Mitchell, M., Jerebtsova, M., Batshaw, M. L., Newman, K., Ye, X. Long-term gene transfer to mouse fetuses with recombinant adenovirus and adeno-associated virus (AAV) vectors. Gene Ther. 7, 1986-1992 (2000).
  13. Henriques-Coelho, T. Targeted gene transfer to fetal rat lung interstitium by ultrasound-guided intrapulmonary injection. Mol. Ther. 15, 340-347 (2007).
  14. Toelen, J. Fetal gene transfer with lentiviral vectors: long-term in vivo follow-up evaluation in a rat model. Am J Obstet Gynecol. 196, e1-e6 (2007).
  15. Waddington, S. N. Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice. Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).
  16. Waddington, S. N. Permanent phenotypic correction of hemophilia B in immunocompetent mice by prenatal gene therapy. Blood. 104, 2714-2721 (2004).
  17. Senoo, M. Adenovirus-mediated in utero gene transfer in mice and guinea pigs: tissue distribution of recombinant adenovirus determined by quantitative TaqMan-polymerase chain reaction assay. Mol. Genet. Metab. 69, 269-276 (2000).
  18. Carlon, M. Efficient gene transfer into the mouse lung by fetal intratracheal injection of rAAV2/6.2. Mol. Ther. 18, 2130-2138 (2010).
  19. Schmiedl, A. Lipopolysaccharide-induced injury is more pronounced in fetal transgenic ErbB4-deleted lungs. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol Physiol. 301, L490-L499 (2011).
  20. Buckley, S. M. Factors influencing adenovirus-mediated airway transduction in fetal mice. Mol. Ther. 12, 484-492 (2005).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Trachea von Mausembryonenintratracheale Injektionfetale Gentherapiechirurgischer EingriffHysterotomie Technikfluoreszierende Beadsvirale Vektorapplikationkonfokale BildgebungBiolumineszenz ImagingMagnetresonanztomographie
A Novel Surgical Ansatz intratracheale Verabreichung von Wirkstoffen in einem Fetal Mouse Model
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.