Kultivierung neuronalen Explantaten aus seziert Xenopus laevis Embryonen, die fluoreszierende Fusionsproteine ausdrücken können zur Abbildung von Wachstum Kegel Zytoskelett Dynamik.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der komplexe Prozess der Axon Führung weitgehend durch das Wachstum Kegel, der die dynamische beweglichen Struktur an der Spitze des wachsenden Axon ist angetrieben. Während Axon Auswuchs, muss der Wachstumskegel integrieren mehrere Stromquellen Signalstoff Informationen zu modulieren ihre Zytoskelett um die Wachstumskegel vorwärts zu treiben und genau zu navigieren, um die spezifischen Ziele 1 finden. Wie diese Integration auf der Zytoskelett-Ebene auftritt, wird noch im Entstehen begriffen, und Prüfung der Zytoskelettprotein und Effektor Dynamik innerhalb der Wachstums Kegel kann die Aufklärung dieser Mechanismen ermöglichen. Xenopus laevis Wachstum Kegel groß genug (10-30 Mikrometer im Durchmesser), um hohe auflösenden Echtzeit-Bildgebung von Zytoskelett Dynamik (z. B. 2-4) und sind einfach zu isolieren und in einer Testumgebung manipulieren Vergleich zu anderen Wirbeltieren. Der Frosch ist ein klassisches Modellsystem für Entwicklungsneurobiologie Studien und wichtige frühe Einblicke in das Wachstum Kegel microtubule Dynamik wurde zunächst festgestellt, mit diesem System 5-7. Bei diesem Verfahren wird 8 sind Eier gesammelt und in vitro befruchtet, injiziert mit RNA kodierenden fluoreszenzmarkiertes Zytoskelett-Fusionsproteine oder andere Konstrukte, die Genexpression zu manipulieren, und konnte sich dann auf dem Neuralrohr Stadium entwickeln. Neural Rohre werden durch Dissektion isoliert und dann kultiviert werden, und das Wachstum Kegel auf entwachsen Neuriten abgebildet werden. In diesem Artikel beschreiben wir, wie Sie diese Methode, deren Ziel die Kultur Xenopus laevis Wachstum Kegel für nachfolgende Bild mit hoher Auflösung Analyse durchzuführen. Während wir das Beispiel + TIP Fusionsprotein EB1-GFP bereitzustellen, kann dieses Verfahren auf eine beliebige Anzahl von Proteinen, um deren Verhalten in der Wachstumskegel aufzuklären aufgebracht werden.
Protokoll
Hinweis: Wir beschreiben die Schritte in den ersten beiden Abschnitten nur kurz, als hervorragende Protokolle mit detaillierten Informationen wurden an anderer Stelle, die sich speziell auf diesen Schritten (zB 8-12) veröffentlicht. Darüber hinaus hat das allgemeine Protokoll der Arbeit mit Xenopus spinalen Neuronen im Live-Zellkultur zuvor in einem ausführlichen Verfahren Artikel 8 veröffentlicht. Wir empfehlen Überprüfung, dass Artikel als Ergänzung zu diesem Video, obwohl wir hier nicht genügend Informationen, um erfolgreich und Fehlerbehebung des Neuralrohrs Dissektion und plating Protokoll in Schritt 3.
1. In-Vitro-Fertilisation von Xenopus Eier
- Erhalten Eier von weiblichen Frösche, die mit Choriongonadotropin (400 Einheiten / frog) 12-18 h vor dem Eiersammlung injiziert wurden. Sammle Eier in Geändert Ringer 1X Marc-Lösung (MMR) (0,1 M NaCl, 2,0 mM KCl, 1,0 mM MgSO 4, 2,0 mM CaCl 2, 5,0 mM HEPES, pH 7,4 9).
- Befruchten Eier in vitro mit Hackfleisch Hoden, wie zuvor beschrieben 9.
- Nach mindestens 20 min, zu entfernen Embryo Gelee Mantel durch Inkubieren Embryonen in 2% Cystein in 1X MMR (auf pH 7,8 mit NaOH) für 3-5 min. Waschen mit 0,1 x MMR (oder 0,1 x MBS (Modified Barths Saline, 1X Rezept: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 2,5 mM NaHCO 3, 5 mM HEPES, pH 7,8)) 3 -5 Zeiten, und halten Embryonen bei Raumtemperatur bis Injektionen, oder, falls gewünscht, Ort Embryonen bei 14-18 ° C zu verlangsamen Entwicklung.
2. Mikroinjektion von RNA
Anmerkung: Während wir hier RNA-Injektion zu verwenden, sind diese Techniken nicht beschränkt auf RNA und DNA, Proteine oder modifizierte Nukleinsäuren zur Genmanipulation können ebenfalls verwendet werden und sind zuvor 12 beschrieben.
- Vor Experiment RNAs für die Kennzeichnung des Zytoskeletts oder andere Strukturen are von linearisierten DNA-Templates unter Verwendung der mMessage mMachine Kit (Ambion) transkribiert. mRNAs erfordern eine 5'-Cap und eine 3'-Polyadenylierungs-Schwanzes an Übersetzung und Verhütung Abbau in Embryonen. pCS2 + ist eine häufig verwendete Vektor für diesen Zweck, und die Transkription Kit umfasst eine Kappe analogen während der Synthesereaktion. Wir resuspendieren transkribierten mRNA in Nuklease-freiem ddH 2 0, an einer Börse Konzentration zwischen 500 und 2.000 ng / ul, durch prompte Lagerung bei -80 ° C, gefolgt Vor der Injektion verdünnte RNA in ddH 2 0 auf die geeignete Konzentration für die Injektion. Da nur ein geringes Volumen in Embryonen injiziert werden, Resuspendieren in Puffer ist nicht notwendig. Unsere letzten Injektion Konzentration typischerweise 50-200 pg / nl, je nach Konstruktion, und wir normalerweise wird injizieren bis 4 nl pro Embryo, obwohl viele Laboratorien traditionell injizieren bis zu 10 nl, die etwa 1% des Gesamtvolumens ist ein Embryo. RNA kann in hohen Dosen toxisch, und die Dosis pro Embryo Gattungenlly im Bereich von 10 pg bis 1 ng, obwohl bis zu 5 ng toleriert Abhängigkeit von der speziellen Gens und Reinheit sein. Doch für bildgebende Proteinlokalisierung sollte die niedrigst möglichen Ebene injiziert, um Überexpression Artefakte zu vermeiden. RNA für EB1-GFP in diesem Protokoll wird auf endgültige Höhe von 250 pg pro Embryo verwendet.
- Planen Injektionsnadeln durch Ziehen Kapillare mit einer Nadel Abzieher 9, zu einem Spitzendurchmesser von ~ 0,2 um. Mit einem Sutter P-87 Abzieher, verwenden wir die folgenden Einstellungen: heat 644, Pull 125, Geschwindigkeit 70, Zeit 250, aber diese Parameter unterscheiden sich je nach Maschine und muss nach der Änderung des Filament (verwenden wir derzeit eine 2,5 mm nachjustiert werden quadratisches Feld Filament, das 2,5 mm breit) ist. Unter dem Mikroskop brechen Nadelspitze mit der Pinzette in einem Winkel zu einer Pinole-artige Form zu erzeugen. Es gibt andere Verfahren zum Brechen und Füllen Injektionsnadeln (zB 11,12), aber wir füllen die Nadel mit RNA, indem ein kleiner Tropfen (0,5 - 1 ul) mit dem hinteren Ende desNadel. Für Mikroinjektion in Embryonen, gibt es eine Reihe von kommerziell erhältlichen Einspritzsystemen, zwei der häufigsten ist die Pico-Injektor (Medical Systems) und die Nanoject (Drummond Scientific) (siehe 11 für weitere Informationen). Wir verwenden die Medical Systems PLI-100 Pico-Injector, die komprimiertes Gas verwendet für ein digital festgelegten Zeitraum, um konsistente Nanoliterbereich liefern. Injektionsvolumen muss für jede neue Mikropipette mit einem Objektmikrometers kalibriert werden und Einspritzzeit sollten angepasst werden, um gewünschte Menge des eingespritzten RNA zu erreichen.
- Ort befruchteten Embryonen auf dem 1 - bis 4-Zellen-Stadium in eine Plastikschale mit 5% Ficoll in 0,1 X MMR. Halten des Embryos im Platz mit einer Pinzette oder zum Einsetzen in eine Halteplattform (a Kunststoffnetz mit einer ~ 1 mm-Raster, verklebt auf der Unterseite der Schale mit Plastilin oder Dentalwachs) einzuspritzen gewünschte Volumen in tierische Blastomeren (siehe Schritt 2.1 Für weitere Details bzgl. Injektionsvolumina). Verteilen Sie in mehreren locations gesamten Embryos, um wenigstens eine Injektion in jeden der tierischen Blastomeren erhalten gleichmäßigere Verteilung (z. B. für einen 4-Zellen-Stadium Embryo, wir typischerweise 1-2 mal injizieren in jedem Blastomere, während in einem 2-Zellstadium Embryo, injizieren wir 2-4 mal in jedem Blastomeren). Ein Vorteil des Wartens bis zum 2-4 Zell-Stadium ist, dass Sie sicherstellen, der Embryo zu spalten begonnen normal. Allerdings, wenn die Zeit drängt, können Sie an der 1-Zell-Stadium beginnen, mit geringen Unterschieden im Ergebnis außer mehr Embryonen zu müssen injiziert werden. Ältere Embryonen können ebenso verwendet werden, und dies ist besonders nützlich, wenn bestimmte Zelltypen zur Injektion ausgerichtet sind, aber als wir im Allgemeinen bevorzugen eher breit Ausdruck, wir jüngeren Embryonen injiziert, um die Notwendigkeit zahlreicher Injektionen reduzieren.
- Übertragen injizierten Embryonen zu einer Plastikschale mit 0,1 X MMR und ihnen zu ermöglichen, bis der Bühne 20-23 13 zu entwickeln. Inkubieren Embryonen bei 14 bis 22 ° C je nach gewünschtem speed der Entwicklung. (Für Sezieren neuronalen Rohren am folgenden Tag, verwenden Sie ~ 22 ° C. Für den Tag nach, verwenden Sie ~ 14 ° C)
3. Neuralrohr Dissection und Oberflächen
- Vor Durchführung der Dissektionen, bereiten die Kulturschalen 14. Zunächst beschichten Deckgläser mit genügend Lösung von 200 ug / ml Poly-Lysin in PBS zu bündeln über die Oberfläche des Deckglases, entweder Mattek-oder Lab-Tek Kulturschalen und inkubieren für eine Stunde (alternativ könnte man Deckgläschen sitzen lose in einer Petrischale für die spätere Platzierung auf Glas-Objektträger für die Bildgebung und Immunzytochemie). Absaugen und waschen mit einem Überschuss an PBS 3 mal, und trocknen lassen. Dann coat Gerichte mit 10 ug / ml Laminin in PBS (wir normalerweise 500 ul pro Deckglas, genug, um Pool über der Oberfläche) für eine Stunde bei 37 Grad. Absaugen Laminin-Lösung und 3 x waschen mit einem Überschuss an PBS, man aufpassen, nicht zu lassen, Laminin-beschichteten Oberflächen freigelegt werden, um die Luftschnittstelle. Replace PBS mit Kulturmedium (50% Ringerlösung, 49% L-15 Medium, 1% fötalem Rinderserum, plus 50 ug / ml Penicillin / Streptomycin und Gentamycin, pH 7,4 und filtersterilisiert). (Ringer-Media, 115 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 10 mM Hepes pH 7,4, 0,5 mM EDTA). Während unsere Protokoll verwendet dieses Medium ist anzumerken, dass dies eine gemeinsame angereicherten Medium für ältere Xenopus retinalen Ganglienzellen Kulturen, wo Neuronen reduziert Energie reserviert haben ist. Junge Rückenmarks Kulturen überleben und zu wachsen für mehr als 24 Stunden im reinen Ringers die Medien ohne zusätzliche Wachstumsfaktoren, und dies ist in der Tat einer der Vorteile der Verwendung dieses Systems. Optional: add NT3 und BDNF (bis zu Endkonzentrationen von 25 ng / ul) von Nährmedien in Axon Auswuchs erhöhen.
- Aufgrund der Variabilität in der Expression von mRNA injiziert, kann Embryonen weisen ein Mosaik von Fluoreszenz. Vor dem Durchführen Sezieren, Sieb Embryonen auf das Vorhandensein von Fluoreszenz, um diese Embryonen, EXP identifizierenRESS das fluoreszierende Fusionsprotein im Neuralrohr. Zeigen fluoreszierende Embryonen im Stadium 20-23 in einem Agarose-beschichtete Kunststoff-Schale mit Steinberg Medien (58 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 0,44 mM Ca (NO 3) 2, 1,3 mM MgSO 4, 4,6 mM Tris, pH-Wert auf 7,8 dann gefüllt autoklaviert) 5. Um die Agarose-beschichtete Schale, Mantel unten Plastikschale mit geschmolzener 1% Agarose in 0,1 MMR und sei aushärten zu machen. Dies bietet eine weiche Oberfläche, so daß keine Beschädigungen an der feinen Pinzette und Wolfram Nadeln während der nachfolgenden Schritte verwendet Dissektion auftreten. Dissection von Embryonen außerhalb Stufe 23 möglich ist, aber es ist schwieriger als Gewebe stärker aneinander haften und erfordern daher längere Behandlung mit Kollagenase.
- Unter einem Binokular, entfernen Sie die Dotterhaut mit feinen Pinzetten und dann isolieren die gesamte dorsale Teil des Embryos, indem eine Reihe von Einschnitten. Während einer Zange den Embryo in Position zu halten, verwenden Sie die zweite, um einen Einschnitt auf das MakeSeite des Embryos, um den hohlen Innenraum freizulegen. Dann nutzen beide Zangen kneifen zusammen das Gewebe zwischen den dorsalen und ventralen Hälfte des Embryos, wodurch Schneiden der Embryo in die Hälfte auf den dorsalen Abschnitt, der das Neuralrohr zu isolieren.
- Legen Sie die dorsalen Explantat in ein Eppendorf-Röhrchen mit 2 mg / ml Kollagenase in Steinberg Medien für 15-20 min auf einem Rotator, um Gewebe zu lösen, und dann Pipette dorsalen Explantat in eine Kunststoff-Agarose-beschichteten Teller mit frischen Steinberg-Lösung. Alternativ kann das Explantat in einer Petrischale mit der Kollagenase-Lösung für 15 min, wobei das gesamte Dissektion dann durchgeführt werden könnte abgegeben werden.
- Verwendung einer Pinzette vorsichtig sezieren das Neuralrohr von der dorsalen und der ventralen Epidermis Notochord. Schieben Sie die Spitze der Zange zwischen der Epidermis und des darunterliegenden Gewebes und langsam nach hinten ziehen die Epidermis und enthüllt das Neuralrohr unten. Verwenden Sie dann eine Pinzette, um das Gewebe zu halten und eine weitere, um die Spitze zwischen dem SchieberNeuralrohr und Chorda. Schließlich verwenden, um die Zange Somiten beiderseits der Röhre zu entfernen.
- Übertragen der Neuralrohr an ein Agarose-beschichteten Schale mit Kulturmedien aufgefüllt, wie in Schritt 3.1 beschrieben.
- Nach Sammlung von mehreren neuronalen Rohre, schneiden sie in zahlreiche Stücke (ungefähr 20, wenn das ganze Rohr isoliert ist) mit geschärften Wolframnadeln oder Zangen, und dann die Stücke Platte in Kulturschalen mit Medium (hergestellt in Schritt 3.1) gefüllt, Ausbreiten die Explantate gleichmäßig in Reihen.
- Nach dem Plattieren, nicht bewegen die Gerichte, weil diese die Anheften der Zellen stören würde. Inkubieren plated Neuralrohr Explantate rund 20-22 ° C. Wir in der Regel verlassen die Schale von Zellen auf der Bank über Nacht bei Raumtemperatur. Einer der Vorteile von Xenopus laevis Neuronen ist, dass ein spezieller Inkubator für Zellkulturen, der CO 2-Gehalt oder die Temperatur reguliert nicht benötigt wird. Neuriten und Wachstumskegeln beobachtet und bei Raumtemperatur 12 abzubildenden-24 Stunden nach dem Ausstreichen, obwohl Auswachsen kann mit der Zugabe von Wachstumsfaktoren beschleunigt werden. Im allgemeinen wird die Expression eines RNA oder Plasmid Produkt in Variablenausdruck zwischen Zellen führen und somit kann es eine Reihe von Fluoreszenz Expressionsniveaus zwischen Wachstumskegeln sein. Wir haben RNA-Expression von fluoreszierenden Proteinen, über 48 Stunden nach dem Ausstreichen persistieren beobachtet, obwohl dies abhängig von der speziellen Konstruktion.
4. Repräsentative Ergebnisse
Nachdem Sie das Protokoll, das in Abbildung 1A zusammengefasst ist, werden gesunde, korrekt seziert und kultiviert neuronalen Explantaten senden zahlreiche Axone oder Neuriten in jede Richtung auf Laminin / Poly-Lysin Substrat, in 1B gezeigt. Die Wachstumsbedingungen Konen an den Spitzen der Axone kann entweder durch DIC Optik, wie in 1C gesehen, ein Bild insgesamt Motilität Dynamik oder hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie abgebildet werden, um die lo untersuchencalization von fluoreszent-tagged Zytoskelett-Proteine, beispielsweise EB1-GFP in 1D gezeigt.
Abbildung 1. Zusammenfassung der experimentellen Protokoll und die erwarteten Ergebnisse. A) Protocol Flow-Chart. Siehe Film für Details bezüglich Dissektion am Tag 3. Die gesamte Neuralrohr sollte in etwa 20 gleich große Stücke geschnitten und verteilt sich gleichmäßig in Reihen auf dem Deckglas. In diesem Cartoon, sind Schere dargestellt zu vertreten Schneiden des Gewebes mit feinen Pinzetten. CG Choriongonadotropin B) DIC Bild Axone oder Neuriten wachsen aus Explantat (Explantat der oberen linken Ecke). C) Höhere Vergrößerung Bild des Wachstums Kegel an der Spitze eines wachsenden Axons. D) Fluoreszenzmikroskopisches Bild EB1-GFP im Wachstum Kegel. Maßstab 10 um. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
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Diskussion
Xenopus laevis neuronalen Explantaten aus senden Neuriten in einem sehr robusten Weise durch 24 Stunden nach dem Ausstreichen auf dem Laminin / Poly-Lysin Substrat, wenn die Bedingungen angemessen sind. Mit diesem Substrat sind Wachstumskegeln höchst beweglich und kann Axon Längen von bis zu 1 mm zu erreichen, die sich in allen Richtungen nach außen aus dem Explantat, obwohl typische Längen 100 um oder mehr sind. Wenn Neuriten nicht wachsen, gibt es eine begrenzte Anzahl von Gründen der Fall sein. Eine Möglichk...
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Die Autoren bedanken sich bei Bob Freeman für die Ausbildung und die Kirschner-Labor für den Einsatz des Frosches Anlage danken, und die Mitglieder der Van Vactor Labor für die Unterstützung. Wir danken der Nikon Imaging Center an der Harvard Medical School für die Unterstützung bei der Lichtmikroskopie für die Bilder in Abbildung 1. Diese Arbeit wurde durch die folgende finanziert: NRSA NIH Gemeinschaft und NIH K99 Stipendium für LAL, Basic Science Partnership Finanzierung ( https://bsp.med.harvard.edu/ ) zu AEF und NIH RO1 NS035909 DVV
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenz | Firma | Katalog-Nummer | |
| Choriongonadotropin | Argent Chemical Laboratories | C-HCG-ON-10 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| mMessage mMachine Kit | Ambion | AM1340 | |
| Kapillar Borosil Nadeln 1,2 mm (OD) x 0,9 mm (ID) | FHC | 30-31-0 | |
| Ficoll | Sigma | F2637 | |
| Dumont Nr. 5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 | |
| Mattek Gerichten | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 | |
| Poly-l-Lysine | Sigma | P-1399 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| NT3 | Sigma | N1905 | |
| BDNF | Sigma | B3795 |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
