Wir präsentieren eine Methode zur Liquor (CSF) zu sammeln und ein System, das CSF fehlt im embryonalen Zebrafischgehirn ventrikuläre System zu erstellen. Dies ermöglicht eine weitere Untersuchung der CSF Zusammensetzung und seine Forderung während der embryonalen Entwicklung des Gehirns.
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Methodenartikel
Manuelle Drainage der Zebrafisch Embryonale Hirnkammern
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Liquor (CSF) ist ein Protein reiche Flüssigkeit innerhalb der Ventrikel im Gehirn enthalten. Es ist während der frühen Wirbeltiere Embryonalentwicklung vorhanden und bleibt während des gesamten Lebens. Adult CSF wird angenommen, dass das Gehirn dämpfen, entfernen Abfallprodukte und tragen sezernierte Moleküle 1,2. Beim Erwachsenen und älteren Embryo, wird die Mehrheit der CSF durch den Plexus choroideus, eine Reihe von stark vaskularisierten sekretorischen Bereiche benachbart angeordnet, um den Hirnkammern 3-5 hergestellt. Im Zebrafisch wird der Plexus komplett bei 144 Stunden nach der Befruchtung (hpf) 6 gebildet. Zuvor sowohl Zebrafisch und andere Wirbeltierembryonen einschließlich Maus, eine signifikante Menge an embryonalen CSF (ECSF) vorhanden ist. Diese Daten und Studien chick vermuten, dass die Neuroepithel sekretorischen früh in der Entwicklung ist, und kann die Hauptquelle der ECSF vor Plexus Entwicklung 7 sein.
ECSF enthält etwa dreimal mehr Protein than Erwachsenen CSF, was darauf hindeutet, dass es eine wichtige Rolle bei der Entwicklung 8,9 haben. Studien bei Huhn und Maus demonstrieren, dass sekretierten Faktoren im ECSF, Fluiddruck oder eine Kombination von diesen, die wichtig sind für die Neurogenese, Genexpression, Zellproliferation und Zellüberleben im Neuroepithel 10-20. Proteomik Analysen von Mensch, Ratte, Maus und chick ECSF haben viele Proteine, die notwendig sein CSF-Funktion identifiziert. Dazu gehören Komponenten der extrazellulären Matrix, Apolipoproteine, den osmotischen Druck regulierende Proteine und Proteine in Zelltod und Proliferation 21-24 beteiligt. Jedoch sind die komplexen Funktionen des ECSF weitgehend unbekannt.
Wir haben ein Verfahren zum Entfernen von Zebrafisch ECSF Hirnkammern entwickelt, so dass für die Identifizierung des ECSF Komponenten und zur Analyse der ECSF Anforderung während der Entwicklung. Obwohl mehr ECSF aus anderen Wirbeltieren Systeme w gesammelt werdenith größeren Embryonen können ECSF von den frühesten Stadien der Zebrabärblingentwicklung gesammelt werden, und unter genetischen oder Umgebungsbedingungen, die zu abnormen Hirnventrikel Volumen oder Morphologie führen. Entfernen und Sammeln von ECSF ermöglicht für die massenspektrometrische Analyse, Ermittlung von ECSF Funktion, und die Wiedereinführung der ausgewählten Faktoren in die Ventrikel zu Assay ihre Funktion. So ist die Erreichbarkeit des frühen Zebrafischembryo ermöglicht eine detaillierte Analyse der ECSF Funktion während der Entwicklung.
Protokoll
Ein. Vorbereiten Mikroinjektion Needles and Cell Tram
- Füllen Eppendorf CellTram Öl Mikroinjektor Apparat mit Mineralöl nach den Anweisungen des Herstellers.
- Bereiten Mikroinjektion Nadeln durch Ziehen Kapillarrohre mit Sutter Instrumente Nadel abziehen.
- Montieren Nadel auf Mikromanipulator an Eppendorf CellTram.
- Vorsichtig brechen die Spitze der Nadel. Für eine gleichmäßige Größe der Spitze, mit einem Mikrometer messen oder vergleichen, um eine Referenz Nadel.
- Füllen Sie die Länge der Nadel mit Öl, mit dem CellTram Öl über die gesamte Länge zu schieben, dabei darauf achten, keine Blasen zu vermeiden.
2. Vorbereitung der Embryonen
- Stoßen Löcher in einem 1% Agarose-beschichteten Schale mit einem 1-200 ul Pipettenspitze und entfernen Agarose Steckern. Füllen Schale mit Embryo Medien (hergestellt nach Westerfield 25).
- Mit Pinzette dechorionate Embryonen unter Stereomikroskop.
- Übertragen dechorionated Embryonenin Agarose-beschichteten Gericht.
- Embryonen zu betäuben, fügen Tricaine (0,1 mg / ml) an Agarose Antenne, bis Embryonen bewegten Anschlag (hergestellt nach Westerfield 25).
3. Entleeren des ECSF
- Orient die Embryonen mit ihren Endstücken in den Löchern der Agarose und ihre hinteren Seiten am nächsten zu dem Mikromanipulator, so dass für die Visualisierung der dorsalen Seite des Gehirns.
- Positionieren Sie die Nadel am Rhombomer 0/1 Scharnier-Punkt oder der breitesten Stelle Hinterhirn Ventrikel (Abbildung 1A).
- Sorgfältig durchbohren Dachblech Rautenhirn Ventrikel sicher zu sein, um nicht durch die Tiefe des Gehirns in dem Eigelb zu gehen.
- Lassen Sie das ECSF mit dem CellTram sammeln und Flüssigkeit in Mikroinjektionsnadel. Seien Sie vorsichtig, um alle Zellen zu vermeiden.
4. Das Sammeln der ECSF für Composition Analysis
- Sobald die ECSF in der Nadel gesammelt wird, zu stoppen sorgfältig Absaugung aus dem CellTram.
- Move die Schale aus unter der Nadel und die Nadel genau positionieren zu einem Schlauch mit dem gewünschten Puffer.
- Mit dem CellTram, lassen Sie das ECSF aus der Nadel in den Puffer zu vermeiden versucht Verunreinigung der Lösung mit Öl.
- Um Zellen, die Sie haben zusammen mit dem ECSF, Spin ECSF bei 10.000 x g abgesaugt entfernen. Unberührten ECSF (Überstand) und bei -80 ° C bis zur weiteren Analyse zu sammeln.
5. Wiedereinführung der ausgewählten Faktoren
- Lassen Sie das ECSF alle 2 Stunden während der gewünschte Zeitintervall, da die Flüssigkeit in diesem Zeitraum wieder aufgefüllt wird. Zwischen Entwässerungszeit-Punkte, entfernen Sie die Nadel und bewahren die Embryonen bei 28,5 ° C oder Temperatur gewünscht wird.
- Legen zweiten Mikropipette Nadel mit Test-Faktor.
- Ort Nadel in den Mikromanipulator Mikroinjektorkopfs befestigt.
- Passen Injektionsvolumen bis 1 nl durch Messung der Tropfengröße in Öl und Einstellen Einspritzzeit und pressure.
- Inject 1-2 nl in Hirnkammern wie zuvor beschrieben 26.
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Ergebnisse
Ein Beispiel eines durchlässigen Hirnventrikel ist in 1B-C gezeigt. Hirnkammern sind zusammengebrochen, als sie ECSF (Abbildung 1B vs C) fehlt. Wie in dorsalen Bilder (1B-C und 2A-D) die Hinterhirn Neuroepithel macht behalten ihre charakteristische Morphologie und scheint trotz fehlender ECSF wahrscheinlich durch robuste Scharnier-Punkte offen gesehen. Allerdings zeigen Seitenansichten (Abbildung 2A'-D '), dass die Hinterhirn Ve...
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Diskussion
Die Verwendung dieser Technik, um manuell ablaufen ECSF vom Zebrafisch Hirnkammern nützlich sein wird für die Bestimmung der Voraussetzung für ECSF während der Entwicklung. Darüber hinaus wird diese Technik Beschreibung des ECSF Proteinprofil Laufe der Embryonalentwicklung ermöglichen. Identifizierung verschiedener Proteine während dieser Zeit ermöglicht genauere Ermittlung der Funktion des CSF und seine potenzielle Rolle während der Entwicklung des Gehirns. In Amnioten haben einige Faktoren ECSF (IGF2, FGF2, Retinsäu...
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der National Institute for Mental Health und der National Science Foundation unterstützt. Besonderer Dank geht an Dr. Jen Gutzman, Dr. Amanda Dickinson und anderen Sive lab Mitglieder für viele hilfreiche Diskussionen und konstruktive Kritik, und Olivier Paugois für Experten Fische Tierhaltung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenz | Firma | Katalog-Nummer | |
| Eppendorf CellTram Oil | Eppendorf | 516 000.025 | |
| Mineralöl | Sigma | M8410 | |
| Tricaine Pulver | Sigma | A5040 | |
| Kapillarrohre | FHC Inc. | 30-30-1 |
Referenzen
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