Eine Explantation Assay zur Beurteilung Cellular Verhalten des Cranial Mesenchym

Zusammenfassung

Der kraniale Mesenchym erfährt dramatischen morphogene Bewegungen, die wahrscheinlich stellt eine Antriebskraft für die Elevation der Neuralfalten ^1,2. Hier beschreiben wir ein einfaches Ex vivo Explantation Assay, um die zellulären Verhalten der Schädelbasis Mesenchym während Neurulation charakterisieren. Dieser Test hat zahlreiche Anwendungen, darunter gefügig zu sein pharmakologischen Manipulationen und Live-Imaging-Analysen.

Zusammenfassung

Das zentrale Nervensystem ist aus der Neuralplatte, die eine Reihe von komplexen Bewegungen morphogenetischen was zur Bildung des Neuralrohrs in einem Prozess als Neurulation bekannt erfährt abgeleitet. Während Neurulation wird Morphogenese des Mesenchym, das die Neuralplatte zugrunde vermutlich neuronalen fache Erhöhung fahren. Der kraniale Mesenchym wird der paraxialen Mesoderm und Neuralleistenzellen zusammen. Die Zellen des kranialen Mesenchym bilden eine pourous Maschenwerk von sternförmigen förmigen Zellen bestehen und Vermischung extrazellulären Matrix (ECM), die die Stränge Neuralfalten unterstützen. Während Neurulation erfährt das kraniale Mesenchym stereotypen Umlagerungen wodurch die Expansion und diese Bewegungen sind vermutlich eine Antriebskraft für neuronale zweifache Erhöhung bereitzustellen. Allerdings bleiben die Wege und zelluläre Verhaltensweisen, die kranialen Mesenchym Morphogenese fahren schlecht untersucht. Wechselwirkungen zwischen der ECM und den Zellen der kranialen Mesenchym zugrunde these Zelle Verhaltensweisen. Hier beschreiben wir ein einfaches ex vivo Explantat Assay entwickelt, um das Verhalten dieser Zellen charakterisieren. Dieser Assay ist änderbare zur pharmakologischen Manipulationen an der Signalwege beteiligt und Live-Imaging-Analysen seziert weiter zu charakterisieren das Verhalten dieser Zellen. Wir stellen eine repräsentativen Experiment demonstriert den Nutzen dieser Assay in der Charakterisierung der Eigenschaften des wandernden kranialen Mesenchym auf einer Vielzahl von ECM-Komponenten.

Einleitung

Neuralrohrschlusses auf dem Oberkopf tritt zwischen embryonalen Tag 8,5 (E8.5) und 9,5 im Maus-Embryo. Nichtbeachtung richtig schließen das Neuralrohr in den Kopf führt Anenzephalie, eine gemeinsame strukturelle Geburtsfehler beim Menschen und ist mit dem Leben unvereinbar. Die Kräfte, die cephalica Neuralrohrschlusses fahren werden sowohl aus dem Nervengewebe selbst und der umgebenden Epidermis und Mesenchym ³ erzeugt. Insbesondere Expansion des kranialen Mesenchym wird angenommen, dass die für Elevation der kranialen Neuralfalten ^1,2. Der kraniale Mesenchym ist reich an ECM Proteine ​​insbesondere glykosylierte Proteine ​​wie Heparinsulfat Proteoglykanen, Chondroitin Sulfate und Hyaluronat ^4-8.

Anders als in der Hühnerembryo wo Neuralleistenzellen vom dorsalen Neuralrohr auswandern nach Neuralrohrschlusses wandert die Neuralleiste im Mausembryo zugleich, dass die Neuralfalten zu r beginnenise (nach dem 5 Somiten-Stadium). Somit während Neurulation im Mausembryo wird die kraniale Mesenchym von Zellen aus der Neuralleiste und der paraxiale Mesoderm abgeleitet sind. Neuralleiste und paraxialen Mesoderm Populationen werden zu verschiedenen Zeiten in der Entwicklung induziert wird; lokalisiert in verschiedenen Stellungen im Embryo und in unterschiedliche Strukturen entwickeln ^9,10. Die paraxialen Mesoderm stammt aus dem Primitivstreifens und wandert auf die vordere Region des Embryos, um die mutmaßlichen Neuralplatte zugrunde liegen. Die Neuralleiste an der Verbindungsstelle der Neuralplatte und epidermalen Ektoderm induziert wird, erfährt eine epitheliale den Übergang Mesenchym und delaminiert unmittelbar vor neuronalen fache Erhöhung in der Nagetier Embryo. Neuralleistenzellen entlang stereotypes Pfade in der subectodermal paraxialen Mesoderm der Kiemenbogen, frontonasalen und periokulare Mesenchym migrieren. Die paraxialen Mesoderm wird, einige der Knochen des Schädels Gewölbe und Muskeln des Gesichts tragen, während the Neuralleiste auch auf andere Knochen des Schädels und des Gesichts neben Hirnnerven ^9-11 beitragen. Die paraxialen Mesoderm und Neuralleiste Linien kann unterschiedlich von der Mesp1-cre-und Wnt1-cre transgene Mauslinien bzw. ⁹ gekennzeichnet werden.

Die wesentliche Rolle der Schädelbasis Mesenchym in Neuralrohrschlusses hat aus Experimenten abgeleitet worden, wo die Behandlung von Nagetier Embryonen mit ECM stören Mittel wie Hyaluronidase, Chondroitinase ABC, Heparitinase oder Diazo-Oxo-Norleucin (DON) während Neurulation beeinträchtigt Neuralrohrschlusses ^{7, 12-14.} In diesen Versuchen zeigten histologische Analyse von statischen Abschnitten nach Neurulation zugeordnet dysmorphogeneis des kranialen Mesenchym ^7,12-14. Da jedoch die teratogene Mittel hatten Zugang zu mehreren Geweben, bleibt zu bestimmen, wenn der craniale Mesenchym wirklich das Zielgewebe werden. Zur Unterstützung der Schlussfolgerung, dass dieses Gewebeist für Neurulation wesentlicher erscheint die kranialen Mesenchym abnormale auf histologische Analysen in einigen Mausmutanten mit Exenzephalie ^15-17. Trotzdem in den meisten Fällen hat die Wirkung der Mutation auf die zelluläre Verhalten des kranialen Mesenchym nicht angegangen.

Wir haben eine ex-vivo-Assay Explantat direkt untersuchen die Folge genetischer Mutation oder pharmakologische Manipulation auf das Verhalten der kranialen Mesenchymzellen ¹⁵ ausgearbeitet. Dieser Assay ist ähnlich dem von Tzahor et al 2003 veröffentlicht das Differenzierungspotenzial der Schädelbasis Mesenchym zugreifen, unterliegt den Rhombomere ¹⁸ außer wir haben das Explantat Dissektion modifiziert, um die Migration von mehr anterioren Populationen von kranialen Mesenchym Studie, dass die vorderen neuralen unterliegen Platte. Unsere Methode ist auch eine Änderung der Explantat Assays im Hühnerembryo durchgeführt, um das Zugverhalten der Neuralleiste mit ke zu analysiereny Unterschiede. Vorherige Vorbereitungen der Neuralleiste oder weiter hinten paraxialen Mesoderm ^19,20 explantiert. Darüber hinaus während der neuronalen fache Erhöhung im Hühnerembryo hat die Neuralleiste noch nicht emigriert aus dem dorsalen Neuralrohr und damit Explantate des vorderen paraxialen Mesoderm getroffen würden nicht enthalten Neuralleistenzellen. In unserem Assay werden kranialen Mesenchym bestehend aus Explantaten paraxialen Mesoderm, Neuralleiste und Ektoderm Oberfläche hergestellt und auf einem Substrat plattiert. Experimentelle Manipulation einschließlich Isolierung von Explantaten aus genetische Mutanten Plattieren Explantate auf verschiedene ECM oder pharmakologische Behandlungen durchgeführt werden kann. Zellen aus dem Explantat, und der Abstand, die Anzahl und das Verhalten migrieren können analysiert und verglichen werden zwischen den Behandlungsgruppen. Darüber hinaus ist diese Zubereitung änderbare Analysen der zellulären Migration von Live-Imaging-Techniken. Nach der Migration Experiment kann Explantate fixiert und unterworfen werden immunhistochemische Analysen zu PelzTher erläutern die Wirkung der Behandlungen. Im Großen und Ganzen ist das Protokoll präsentiert hier eine einfache ex vivo Test, um das Verhalten der Schädelbasis Mesenchym untersuchen. Als ein repräsentatives Experiment nutzen wir dieses Assays, um die Migration von kranialen Mesenchym auf unterschiedlichen extrazellulären Substrate untersuchen.

Protokoll

Ein. Vorbereitung des ECM Coated Kulturschalen oder Deckgläser

1. Bereiten ECM Stammlösung durch Auflösen ECM Substrat in PBS (Dulbecco Saline, Invitrogen, # 14040-133 Phosphate-Buffered). Filter mit einem 0,2 mm Spritzenfilter (VWR, # 28145-495) und frieren in Aliquots bei -80 ° C.
2. Verdünnen ECM Stammlösung in PBS auf die gewünschte Konzentration. Für MaxGel, in DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium, Invitrogen, # 11.995-065) verdünnen.
3. Wenn Immunfluoreszenz durchgeführt werden, sterilisieren 12 mm runde Deckgläschen (VWR, # 89015-724) durch Eintauchen in Ethanol und an der Luft trocknen. Dies sollte in der sterilen laminaren Haube erfolgen. Wenn Immunfluoreszenz nicht durchgeführt werden skip to 1,5 fort.
4. Ort sterilisiert Deckgläsern in jede Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen (Corning, # 3526).
5. 0,5 ml des verdünnten Substratlösung zu jeder Vertiefung der 24-Well-Platte und Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 Stunden.
6. Absaugen der ECM-Lösung und waschen three-mal in PBS.
7. Absaugen PBS und sofort verwenden oder eingewickelt in Parafilm und bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen.

2. Vorbereitung der Dissection Werkzeuge

Sylgard Platten mit zusätzlichen Aktivkohle pro dem Protokoll des Herstellers vorbereitet. Die widerstandsfähige schwarzem Hintergrund dieser Platten bietet Unterstützung für Pinning sich der Embryo und die Farbe besticht durch guten Kontrast, die Visualisierung des transluzenten Embryos ermöglicht.

1. Um Platten herzustellen wiegen direkt in eine Tri-gießen Becherglas auf einer Waage 150 g Teil A 15 g flüssigen Teil B und 1 g Holzkohle Pulver (World Precision Instruments, # SYLG184). Mischen Sie mit einem Holz popsicle-Stick oder Zungenspatel. Pour in Glas oder Kunststoff 100 cm Gerichten. Verwenden Sie einen kleinen Butanbrenner etwa 10 bis 12 Zentimeter über dem Geschirr zu verbrennen keine Blasen statt. Ort Deckel auf Teller und lassen Sie sich für mindestens 24 Stunden zu setzen.
2. Um Sektionsinstrumenten Einsatz einer Minutien pin vorzubereiten (0,1 mm Durchmer) in einem Stifthalter (Fine Wissenschaftliche Werkzeuge, # und # 26.002-10 26.018-17 jeweils) alternativ 26 Gauge Nadeln (BD, # 309.597) abgekröpften mit Hilfe von Zangen können als Sezieren Instrumente verwendet werden. Geschärften Studenten Dumont Nr. 5 Pinzetten (Fine Science Tools, # 91150-20) mit einem Schleifstein (Fine Scientific Tools, # 29008-22).
3. Sterilisieren alle Sektionsinstrumenten mit 70% Ethanol vor dem Gebrauch.

3. Sammlung von Embryos

1. Euthanize die zeitgesteuerte schwangere Maus auf 8,5 Tage post coitum nach Tiernutzung Ausschuss Vorschriften und entfernen Gebärmutter.
2. Ort Uterus in einer Kunststoff-Petrischale mit sterilem PBS.
3. Waschen Gebärmutter einmal mit sterilem PBS.
4. Unter einem Dissektionsmikroskop vorsichtig Embryo aus Deciduas mit einer Pinzette.
5. Entfernen extraembryonalen Membranen und speichern zur Genotypisierung, wenn nötig.
6. Embryo durch Zählen Somiten. Die idealen Stufen zu machen Explantate auf zellulärer beh analysierenAvior während der neuronalen fache Erhöhung würde zwischen den 6 und 10 Somiten Stadien, wenn die Neuralfalten fangen gerade erst an zu erheben und vor dem großen Morphogenese des kranialen Mesenchym erfolgt sein.
7. Waschen Embryo in PBS. Platz in einem schwarzen Sylgard Platte mit DMEM, die keine Phenolrot (Invitrogen, # 21063-029) enthält. Entfernen Sie die extraembryonalen Membranen und speichern zur Genotypisierung, wenn nötig.

4. Herstellung Explantate

1. Refokussieren des Mikroskops mit der höchstmöglichen Vergrößerung über den Kopfbereich des Embryos.
2. Schneiden Sie mit einem Dissektion Nadel in jeder Hand. Verwenden Sie eine Nadel, um das Gewebe an Ort und Stelle und die anderen halten, um Schnitte zu machen.
3. Schneiden Sie den Kopf des Embryos ventral der Rhombomere.
4. Schneiden Sie entlang der Mittellinie, um den Kopf in zwei gleiche Hälften halbieren.
5. Cut um den äußeren Rand des Kopfes und Mittellinie. Diese Kürzungen werden die premigratory Kamm und Oberfläche Ektoderm am äußeren Rand zu entfernen undDie Prächordalplatte an der Mittellinie. Die restlichen Gewebe wird das Explantat und wird die Migration kranialen Neuralleiste, paraxialen Mesoderm und Oberfläche Ektoderm enthalten.
6. Da das Gewebe geschnitten wird, entfernen Sie seziert Schutt aus der Schale mit einer sterilen Pasteurpipette. Dies verhindert Verwechselns des Explantats mit dem seziert Schutt.
7. Vorsichtig waschen das Explantat durch Pipettieren nach oben und unten mit einem 20 ul Pipettenspitze und Pipetman. Dadurch werden lose anhaftenden Zellen und verhindern gezackten Kanten an den Explantaten.
8. Sorgfältig abholen jedes Explantat in etwa 10 ul der Flüssigkeit mit einem 20 ul Pipettenspitze und Pipetman und Platz in der Mitte des beschichteten Kultur gut.
9. Fügen Sie 20 ul Kulturmedium mit 15% FBS ergänzt das Explantat decken.
10. Die Platte in einer befeuchteten Gewebekultur-Inkubator (5% CO _2, 37 ° C) für 1-2 h, damit das Explantat in dem Boden der Schale zu befestigen. Kommen periodisch sicherzustellen, dass das Explantat nicht austrocknetout.
11. Wenn das Explantat angehängt wurde, sorgfältig zu jeder Vertiefung 250 ul DMEM mit 10% FBS ergänzt, die auf 37 ° C im Wasserbad erwärmt wurde hinzuzufügen. Sobald Explantate angeschlossen haben sie sich nicht bewegen, wenn die Platte wird sanft unter dem Mikroskop erschüttert.
12. Zurück Gericht zu Gewebekultur-Inkubator.
13. Nach 24 Stunden werden die Explantate fest angebracht werden und die Zellen beginnen zu emigrieren. Zu diesem Zeitpunkt pharmakologische Mittel können zu den Medien zugegeben werden.
14. 48 Stunden nach dem Ausstreichen, werden Zellen aus den Explantaten gewandert sind. Der Abstand migriert werden können visualisiert werden und abgebildet. Wir in der Regel an die Kultur an dieser Stelle seit Explantate auf Anzeichen einer geringeren Rentabilität mit längeren Inkubationen zeigen beginnen. Ein Vitalfarbstoff wie Acridinorange oder Trypanblau kann auch zur Lebensfähigkeit des Explantats zu überprüfen.
15. An dieser Stelle erworbenen Bilder können, um den Abstand und die Anzahl der Zellen, die aus dem Explantat migrieren dokumentieren. Alternativ wurden, wenn Explantate auf Deckgläsern ausplattiert,sie festlegbar und immunhistochemischen Analysen durchgeführt, um Proteine ​​von Interesse zu visualisieren.

Kritischen Schritte in dem Protokoll

1. Geschnitten Explantaten von ungefähr der gleichen Größe.
2. Löschen Sie alle Dissektion Schutt vor der Zerlegung Platte wie Sie sezieren zu verwirrenden Schmutz mit dem gewünschten explantierten Gewebe zu vermeiden sind.
3. Wenn plating Explantate in Brunnen oder auf Deckgläsern sicher sein, Tröpfchengröße von Medien mit Explantat Platz in der Mitte der gut.
4. Lassen Explantation genügend Zeit, um vor Überschwemmungen die gut mit den Medien zu befestigen.
5. Behandlungsbedingungen sollten standardisiert werden für jeden Test Substrat und pharmakologische Mittel verwendet.
6. Zwei Explantate können von jedem Embryo gemacht werden (eine aus der linken und eine von rechts der Neuralrohr).
7. Wenn die Ermittlung der Migration von Zellen aus mutante Mauslinien unter verschiedenen experimentellen Bedingungen, legte eine Mutante Explantat in der Kontrollgruppe und der andere in der behandelten Gruppe.

Fehlerbehebung

1. Wenn Explantate zu befestigen scheitern, erhöhen die Redezeit für die Befestigung. Nach unserer Erfahrung haben etwa die Hälfte der Explantate nicht anhängen und größere Explantate effizienter zu halten.
2. Wenn Explantate auf die Peripherie des Bohrlochs legen sie wird schwer zu Bild. Achten Sie darauf, Explantate in der Mitte des Brunnens platzieren.
3. Idealerweise Explantaten wird etwa gleich groß sein. Trotzdem können Abweichungen in Explantat Größe für die Verwendung der Durchmesser der Explantate als Korrekturfaktor bei quanitating Migrationen von Zellen aus Explantaten korrigiert werden.
4. Wenn Kontamination sicher sein, sterile Arbeitsbedingungen benutzt werden. Alle Werkzeuge und Oberflächen sollten mit 70% Ethanol sterilisiert werden. Pipetten und Petrischalen sollten neu und steril.
5. Wenn Explantate immer verloren sind während der Präparation, in regelmäßigen Abständen zu entfernen Schmutz zu verhindern verlieren Explantat.
6. Mastering the Dissektion ist zeitaufwendig und erfordert Übung. Optimal Vergrößerung scharfe Dissektion Werkzeuge und Nadeln Hilfe.

Ergebnisse

Das Auftreten von Zellen Migration von kranialen Mesenchym Explantaten ist in Abbildung 2 gezeigt. Wir testeten Migration auf verschiedene ECM Substrate, die in der kranialen Mesenchym während Neurulation einschließlich Fibronectin (100 mg / ml, Sigma # F1141) sind, Laminin (100 mg / ml, Sigma # L2020), MaxGel ECM (1:500 Verdünnung in DMEM , Sigma # E0282) und Hyaluronsäure (1 mg / ml, Sigma, # 53747). Cells nicht migrieren aus dem Explantat wenn kein ECM vorhanden ist (Daten nicht gezeigt) und alle getesteten Substrate unterstützt die Migration der Zellen. Sowohl die Form als auch die Größe der Zellen, die aus den Explantaten migrieren hängt von dem Substrat. Dies wird erwartet, da frühere Studien belegen, dass die mechanischen Kräfte, die durch Wechselwirkung von Zellen mit verschiedenen ECM erzeugt sowohl die wandernde Form und Eigenschaften der Zellen ²¹ zu beeinträchtigen.

Abbildung 1. Vorbereitung der Explantate. (A) Um Explantate vorzubereiten, werden E8.5 Embryonen aus Deciduas und extraembryonalen Gewebe seziert. (B) Embryo Köpfe von dem Körper zu den anterioren Rhombomere seziert. Explantate werden durch Entfernen von Gewebe aus der Mittellinie und den Außenkanten des Kopfes um die prächordalen Platte an der Mittellinie und dem premigratory Neuralleiste und Ektoderm Oberfläche an der Grenze zu entfernen, jeweils hergestellt. (C) Explantate werden durch Wegschneiden Gewebe aus den Mittellinie und äußeren Kanten des Kopfes, um das prächordalen Platte an der Mittellinie und dem premigratory Neuralleiste und Ektoderm Oberfläche an den Grenzen entfernen hergestellt. (D) Explantate werden in einem kleinen Volumen von Medien auf ECM beschichteten Schalen / Deckgläschen gelegt und dürfen vor der Zugabe von mehr Medien anzubringen.

Abbildung 2. Migration der kranialen Mesenchymzellen aus Explantaten auf verschiedenen Substraten ausplattiert. Explantate wurden auf Fibronectin, Laminin, MaxGel ECM oder Hyaluronsäure ausplattiert und fotografiert nach 48 h in Kultur. Größe bar = 200 mm.

Diskussion

Verfahren angewendet hier stellt eine leistungsfähige Assay, um das Verhalten von kranialen Mesenchymzellen untersuchen. Zusätzlich zu den statischen hier vorgestellten Analysen leben Imaging Experimente im Hellfeld oder in Kombination mit Expression von GFP-markierten Proteine ​​können verwendet werden, um das Verhalten der Zellen in Echtzeit prüfen, da sie migrieren aus dem Explantat werden. Für Echtzeit-Bildgebung Experimenten konnte Explantate mit DiI markiertem oder zur Migration von Neuralleiste aus der paraxialen Mesoderm, ROSA-YFP differenzieren; Mesp1-Cre oder ROSA-YFP; Wnt1-Cre oder anderen transgenen Linien verwendet werden könnten. Cranial Mesenchym-ECM-Interaktionen können ebenfalls untersucht Verwendung dieses Explantat Assay werden. Hier Platte Explantate auf verschiedene ECM Substrate, die in der kranialen Mesenchym zu zeigen, dass Zellen auf diese unterschiedlich stark migrieren und dass das ECM beeinflusst die Morphologie der Zellen sind. Weiterhin können Explantate in einer dreidimensionalen Matrix eingebettet sein, das Verhalten von Cel zugreifenls in diesem Kontext. Das Explantat Assay ist änderbare zur Analyse der Wirkung von genetischen und pharmakologischen Manipulationen am kranialen Mesenchym Verhaltensweisen intrinsische und extrinsische Cues, zu regulieren und zu modifizieren Migration zu analysieren. Zum Beispiel verwendeten wir diesen Assay in unseren Studien, um die Rolle von überschüssigem Hsp90 Sekretion in den anormalen zellulären Verhalten in Hectd1 Mutante kranialen Mesenchym ¹⁵ erkennen. In diesen Experimenten, behandelten wir Explantate mit anti-Hsp90-Antikörper, Hsp90-Protein, Geldanamycin und DMA (dimethyl amelioride), um die Sekretion von Hsp90 zu demonstrieren, dass das abnormale Verhalten Hectd1 Mutantenzellen durch überschüssige extrazelluläre Hsp90 ¹⁵ ist blockieren. Ähnliche Ansätze könnten verwendet werden, um pharmakologisch sezieren zusätzliche Wege zugrunde normal oder abnormal Morphogenese des kranialen Mesenchym werden. Sobald der Test abgeschlossen ist, können Explantate und wandernden Zellen durch eine Vielzahl von Methoden analysiert werden. Beispielsweise immunhistochemischen Analysen cein Arbeitnehmer zur Lokalisierung von Proteinen entscheidend für Zellbewegungen untersuchen. Transkriptom-Analysen könnten auch eingesetzt werden, um festzustellen, wie Behandlungen Genexpression beeinflussen.

Ein wesentlicher Nachteil dieser Technik ist, dass dies nicht der Fall Modells Verhaltensweisen in drei Dimensionen, wie sie in vivo auftreten würde. Modifikation des Protokolls wo Explantaten in einer dreidimensionalen Matrix (zB Matrigel) zusammen mit Expression an fluoreszierendem Protein markierte zelluläre Kompartimente eingebettet könnten verwendet notwendig, um dieses Problem anzugehen. Auch wenn diese Änderungen durchgeführt wurden, würde zu weiteren Experimenten Verhaltensweisen in dieser ex vivo-Assay mit denen in vivo gesehen korrelieren notwendig sein. Weitere Einschränkungen umfassen die große Anzahl von Embryonen erforderlich ist, um eine ausreichende Anzahl an statisch wesentliche Daten zu erzeugen erzeugen. Am wichtigsten ist, die Zerlegung relativ einfach ist, erfordert es der Praxis zu meistern.