Adenovirus-Partikeln wurden entwickelt, um entweder die unnatürliche Aminosäure analogen azidohomoalanine oder die Azido Zucker enthalten O-GlcNAz. Die Azidgruppe eines jeden wird chemoselektiv über "Klick"-Chemie Reaktionen als mittels viraler Oberflächenmodifizierung ligiert.
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Methodenartikel
Chemoselektive Modifizierung von Oberflächen durch Viral Bioorthogonale Click-Chemie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Modifikation von Viruspartikeln ist eine signifikante Menge an Aufmerksamkeit für die ein enormes Potenzial für ein Aufschlagen Gentherapie, onkolytischen Anwendungen und die Entwicklung von Impfstoffen erhalten. 1,2,3 Aktuelle Ansätze zur Modifizierung viralen Oberflächen, die meist Genetik-basiert sind, oft von der Dämpfung leiden Virus-Produktion, Infektiosität und zellulären Transduktion. Mit 4,5 chemoselektive Klick-Chemie, haben wir eine einfache alternative Methode, die diese Probleme umgeht, während verbleibenden hoch flexibel und zugänglich entwickelt. 1,2
Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Wirksamkeit der Verwendung bioorthogonalen Click-Chemie, die Oberfläche des Adenovirus Typ 5-Teilchen zu modifizieren demonstrieren. Dieses zweistufige Verfahren kann sowohl therapeutisch 1 oder analytisch 2,6 verwendet werden, wie es für die chemoselektive Ligation von Targeting-Moleküle, Farbstoffe oder andere Moleküle von Interesse erlaubt an Proteinemit Azid-Tags voretikettiert. Die drei wichtigsten Vorteile dieser Methode sind, dass (1) metabolische Markierung wenig bis gar keine Auswirkungen auf die virale Fitness, 1,7 demonstriert (2) eine breite Palette von Effektor-Liganden können verwendet werden, und (3) Es ist bemerkenswert schnelle, zuverlässige und einfach zu erreichen. 1,2,7
Im ersten Schritt dieses Verfahrens werden Adenoviruspartikel hergestellt trägt entweder azidohomoalanine (Aha, ein Methionin Surrogat-) oder die unnatürliche Zucker O-verknüpfte N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), die beide das Azid (N-3) funktionelle Gruppe. Nach der Reinigung der azidmodifizierten Viruspartikel, wird ein Alkin Sonde, die die fluoreszierende TAMRA-Einheit in einem chemoselektive Weise wie die Vor-markierte Proteine oder Glykoproteine ligiert. Schließlich wird eine SDS-PAGE-Analyse durchgeführt, um die erfolgreiche Ligation von der Sonde auf der viralen Capsidproteine zu demonstrieren. Aha Inkorporation wird gezeigt, dass alle Viruskapsids beschriftenProteine (Hexon, Penton und Fiber), während die O-Aufnahme resultiert in GlcNAz Kennzeichnung von Fiber nur.
In diesem sich entwickelnden Gebiet, haben mehrere Methoden für die Azid-Alkin-Ligation erfolgreich entwickelt, jedoch nur die beiden haben wir festgestellt, dass die bequemste haben werden hier gezeigt - Dehnungs-Azid-Alkin-Cycloaddition (SPAAC) und Kupfer-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) unter Sauerstoff befreiten Atmosphäre.
Protokoll
Siehe Tabelle 1 für die Herstellung von allen Medien, Puffer und Lösungen in diesem Protokoll verwiesen wird.
1. Die Produktion von Aha-markierten Adenovirus
- Planen elf 100-mm-Gewebekulturschalen von humanen embryonalen Nierenzellen (HEK 293) in HEK 293-Zelle Wachstumsmedium gehalten (siehe Tabelle 1) bei 37 ° C, bis sie 80 erreicht haben, - 90% Konfluenz gezüchtet. (Hinweis:. Kulturen mit mehr als 90% Konfluenz kann es schwierig sein zu infizieren und kann nicht zu Viren wie gewünscht)
- Lösen der Zellen in einer der Schalen, indem zunächst das Wachstumsmedium, einmaligem Spülen mit 5 ....
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Diskussion
Die Entwicklung der chemoselektiven und bioorthogonale Click-Reaktionen, einschließlich derer von Aziden, ist eine sich schnell entwickelnde Gebiet der Forschung, und anschließend gibt es eine wachsende Zahl dieser Reaktionen aus für Biokonjugation Anwendungen wählen. Wir haben den Rahmen dieses Protokoll darauf beschränkt, nur zwei Methoden, die wegen ihrer Nützlichkeit in unserem eigenen Labor und kommerzielle Verfügbarkeit aller Reagenzien wurden so gewählt sind.
In der ersten solchen Rou.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Wir möchten die NSF für die Finanzierung (CBET-0846259) anerkennen.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | |
| Adenovirus Typ 5 (Ad5), die ein GFP-Transgen | BCBC | 391 | |
| Menschliche embryonale Nieren (HEK 293-Zellen) | ATCC | CRL-1573 | |
| Dulbecco modifiziertes Eagle Medium (DMEM), hohe Glucose | Invitrogen | 11965-092 | |
| Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, kein Methionin, Cystein nicht (DMEM-Met / Cys-), High Glucose | Invitrogen | 21013-024 | |
| Rinderkalbserum | Invitrogen | 16170-078 | |
| Penicillin - Streptomycin 100 × Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 | |
| 0,5% Trypsin-EDTA (10 ×) | Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 mm Zellkulturschale, Gewebekultur-behandelte Polystyrol | BD Falcon | 353003 | |
| Zellkultur CO 2-Inkubator | |||
| Hämozytometer | |||
| Biosicherheitswerkbank | |||
| Sterile Spritze Filter (0,2 mu m, Celluloseacetat) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europa) | |
| Avanti JE Zentrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Konischen Röhrchen (50 ml, steril) | BD Falcon | 352098 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13,2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 | |
| Ultrazentrifugation ausgestattet mit einem SW 41 und SW 60 Rotor | Beckman | ||
| Biopur Safe-Lock Reaktionsgefäße, 1,5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 | |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | 5418 | |
| Centri-Sep Gelfiltration Spin Columns | Princeton Separations | CS-901 | |
| Sterile Nadel 18 Gauge | |||
| Stickstoff Glovebag (wenn desoxygenierten CuAAC durchgeführt werden soll) | |||
| Dewar-Gefäß | |||
| Flüssiger Stickstoff | |||
| Elektrophorese-Zelle | |||
| Fluoreszenzgel Scanner | |||
| Ready Gel Tris-HCl-Gel | Bio-Rad | 161-1105 | |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 | |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | ||
| Peracetylierten N-azidoacetylgalactosamine (AC 4 GalNAz) | Invitrogen | C33365 | |
| Thermo Scientific | 88905 | ||
| Sigma-Aldrich | A7480 | ||
| Bathophenanthrolindisulfonsäure (BDA) Dinatriumsalz | MP Biomedicals | 0215011201 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | |||
| Methanol | |||
| Tris-Base (Tris (hydroxymethyl) aminomethan) | |||
| Dinatriumphosphat (Na2 HPO 4) | |||
| Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) | |||
| 1 M HCl | |||
| Glycerin | |||
| Rinderserumalbumin | |||
| L-Cystein | |||
| L-Methionin | |||
| SDS (Natriumdodecylsulfat) | |||
| 2-Mercaptoethanol | |||
| Glycine | |||
| Bromphenolblau | |||
| Cäsiumchlorid (CsCl) | & Nbsp; | ||
| Kupfer (I) bromid (CuBr) | |||
| Calciumchlorid (CaCl 2) | |||
| Kaliumchlorid (KCl) | |||
| Magnesiumchlorid (MgCl 2) | |||
| Natriumchlorid (NaCl) | |||
| Alkin-Sonde für CuAAC * | |||
| TAMRA Alkin | Invitrogen | T10183 | |
| Gespanntes Alkin-Sonde für SPAAC * | |||
| TAMRA DIBO Alkin | Invitrogen | C10410 |
* Bekannte Anbieter von Klick-Chemie Reagenzien und Kits beinhalten Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click-Chemie-Tools, und baseclick. Eine Vielzahl von Alkin Farbstoffe und Targeting-Liganden können in diesen Anbietern 'Katalogen.
Referenzen
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells. J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).
- Banerjee, P. S., Carrico, I. S.
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Nachdrucke und Genehmigungen
