Verwendung LysoTracker zum programmierten Zelltod in Embryonen Erkennen und Differenzieren embryonalen Stammzellen

Zusammenfassung

Wir stellen eine einfache Protokoll zu Bereichen programmierten Zelltod (PCD) in Mausembryonen und Differenzieren embryonalen Stamm (ES)-Zellkulturen unter Verwendung eines gut löslichen Farbstoff genannt LysoTracker visualisieren.

Zusammenfassung

Der programmierte Zelltod (PCD) bei Erwachsenen mit normalem Gewebe Homöostase und während der Embryonalentwicklung von Geweben und Organen ^1,2,6,7 gestalten. Während der Entwicklung können giftige Chemikalien oder genetische Veränderungen zu einer erhöhten PCD oder ändern PCD-Muster, was zu Entwicklungsstörungen und Missbildungen ^3-5. Um die Ätiologie dieser Defekte zu verstehen, kann die Studie von Embryonen mit in-vitro-Assays, die Differenzierung embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) verwendet ergänzt werden.

Apoptose ist ein gut untersuchtes Form PCD die sowohl intrinsischen und extrinsischen Signalisierung an die Caspase Enzymkaskade aktivieren beinhaltet. Charakteristisch Zellveränderungen sind Membran blebbing, nukleare Schrumpfen und DNA-Fragmentierung. Andere Formen von PCD nicht verbunden Caspaseaktivierung und kann das Endergebnis der verlängerten Autophagie sein. Unabhängig von dem PCD-Weg, müssen sterbenden Zellen entfernt werden. Bei Erwachsenen, die Immunzellen perform diese Funktion, während in Embryonen, bei denen das Immunsystem ist noch nicht entwickelt, tritt Entfernung durch einen alternativen Mechanismus. Dieser Mechanismus beinhaltet benachbarten Zellen (so genannte "nicht-professionellen Phagozyten") die Übernahme einer phagocytic Rollenspiel erkennen sie die "eat me"-Signal auf der Oberfläche des sterbenden Zelle und verschlingen es ^8-10. Nach engulfment wird der Schmutz in den Lysosomen zum Abbau gebracht. Somit unabhängig von PCD-Mechanismus kann eine Erhöhung in lysosomalen Aktivität mit erhöhter Zelltod korreliert werden.

Um PCD, eine einfache Assay Lysosomen in dicken Geweben und mehrschichtigen differenzierenden Kulturen visualisieren studieren können nützlich sein. LysoTracker Farbstoff ein hochlöslich kleines Molekül, das in saurer subzelluläre Kompartimente wie Lysosom ^11-13 gehalten wird. Der Farbstoff wird durch Diffusion und durch den Verkehr gezogen. Da Penetration ist kein Hindernis, Visualisierung von PCD in dicke Gewebe und Multi-Layer-Kulturen möglich ist ^12,13 14, um kleine Proben, histologischen Schnitten und Monoschichtkulturen begrenzt, da das Verfahren erfordert die Eingabe / Permeabilität einer terminalen Transferase.

Im Gegensatz zu Anilinblau, die und diffundiert wird durch Lösungsmittel gelöst ist LysoTracker Red DND-99 fixierbar, hell und stabil. Färbung visualisiert werden können mit Standard-Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskopie in whole-mount oder Abschnitt mit einem wässrigen oder lösemittelhaltigen Eindeckmittel ^12,13. Hier beschreiben wir Protokolle mit diesen Farbstoff an PCD in Normal-und Sonic-Hedgehog null Maus-Embryonen zu suchen. Darüber hinaus zeigen wir, Analyse von PKD bei der Differenzierung von ES-Zellkulturen und präsentieren eine einfache Quantifizierung Methode. Zusammenfassend kann LysoTracker Färbung eine großartige Ergänzung zu anderen Methoden zur Erkennung PCD sein.

Protokoll

Ein. LysoTracker Färbung muriner Embryonen

1. Generieren Maus-Embryonen, indem jungen (5-6 Wochen alt) Weibchen in Außengewindebolzen Käfigen. Überwachung am folgenden Morgen für das Auftreten eines Vaginaltampon anzeigt, dass das Zusammenfügen aufgetreten. Wenn die Frau schwanger ist, wird mittags an diesem Tag als 0,5 dpc (Tage nach Koitus). Das hier vorgestellte Verfahren ist ideal für Embryonen 7-13 dpc.
2. Auf der embryonalen Tag von Interesse, einschläfern den weiblichen nach anerkannten Protokollen und entfernen die Gebärmutter. Entfernen Sie die Embryos aus dem decidua in einer 10 cm-Petrischale mit Hanks BSS (ohne Phenolrot). Entfernen Sie die extra-embryonalen Membranen und müssen mindestens eine Spülung mit Hanks BSS auf fremde Gewebe und Blut zu entfernen.
3. Bereiten LysoTracker Embryo Färbelösung (5 mM LysoTracker in Hanks BSS). Eine angenehme Lautstärke für 1-2 Würfe beträgt 5 ml. Vorsichtig mischen, um den Farbstoff gleichmäßig auszuzahlen.
4. Fügen Embryonen in die LysoTracker Embryo Färbung SolutIonen in einem Mikrozentrifugenröhrchen oder Fläschchen und bei 37 ° C für 45 min.
5. Spülen Sie sehr vorsichtig in Hanks BSS viermal, jeweils 5 min waschen.
6. Fix in 4% Paraformaldehyd über Nacht.
7. Spülen Sie einmal in Hanks BSS, 10 min, um das Update zu entfernen.
8. Dehydratisieren durch eine Reihe Methanol (50%, 75%, 80%, 100%, 5 min pro Schritt) zu Hintergrundfärbung zu eliminieren. Dies ist zur Erzielung eines guten Signal-zu-Rauschen während der Bildgebung wichtig.
9. An dieser Stelle können Sie die Embryos Proben auf unbestimmte Zeit speichern in Methanol bei -20 ° C, vor Licht geschützt.

Hinweis: Eine Gewebeprobe zu jeder Schritt für DNA Genotypisierung genommen werden kann, jedoch kann es am bequemsten, um eine Probe nur vor der Lagerung zu nehmen, so daß bis zu diesem Schritt sämtliche Proben kann chargenweise verarbeitet. Sammle eine Gewebeprobe aus dem Schwanz, Körper oder Kopf von jedem Embryo und legte alles in getrennten Röhren. Rehydrieren der Gewebeprobe und zur Vorbereitung genotyping.

2. LysoTracker Färbung von Differenzierung ES Kulturen

1. Bereiten Embryoidkörpern über die Hanging Drop Methode ¹⁵ mit einem Startpreis Dichte von 500 Zellen pro 20 ul Tropfen.
2. Nach 3 Tagen, übertragen Sie die embryoid Gremien Suspensionskultur auf 10 cm nichthaftenden Petrischalen (dh diejenigen, für die bakteriologische Arbeit verwendet). Kultur für 5 Tage, Wechsel der Datenträger alle 2 Tage.
3. Am Tag 7, übertragen Sie die embryoid Gremien gelatinierte 8-well chamber slides (mit 0,1% Gelatine zu den Kammern, warten Sie 5 min, entfernen und hinzufügen, Medien). Übertragen 1-2 Embryoidkörpern pro Kammer.
4. Kultur für 10 Tage, wechselnden Medien jeden zweiten Tag. Seien Sie vorsichtig, um die Pipette an der Ecke der Kammer Rutsche so zu platzieren, um nicht stören die Embryoidkörper Befestigung an der Glasoberfläche. Auch wenn Zugabe von frischem Medien auch legen Sie die Pipette in die Ecke der Kammer und lassen die Medien langsam.
5. Nach 10 Tagen des Kultsure, die Apoptose als eine positive Kontrolle zu induzieren, behandeln einige der Wells mit 0,1 mM und 1,0 mM H ₂ O ₂ (fügen Sie den H ₂ O ₂ an die frische Medien, Mischung, dann zu den Zellen hinzu) für 60 min. Spülen zweimal mit D-PBS und Kultur über Nacht in regelmäßigen Medien.
6. Vorsichtig absaugen bestehenden Medien und fügen LysoTracker Zellfärbung Lösung (500 nM LysoTracker (Endkonzentration) in den Medien, 300 ul pro Kammer).
7. Bei 37 ° C für 15 min.
8. Spülen zweimal mit D-PBS 2 mal, jeweils 5 min.
9. Fix in 4% Paraformaldehyd für 15 min bei RT.
10. Spülen zweimal mit D-PBS, 5 min.

3. Anzeigen LysoTracker Stained Embryos oder ES Kulturen

1. Planen der Zellproben für die Mikroskopie durch Ansaugen des D-PBS; Entfernen der Kammer aus der Folie; Lufttrocknung für etwa 5 min, und dann Zugabe einer wässrigen Eindeckmedium (Vectashield mit DAPI oder ähnliches). Legen Sie eine Folienbarriere während drying zu verringern Bleichen des Fluorophors. Montieren Embryonen in einer tiefen Depression Glasschale oder kleine Petrischale in Vectashield oder ähnliches.
2. Visualisieren Sie mit einem sezieren oder zusammengesetzte Mikroskop mit einem Rhodamin oder Texas Red-Filter ausgestattet (LysoTracker RED DND-99, Anregung / Emission: 577/590 nm). Die Färbung ist in der Regel recht hell, so lange Belichtungszeiten sind in der Regel nicht erforderlich.

4. Die Quantifizierung der Ergebnisse mit bildgebenden Verfahren

1. Machen Sie digitale Fotos von Ihren Proben unter den gleichen Expositionsbedingungen im manuellen Modus.
2. Öffnen Sie die Bilder in Adobe Photoshop oder einem ähnlichen Imaging-Programm. Um die Menge an LysoTracker Färbung zu bestimmen, auszuwählen und den roten Kanal Schwellenwert das Bild (wandelt das Bild in Schwarz-weiß), so dass die rote Färbung nunmehr durch weiße Pixel repräsentiert. Wählen Sie die weißen Pixel und verwenden Sie die Histogramm-Funktion, um die Gesamtzahl zu erhalten.
3. Verwenden Sie den blauen Kanal zu zählendie Anzahl von Kernen in dem Feld. Es kann nützlich sein, um eine Aufzeichnung der Anzahl von Annotation das Bild zu halten.
4. Notieren Sie die Werte und berechnen dann die durchschnittliche Färbung level pro Zelle. Wiederholen Sie diese Analyse mit dem gleichen Schwellenwert-Einstellung für alle Bilder, die Sie probieren.

5. Repräsentative Ergebnisse

Es ist ein normales Muster von PCD während der embryonalen Entwicklung, die sich ändern, wenn ein Wachstumsfaktor-Gen, wie etwa Sonic Hedgehog (Shh), ^16,17 entfernt sind. Da LysoTracker ist ein kleines Molekül Farbstoff, hochdiffusiblen ist, kann die gesamte Embryo visualisiert werden, um Bereiche der PCD auch tief im Mesenchym ^12,13 beurteilen Abbildung 1 zeigt die LysoTracker Färbemuster für normale und Shh ^{-. / -} Mutante Maus Embryonen 10.5dpc. ^{- / -} In diesem Stadium ist PCD stark Shh erhöhte mutanten Embryonen, insbesondere in den Gliedmaßen und Somiten regions. Abschnitte des Embryos kann ganz-Halterung bei stärkerer Vergrößerung (1B) abgebildet werden, um das Gesamtbild zu beurteilen. Seziert Abschnitte können auch geschnitten mit einem vibrierenden Mikrotom (1C) oder einem Kryostaten (DF) auf PCD Regionen näher zu offenbaren.

TUNEL-Analyse wird am besten auf dünne Schnitte gemacht, wo die Penetration der terminalen Transferase ist weniger problematisch. LysoTracker Fleckenbildung und TUNEL-Assay kann in der gleichen Gewebe (1D-G) erfolgen. Diese Ergebnisse zeigen, dass, obwohl es keine strenge Korrelation zwischen 1.01 LysoTracker und TUNEL-Färbung, die allgemeinen Bereiche der PCD Überlappung erheblich. Bei einer höheren Vergrößerung, ist es möglich, puncta sehen, dass Fleck mit der TUNEL-Assay positiv, aber nicht mit dem LysoTracker Farbstoff, puncta, dass nur mit dem LysoTracker Farbschleier und puncta die überlappende Färbung.

Wenn ein EB auf einem Gelatine-beschichteten Oberfläche plattiert ist, wird differenzierenden Zellen MIGRATe nach außen. Nach 10 Tagen der Kultur werden die Zellen in einer Vielzahl von Zelltypen, einschließlich Neuronen, Muskelzellen, und Kardiomyozyten differenziert haben. Die Kulturen in Abbildung 2 dargestellt enthalten gemischte Populationen dieser Zelltypen, aber man könnte passen unsere Protokoll zu studieren eines bestimmten Zelltyp von Interesse PCD. Zum Beispiel könnte der EB mit Retinsäure, die Differenzierung von Neuronen zu erweitern ¹⁹ behandelt werden, und dann die LysoTracker Assay verwendet werden, um neuronalen Zelltod unter verschiedenen Bedingungen zu bewerten. Im normalen Kultur von ES-Zellen differenzierten, gibt es ein paar Zellen, PCD und durchlaufen diese können erkannt werden mit LysoTracker und / oder TUNEL-Assays (Abbildung 2A). PCD kann durch eine Reihe verschiedener Zytostatika wie Wasserstoffperoxid (H ₂ O _2), die oxidative Schädigung induziert und initiiert den apoptotischen Weg ^20,21 induziert werden. Eine geringe Dosis von H ₂ O ₂ erhöht sowohlLysoTracker und TUNEL-Färbung zu keiner Behandlung verglichen, während eine hohe Dosis führt Zellschrumpfung und weit verbreitete LysoTracker und TUNEL Positivität. Ähnlich zu den Ergebnissen im Embryo, ist es möglich, puncta sehen, dass Fleck mit der TUNEL-Assay positiv, aber nicht mit dem LysoTracker Farbstoff, puncta, dass nur mit dem LysoTracker Farbschleier und puncta die überlappende Färbung. Die Folge der Anwendung eines zytotoxischen Mittels, das Apoptose induziert wird Serumentzug Bedingungen, die Autophagie (2D) induzieren verglichen. Zellen, die einen Zeitraum von Serumentzug (1 Stunde) durchlaufen haben eine unterschiedliche Muster, wo LysoTracker und TUNEL-Färbung nicht hoch korrelieren. LysoTracker Färbung viel im Vergleich zu unbehandelten Kulturen erhöht, jedoch TUNEL Positivität ist auf normalem Niveau.

Verwendung von Standard-Werkzeugen in Adobe Photoshop, können LysoTracker Färbung mit einem einfachen Schwellwertverfahren quantifiziert werdendas erlaubt es, die durchschnittliche Färbung Niveau für eine Population von Zellen zu berechnen. 3A-B zeigt, wie ein Beispiel-Bild während der Quantisierungsverfahren aussieht. Beginnend mit einem Ausgangsabbilds mit LysoTracker Färbung im roten Kanal und der DAPI-gefärbten Kernen in dem blauen Kanal (Panel 3A) wurde die roten Kanal dieses Bildes Schwellenwertvergleich um das Bild auf schwarz-weiß konvertieren und die weißen Pixel waren dann ausgewählt und gezählt (3A '). A Thresholding Ebene wurde gewählt, dass repräsentiert die LysoTracker Färbemuster. Wie bei jedem Quantifizierungsmethode die Bilder verwendet, ist es wichtig, zu vermeiden Überbelichtung Ihre Fotos als dies möglicherweise in Überbetonung Differenzen ergeben. Die Zahl der Keime im Bereich kann dann durch suchen nur den blauen Kanal (3B) und Markieren der Kerne mit einem Zeichenwerkzeug wie einem Pinsel beim Zählen (3B ') gezählt werden. Man kann dann exprimieren the Ebene der Färbung durch die Berechnung der durchschnittlichen Höhe der Färbung pro Zelle (Anzahl der Pixel / Kerne count). Will man diesen Algorithmus für Hochdurchsatz-Screening einsetzen, können die meisten Screening-Pakete Helligkeit in einem bestimmten Kanal zu messen und auch eine Objekt-ID-Funktion, wird Kerne in einem Feld zu zählen, aber für die meisten typischen Anwendungen ist die manuelle Methode ist schnell und einfach. Um ein Beispiel zu geben, wurde eine Probe Region aus den 2A-C quantifiziert und die Ergebnisse bestätigen, dass steigende Konzentrationen von H ₂ O ₂ zu einem höheren Maß an LysoTracker Färbung (3C).

Abbildung 1. LysoTracker Färbung in normalen und Shh ^{- / -} Embryonen. A, A 'Normal und Shh ^{-. / -} Maus-Embryonen bei 10,5 dpc mit LysoTracker Red gefärbt, in Vectashield montiert und fotografiert unterein epiflourescence Seziermikroskop. Klammern geben die Lage der Vordergliedmaßen B, B 'Vorderbein von normalen und Shh ^{-.. / -} Embryonen bei höherer Vergrößerung abgebildet. Beachten Sie die normalen Domänen des Zelltods einschließlich der "Posterior Necrotic Zone" (mit einem Sternchen markiert) und einer Region, in der proximalen Mesenchym der Gliedmaßenknospe (mit einem Pfeil markiert). Shh null Gliedmaßen zeigen stärkere Färbung in der medialen und distalen Abschnitt . C, C '. Medial Schnitte durch das Vorderbein Knospe sowohl normale als auch null Gliedmaßenknospen. Beachten Sie die Anwesenheit der Färbung in der proximalen Mesenchym (Pfeil) und AER (Pfeilspitze) des normalen Gliedmaßenknospe und starke Färbung innerhalb der dorsalen und ventralen und distalen Mesenchym im null Gliedmaßenknospe. DF. Das gleiche Abschnitt (12 micron, gefroren Abschnitt) wurde für LysoTracker und TUNEL-Färbung (Roche 1.684.795) abgebildet. Der Abschnitt durch den distalen Abschnitt des Shh null mesencHyme. Die Pfeilspitze zeigt auf der VRE. Beachten Sie, wie das allgemeine Muster sehr ähnlich ist mit beiden Methoden, aber die Färbung nicht vollständig überschneiden. G, G '. Bei einer höheren Vergrößerung der VRE und Mesenchym, kann man sehen, sowohl das Vorhandensein von puncta die LysoTracker oder TUNEL-positiv sind nur so gut wie puncta die überlappende Färbung.

Abbildung 2. LysoTracker Färbung in differenzierten ES-Zellen. Differenzieren Zellen wurden auf 8-Kammer gleitet in der Abwesenheit von LIF ausplattiert. Um zu zeigen, wie LysoTracker und TUNEL-Färbung vergleichen, wurde der Apoptoseweg mit 2 unterschiedlichen Dosen an H ₂ O ₂ induziert wird, während die Autophagie induziert wurde unter Verwendung von 1 Stunde Serumentzug. Diese Bilder wurden mit einem Zeiss LSM5 Konfokalmikroskop AA-A'':. Unbehandelte Kulturen zeigen einige normale Apoptose durch LysoT angegebenracker und TUNEL Färbung. Das Muster mit beiden Techniken meist überlappt (weiße Pfeile), jedoch kann man ein paar puncta die LysoTracker nur positiv (rote Pfeile) sind siehe B-B'', CC ":. Behandlung mit steigenden Mengen an H ₂ O ₂ stimuliert Apoptose . Die niedrigere Dosis zeigt mehr LysoTracker und TUNEL positive puncta, wenn zu unbehandelten Zellen verglichen. Die höhere Dosis induziert in noch mehr LysoTracker und TUNEL positive puncta. Weiß Pfeile weisen auf überlappende Färbung, während die roten Pfeile zeigen auf puncta, die positiv für LysoTracker nur. Es ist auch möglich, dass nur positive puncta für TUNEL-Färbung (grüne Pfeile) sind s. DD ":. Serumentzug kann Autophagie induzieren, welche kann eine Materialanhäufung in Lysosomen und autophagolysosomes stimulieren. Beachten Sie, wie viele weitere LysoTracker puncta sichtbar sind im Vergleich zu unbehandelten Kulturen. TUNEL positive puncta vorhanden sind (von denen die meisten Überschneidungen LysoTracker Fleckention, weiße Pfeile), jedoch ist die Anzahl nicht stark erhöht, verglichen mit unbehandelten Bedingungen. Darüber hinaus unter Serumentzug Bedingungen sind LysoTracker nur positive puncta weit verbreitet (rote Pfeile).

Abbildung 3. Quantifizierungsverfahren um das Niveau der Färbung in einer Population von Zellen unter Verwendung von Adobe Photoshop beurteilen. A: Ein Teil von 2A wurde ausgewählt und die LysoTracker (roten Kanal) und DAPI-Färbung (Kerne, blauen Kanal) wird in dieser Tafel gezeigt A ':. Die roten Kanal von 3A wurde Schwellenwertvergleich um es um eine Schwarz-Konvertierung Weiß-Bild. Die weißen Pixel können dann ausgewählt und gezählt werden unter Verwendung des Histogramms Funktion B-B ':. Die blauen Kanal zeigt die Kerne und während sie zu zählen, das Bild kann mit einer Zeichnung erläuterten Funktion wie einem Pinsel C:. Dies ist ein Exreichlichen Quantifizierung einer Probe aus Paneelen 2A-C. Die Daten werden als Pixel pro Kerne vertreten. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Diskussion

Wichtige Kennzeichen der Apoptose sind die Detektion von DNA-Schädigung mit der TUNEL-Assay, zusammen mit dem Nachweis von Caspase-Aktivität (detektiert mit mAbs oder eines bindenden Moleküls wie zVAD-fmk), die Beobachtung von zellulären Veränderungen, und die Präsentation von Phosphatidylserin (PS ) auf der Membranoberfläche (detektiert durch Annexin-V-Bindung). Es gibt einige Nachteile, die mit jedem dieser Assays. Zum Beispiel ist das Endgerät Transferase in der TUNEL-Assay verwendet wird, nicht mehr als ein paar Zel...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma		Katalog-Nummer
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	# L-7528
Hanks BSS	Invitrogen	14025-076
Paraformaldehyd	EMD	EM-PX0055-3
Vectashield	VECTOR	H-1200
DMEM	Cellgro	10-013-CV
Nicht-essentielle Aminosäuren	Cellgro	25-025-CI
Natriumpyruvat	Cellgro	25-000-CI
FBS	Hyclone	SH30071.02
Pen-Strep	Invitrogen	15140-122
b-Mercaptoethanol, 50 mM	Invitrogen	21985-023
LabTek-II Chamber Slides (8-well)	Nalge Nunc International	154534
0,1% Gelatine	Millipore	ES-006-B
Dulbeccos PBS (D-PBS)	Cellgro	21-031-CV
			Lösung Rezepte 4% Paraformaldehyd Für 100 ml: Mix 4 g Paraformaldehyd, 90 ml H 2 O und NaOH (ein Tropfen 2N NaOH). Die Paraformaldehyd nicht in Lösung gehen, bis Sie fügte etwas NaOH haben, um den pH zu erhöhen. Umrühren und Wärme bei 60 ° C, bis sich das Pulver vollständig in Lösung (~ 10-20 min). Nicht überhitzen. Hinzufügen ~ 10 ml 10x PBS auf ein Endvolumen von 100 ml zu erreichen. Lagerung bei -20 ° C in bequemer (~ 10 ml oder ~ 40 ml) Aliquots. WARNUNG: Paraformaldehyd in 'Halskrause' Form (komprimiert kleinen Pellets) weniger Pulver und kann daher außerhalb der Haube gemessen werden. Allerdings sollten Sie tragen noch eine schützende Staubmaske (N95zumindest) während der Handhabung. EB Nährmedien Für 500 ml EB Media: DMEM: 404,5 ml FBS: 75,0 ml L-Glutamin: 5,0 ml Penicillin / Streptomycin: 5,0 ml Nicht-essentielle Aminosäuren: 5,0 ml Natriumpyruvat: 5,0 ml β-Mercaptoethanol: 500ul