Summary
この手術法は、マウスの眼の網膜下腔への遺伝子治療用ベクターと幹細胞の注入を示しています。
Abstract
失明は、米国で約340万人に影響を与え、今後数年間で増加すると予想される。最近1、遺伝子治療や幹細胞移植は、網膜変性疾患に起因する失明を治療するための重要な治療手段となっています。そのような虹彩色素上皮細胞移植などの加齢黄斑変性症（AMD）に対する自家移植のいくつかの形態、有望な結果を生成しており、ヒトでの臨床試験は、遺伝子や幹細胞治療の他の形態のために始めている。2これらはRPE65遺伝子の交換を含むレーバー先天性黒内障とスタルガルト病で、ヒト胚性幹（ES）細胞を用いたRPE細胞移植患者における治療3-4現在の遺伝子治療ベクター及び網膜疾患患者の治療に利用できる幹細胞が存在すること、それは確認することが重要である適用する前に、動物モデルにおいて、これらの潜在的な治療法ヒトでの研究でそれらをING。マウスは眼の遺伝子治療用ベクターと幹細胞移植の治療効果をテストするための重要な科学的なモデルとなっている。このビデオの記事では5月8日 、私たちは、網膜下腔への遺伝子治療ベクター又は幹細胞を注入する手法を提示マウス眼周囲組織への損傷を最小限に抑えることができます。
Protocol
1。網膜下注入用デバイスを組み立てる
- ガラス毛細管の直径100μmの針を購入したりします。これは、サッター、P-97ピペットプラーまたは他の類似の装置を使用して手動で行うことができます。それが所望の直径（100μm程度）に達するまで、キャピラリーチューブの端を加熱し、プルアップされます。直径の小さい針が遺伝子治療ベクターを使用することができますが、これは、細胞または目に損傷を与えることなく、細胞注入のための推奨径である。鋼針に比べ、ガラスキャピラリーニードルは網膜破損を引き起こすことなく、注射液および網膜下腔へのアクセスの可視化を可能にするために、非常に細かいですが、鈍先端を持っています。 70％エタノールを使用して必要に応じてこれらのプルアップ針をクリーニング後、滅菌容器に保管してください。所定の位置に針を保持するためにテープで15センチメートル滅菌組織培養皿は、注射針が覆われており、無菌環境を保つために1つの方法です。この時点で、COMPL手続きが行われる手術室の中にセットアップをETE。それは、この手順はバリア施設内で行われている場合は特に、無菌のままにするために、すべての回で手術室にすべての機器を維持するのが最も簡単です。
- 注射針にシリコーンを吸引除去し、針の内壁に沿ってコーティングを残すためにシリコーンを取り出します。シリコーンコーティングは、特に内側のガラス毛細管壁を突き刺すような針の穴を介して細胞やウイルスの通過を最大化します。
- （チューブから針を取り除く）を直接針の後のポイントでルアーロックで設定した25¾ゲージ採血を切断することにより滅菌したプラスチックチューブの約8cmの長さを取得します。
- 滅菌生理食塩水で1mlサブQ 26 5/8-gaugeスリップオンチップシリンジを記入し、注射器から針を外します。
- プラスチックチューブの切断端に注射針を取り付け、他にルアーロックにシリンジを取り付ける終わり。
- それが正しく漏れなくても接続されていることを確実にするために針を介していくつかの生理食塩水を取り出し、チューブやキャピラリーニードル内のデッドスペースを埋めるために滅菌生理食塩水を吸引します。次に、注射針の先端に、空気の小さい、約1μlの量を吸引除去する。これは、注入液から生理食塩水を分離し、外科手術中に注入流体の終わりを示す視覚的な手がかりを提供します。注入装置は外科手術の際に、70％エタノールで拭いてきれいな表面上に保持されるべきである。また、外科手術の際に使用されるすべての機器が既に滅菌、使用できる状態に保たれるべきである注射針の例外のために、70％エタノールで前と後の両方でクリーニングする必要があります。これらの針は、手術後の処分ではなく、再利用されるべきである。
- 最後に、目的のパッケージ化された遺伝子治療ウイルスベクターまたは幹細胞を含む注射液を吸引除去する。これはによって行うことができますその後無菌細胞培養皿の表面に溶液をピペッティング、滅菌ピペットチップ内に注射液を取って。ソリューションは簡単にシリンジを用いて注射針内に吸引することができます。必要な量は、マウスの年齢によって異なります。私たちの目的のために、私たちは、注射液の0.5から0.8μlを注入することができる産後5日目のマウスを使用しています。少ない量、0.5μlの以下は、そのような1μlのように、若いマウスと多量に使用することができ成体マウスに使用することができます。細胞のウイルス力価または番号が注入されるウイルス/細胞およびそれらの所望の標的組織に基づいて決定する必要があり、少量のようにあまりにも多くのウイルス粒子または細胞が網膜細胞に対して毒性につながることができます。ビデオでは、可視化の目的のために、我々は、1.5μlの、眼の中に注入するのに必要以上の色素を多量に使用してきました。
2。網膜下腔へのアクセス
- 無菌手術室の中では、マウスの年齢によって異なりますが、ローカルで承認された動物取扱業者のプロトコルに従ってマウスを安定させるか、または麻酔。成体マウスのための一般的な麻酔はイソフルランガスまたは滅菌生理食塩水でケタミン（100 mg / ml）とキシラジン（20 mg / ml）を0.1 ml/10g体重の腹腔内注射の使用を含む。周産期のマウスの場合、一般的な麻酔技術はイソフルランガスまたはcryoanesthesia（低体温）の使用を含む。すべての麻酔技術は、使用前にお近くの動物実験委員会の承認を得なければならない。同様の技術はP0または成体マウスへの幼いマウスに適用することができますが、我々は一般的に、（P）は産後5日目のマウスを使用しています。外科的処置は、マウスが手足を動かすことがなくなるまで開始され、もはやピンチをつま先に応答しないことはできません。血液の流れが遅くなりますので、周産期のマウスのために、彼らは、彼らは麻酔下で完全であることを知ることに別のキーカラーで目立って軽くなるだろう。
- 周産期のマウスでは、mにVannasまっすぐはさみを使用オーケ閉鎖蓋裂に沿って約1.5 mmの切開。目が自然に将来で開きますインデント、でカットするように注意してください。これは蓋を癒すとマウスの開発中に正常に開くことが保証されます。我々は、彼らがこの手順の間、目に穴をあけることのリスクを軽減するので、Vannasはさみを好むものの、外科ブレードは、この目的のために使用することができます。ビデオでは、はさみは眼瞼縁に沿って直接穿刺し、カットに使用されていました。このテクニックを学ぶときに、鉗子は、切断前にまぶたを持ち上げ、目を損傷する危険を軽減するために使用されるべきである。
- 目をproptose、それは注射用proptosed保持するために眼の下にわずかにまぶたを挟まないように湾曲したドレッシング鉗子でまぶたを引き離す。ステップ2で作った蓋切開が大きすぎると、目蓋の下に逆戻りし、注入手順中に適切な露出を防ぐことができます。成体マウスでは、DRと目の周りのわずかな圧力を適用することディエッサー鉗子は、注射用proptosed目を保持することができます。
- 小さな強膜における切開または15度のマイクロサージェリーの刃で表面を傷つけによって地球の赤道より後方を確認します。この切開は、注射針の先端を通過するのに十分なだけ大きいが、それよりも大きくなければならない。望ましい場合には、そのような鍼治療の針のような小さな、鋭い針ではなく、マイクロサージェリーブレードの網膜下腔にこの切開を作るために使用することができます。暗く着色された動物では、暗褐色の色素組織（脈絡膜·網膜色素上皮）は、切開した時点で見えるようになります。軽い色素沈着またはアルビノマウスでは、手術用マーキングペンは切開部位を示すインクスポットを残して顕微ブレードの先端に適用することができます。切開部位からクリア（硝子）流体還流した場合、ブレードがあまりにも深く置かれ、硝子体腔および治療ウイルスまたは細胞は注入時に硝子体内にスペースを入力することが入力されました。 visualizati用目的のために、我々は、ビデオのこのポイントへの切開を行った。それは、この場合の網膜下注入を完了することは可能ですが、注入流体の存在によって引き起こされる網膜剥離は完全にこのマウスで治癒しない場合があります。したがって、注意が注射前に網膜を通して眼としないの外表面部のみを切断するために注意しなければなりません。
- 慎重に切開部位に注射針を挿入し、網膜下のスペースを入力するには、外側の目の壁に平行して進める。眼内外壁に近すぎたり深すぎて前進すると、誤った場所への注入を指示します。針が正しい場所にあるかどうかを理解する最良の方法は、技術を練習することです。軽く色素沈着またはアルビノマウスで練習すると、網膜下空間に精密かつ正確な注射を作るのを助けることができます。針と注射液が、これらの目の中で目に見えるであるためです。
- シリンジプランジャに軽い圧力を適用し、ある所望の流体のジン注入。針が正しく網膜下空間内に配置されている場合は、適度な背圧が感じられるだろう。針がガラス質内にある場合には、注入時の有意に低い背圧と潜在的にいくつかの流体の逆流があるでしょう。重要な背圧がある場合は、ゆっくりと針を取り外す前に、少なくともさらに15秒間の場所に針を保持します。これは、高眼圧が切開部位バックアウト注入ウイルスまたは細胞を還流するのではなく均一にすることができます。空気と生理食塩水の一部は、注入手順時に必要な圧力上昇に起因する網膜下腔に注入してもよい。ケアは、それは目から注入されたウイルスまたは細胞を洗い流すことができるので、空気又は生理食塩水を過剰に注入しないように注意するべきです。これは、網膜下腔に注入しすぎて流体の存在から永久網膜剥離を起こすことも可能です。可視化の目的のために、余分な染料と空気がint型に注入したビデオの中の網膜下腔をO。これは明らかに気泡が網膜下空間内に留まると硝子体の中に消えていませんどのようにあまりにも多くが注入されている場合、色素の一部が網膜下腔の裏にフラッシュされますどのように見られるが、することができます。これは、これらの注射は、眼の正しい場所にあるすべてだったことを強調するために使用されていたので、人は針が切開部位を入力する必要がありますどのように視覚化することができます。網膜下腔に全ての注射は、注射液の存在に起因する一時的な網膜剥離を起こす。注入手順が正しく完了している場合は、この一時的な網膜剥離はすべてのそれ以上の実験のために使用することができます24時間とマウスで治るでしょう。目は外科手術に起因する約1週間柔らかいままである可能性がありますので、二回目の注射は、この期間中は避けるべきである。
- 新生児マウスについては、そっとふたの後ろと軌道に戻って目をプッシュするために湾曲したドレッシング鉗子を使用しています。それが役に立つかもしれませんウイルスが網膜下空間内で安定するよう、ゆっくりと、その軌道に戻って目を押したときに、それが切開部位からフラッシュされることがないようにするために分を待つ。手術後、25ゲージ針から無菌の生理食塩水に0.25％に希釈した0.5％の一滴ブピバカイン（marcaine）が注射部位に配置することができます。マウスは、網膜下手術後の苦痛の明白な徴候を示していないと長時間作用型外用鎮痛ブピバカインとしての使用は、過去3年間のための十分なされています。このような感染症、腫れ、またはマウスの通常の日常活動の低下など、マウスは常に苦痛の兆候を探すために外科手術後に監視する必要があります。これらが発生した場合は、獣医師に通知されるべきであり、このようなブプレノルフィン（0.05 mg / kg）を、さらなる痛みの治療薬は、腹腔内注射として与えることができます。
- 局所的に承認された動物の取り扱いプロトコルに従って麻酔からマウスを覚ます。マウスは加熱pに保たれるべきであるそれは麻酔から目覚めるように正常な体温を維持するための広告。手術は麻酔を受けるために、マウスのための時間をカウントしない、完了するまでに5分未満を取る必要があります。したがって、加熱パッドは、実際の手順の実行中に必要ないのですが、手続きは時間の長い期間を取ることができるように1つのテクニックを学習している間必要になることがあります。それは自分自身で移動し始めているまで、マウスはクリーンケージに戻されるべきではない。新生児については、穏やかなつま先のピンチは完全に麻酔から回復するために彼らのために役立ちます、そして、彼らは母親と一緒に戻って配置される前に、そのピンクの色と動きを取り戻す必要があります。以前に記載されているマウスは、苦痛の形跡がないかを経時的にモニターする必要があります。
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Representative Results
マウス眼の描画は硝子体内注射し、網膜下の両方の外科的処置（矢印、 図1）の場所を表示する矢印で、参考のために標識された主要な構造体で示されています。そのようなlacZのレンチウイルスベクター（ 図2）のような遺伝子治療ベクターは、これらの場所を使用して注入することができる。さらに、このようなマウス胚性幹細胞（ 図3）などの幹細胞は、また、マウスの眼のこれらの部 位に移植することができる。
サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター（1×10 8 TU / mlで、Lentigenコーポレーション、 図2A）により駆動されるlacZレポーター遺伝子を運搬するレンチウイルスベクターの1μlをC57BL/6Jマウスの網膜下腔に注入した。目は鈍的切開によって生後6週で摘出し、1 mg / mlのX-gal溶液（5mMのK 3のFe（CN）6、2mMのMgCl 2、0.02％のNP 40、0に浸漬した。37℃で一晩、1％デオキシコール酸ナトリウム）℃目はミクロトームで30分間、切片は2％formaldehyde/0.2％グルタルアルデヒドで固定した。LacZレポーター遺伝子の発現が光受容細胞の約10％（ 図2B）にX-gal製品（青色）として検出された。 lacZ発現および無傷周囲の組織の細胞内存在は、マウスの目で成功した網膜下注入を示しています。
C57BL/6Jマウス胚性幹（ES）細胞は緑色蛍光タンパク質（EGFP、ウェルカムトラストサンガー研究所）で標識した。次いで、これらの細胞を1μlあたりに噴射さ約1×10 5個の細胞で、収集され、リン酸緩衝生理食塩水に懸濁した滅菌産後一日の網膜下腔（P）の5 C57BL/6Jマウスに移植した。目はショ糖勾配で固定し、10月の包埋媒体（ティッシュテック）で凍結、鈍的切開によって生後2週で摘出した。目は切片と気力だった蛍光顕微鏡（ツァイス）の下ualized。 GFP標識したES細胞の存在は、注射したマウスの眼（ 図3A）の網膜下空間内で見つけることができます。さらに、C57BL/6J-Tyr C-2J / J（C2J）マウス胚性幹（ES）細胞は、黄色蛍光タンパク質（YFP）でエレクトロ、in vitro で網膜色素上皮（RPE）細胞に分化させた。分化の1ヶ月後、YFP標識RPE-C2JのようなES細胞をリン酸緩衝生理食塩水に懸濁した滅菌およびP5 C57BL/6Jマウスの網膜下腔に注入した。 15週齢では、マウスは、網膜内YFPの存在（Spectralis走査レーザー共焦点検眼鏡、ハイデルベルク工学、 図3B）のライブイメージングの蛍光を用いて可視化した。
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図1。マウス眼の回路図 （矢頭）とマーク硝子と網膜下注入の手続きの両方のサイトでマウスの眼の構造を描いた漫画のデッサン。
図2。遺伝子治療ウイルスベクターの網膜下注入 。サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターによって駆動されるlacZレポーター遺伝子を示すAのレンチウイルスベクターマップ。産後5日目での網膜下注射後6週齢のC57BL/6Jマウスの網膜における lacZレポーター遺伝子のBの発現。 RGCは、網膜神経節細胞、INLは、内顆粒層、つまり、光受容体の内側セグメント（矢印）、ONL、外顆粒層（光受容体）（矢じり）、OS、光受容体外側セグメント。
図3。マウス胚性幹（ES）細胞の網膜下注入。A.産後5日目で緑色蛍光タンパク質（GFP）で標識されたES細胞の網膜下注入後2週齢のC57BL/6Jマウス。 GFP陽性細胞は、蛍光顕微鏡（Zeiss）を用いて注入し、眼の網膜下空間内に表示されています。緑、ES細胞（矢印）GFP標識、RGL、網膜神経層と、INL、内顆粒層、ONL、外顆粒層（光受容体）; IS / OSには、内側と外側の光受容体セグメント; RPE、網膜色素上皮。 B.黄色蛍光タンパク質の存在について（Spectralis走査レーザー共焦点検眼鏡、ハイデルベルク工学）ライブイメージング自家蛍光を用いて示す15週齢のC57BL/6Jマウス網膜（YFP）が網膜内のRPEライクC2JマウスES細胞標識。RPE-様YFP-ES細胞の網膜下注入は産後5日で行われました。
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Discussion
このビデオ技術は、正常に網膜下注入外科手術を完了し、遺伝子治療ベクター又は幹細胞を効率的に眼疾患を治療するために必要な場所に配置されていることを確実にする手順について説明します。それはこれらの細胞の周辺に遺伝子治療ベクターまたは幹細胞由来の組織を置くので、この技術は、そのようなRPEまたは光受容体として網膜細胞のターゲティングを可能にします。従来の方法は、流体が硝子体腔内に配置され硝子体内注射を、関与しており、これらの特定の領域を標的とするために、網膜を通って移行する必要があります。硝子体内注射は、すべてのウイルス粒子が正しい場所に移行されますので、ターゲットの光受容体またはRPEという遺伝子治療ベクターの伝達を低減します。さらに、幹細胞は病気のRPEまたは感光体を交換し、ますます人気が高まっており、これらの分化した細胞は、サブ以内に移植しなければなりません網膜の空間。5
これは網膜剥離や周囲の目への損傷の可能性を低減するとともに、治療効果を持たせるために、遺伝子治療ベクターまたは幹細胞由来の組織の正確な位置を保証するため、この手順で重要なステップは、網膜下腔へのエントリです組織。ケアは、前もってトラブルシューティングするために取らなければならない;見つけ、網膜下腔に流体を注入できるようにする。注射針は、有色マウスの眼球内の表示されませんので、映像に示すように、これは、着色染料とアルビノマウスを用いた実践を通じて行うことができます。練習の後、研究者は、流体が正しく網膜下空間内に配置されている圧力の差を感じるし、適時にそれを完了するために、外科手術と快適になることを学ぶでしょう。
この外科手術のためのいくつかの潜在的な変更があります。これらの注射は、行うことができます異なる年齢のマウスでED、注入された遺伝子治療ベクターまたは幹細胞由来の組織の量は、マウスの年齢に応じて異なる可能性がありますが。ケアは、どのくらいの流体が眼疾患の治療を促進するが、剥離や網膜の損傷を延長しないかを決定するために取られるべきである。引っ張らキャピラリーニードルが異なる直径を有するように修飾することができる。小さい針は、ウイルス注射には十分ですが、より大きい直径が細胞移植のために良いかもしれません。また、手術は成体マウスで行うことができます。眼組織の密度がはるかに大きくなりますので、新鮮な、鋭い外科ブレードが網膜下腔に浸透する必要があります。すべての場合において、修正が遺伝子治療ベクターまたは幹細胞由来の組織の正常な網膜下注入を完了するには、このプロトコルに基づいて行うことができる。
すべての網膜下注射は内注入される流体の存在に起因する一時的な網膜剥離の原因となります網膜下空間が、この剥離は、外科的処置から24時間以内に治るでしょう。マウスは慎重に残って剥離を顕微鏡で確認することができます。これは、いくつかのマウスがよく置か注射後にも自然治癒しない可能性があります。すべてのマウスは、この24時間の時間期間の後に検査や実験を受けることができます、しかし、眼が原因で最大一週間のための注入手順からの圧力の変化に柔らかいかもしれません。したがって、この手法の一つの限界は、最初の術後の週の間に二次注入を実行する機能です。手術後に治癒しない網膜剥離の発生率が増加するため、別の注入は、手術直後の期間中にできない場合があります。これはマウスの眼を再注入する前に限り、1月と、時間の長い期間を待つことをお勧めします。
マウスは、眼科疾患と潜在的な治療法トンを研究する重要なモデル生物となっている帽子は人間の臨床試験につながるでしょう。彼らはトランスジェニックマウスモデルであろうと9月12日 、この手順の第2の制限ではなく、すべての細胞が網膜下注入後のDNAベクターでトランスフェクトされていることである。ただし、この手順は必ずしもすべての細胞がトランスフェクトされるヒトでの臨床手順より密接に近似することがあります。従って、この技術は、遺伝子治療ウイルスベクターまたは加齢黄斑変性症とヒトにおける他の網膜硝子体疾患を治療するために幹細胞由来の組織移植療法のための実現可能性を確立するために助けることができます。将来のアプリケーションは、トリートメントの組み合わせを使用して、さまざまな網膜細胞プロモーターおよび分化した幹細胞、あるいは複数回の注射の使用を含めることができます。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
孝行長崎から実験支援;;失明を防ぐための研究本研究は、眼科と視覚研究における動物の使用に関するARVOステートメントに準拠しています。 KJWはNIH助成5T32EY013933と5T32DK007647-20でサポートされています。 VBMは、NIHの助成金K08EY020530によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.8-1.10 x 100 mm Capillary Tube (glass) | Kimble Glass, Inc. | 34502 99 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | Narishige microforge can be used instead. Catalog #MF-900 |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-25ML | Silicone |
| Dubecco's Phosphate Buffered Saline with Calcium Chloride and Magnesium Chloride | Gibco-Invitrogen | 14040-133 | |
| Safety-Lok 25 3/4G x 12"; Blood Collection Set | B-D Vacutainer | 367298 | |
| 1 ml Sub-Q 26 5/8G Slip-Tip Syringe | Becton-Dickinson | 309597 | |
| 0.5-10 μl Finnpipette II Adjustable-Volume Pipetter | Fisherbrand | 21-377-815 | |
| 1-200 μl Natural Beveled Tips | USA Scientific, Inc. | 1111-1700 | |
| Discovery.V8 Stereo Microscope | Zeiss | MC1500 | |
| 60 mm x 15 mm Style Treated Polystyrene Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| Vannas Straight Scissors | Storz Ophthalmics | E3383 S | |
| Curved Dressing Forceps with Serrations Delicate | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| 15 Degree Microsurgery Knife | Wilson Ophthalmic Corp. | 091204 | |
| Ketamine | Ketaset III | NADA #45-290 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | NADA #139-236 | |
| Bupivacaine (Marcaine) | AstraZeneca | N/A | |
| Buprenorphine | Sigma Aldrich | B9275 |
References
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