Summary
Esta técnica cirúrgica ilustra a injecção de vectores de terapia genética e de células estaminais para o espaço sub-retiniano do olho do rato.
Abstract
A perda de visão afeta cerca de 3,4 milhões de pessoas nos Estados Unidos e deverá aumentar nos próximos anos. 1 Recentemente, a terapia genética e os transplantes de células-tronco tornaram-se importantes ferramentas terapêuticas para o tratamento da cegueira resultante de doenças degenerativas da retina. Várias formas de transplante autólogo de idade degeneração macular relacionada à (AMD), como a íris transplante de células epiteliais pigmentares, têm gerado resultados animadores, e testes clínicos em humanos começaram a outras formas de terapias com células-tronco e genética. 2 Estes incluem a substituição RPE65 gene A terapia em pacientes com amaurose congénita de Leber e um transplante de células RPE humanas utilizando estaminais embrionárias (ES) células na doença de Stargardt. 3-4 Agora que existem vectores de terapia genética e de células estaminais disponíveis para o tratamento de pacientes com doenças da retina, é importante verificar estas terapias potenciais em modelos animais antes de aplicarção deles em estudos humanos. O ratinho tornou-se um modelo importante científica para testar a eficácia terapêutica de vectores de terapia génica e transplante de células estaminais no olho. 5-8 Neste artigo de vídeo, é apresentada uma técnica de injectar vectores de terapia génica ou de células estaminais para o espaço sub-retiniano do o olho do rato, minimizando os danos para o tecido circundante.
Protocol
1. Montar dispositivos para a injeção sub-retiniana
- Comprar ou fazer uma agulha 100 um de diâmetro a partir de um tubo de vidro capilar. Isto pode ser feito manualmente utilizando um extractor Sutter P-97 da pipeta ou outro equipamento semelhante. A extremidade do tubo capilar irá ser aquecido e puxado até atingir o diâmetro desejado (100 mm). Uma agulha de menor diâmetro podem ser utilizados para vectores de terapia génica, no entanto, isto é o diâmetro recomendado para a injecção das células, sem danificar as células ou o olho. Em comparação com as agulhas de aço, a agulha capilar de vidro tem uma ponta muito fina, mas sem corte, para permitir a visualização do fluido de injecção e de acesso ao espaço sub-retiniano, sem causar a ruptura da retina. Limpe estas agulhas puxado, se necessário usando etanol 70%, e guarde em um recipiente estéril. Uma placa de cultura de 15 centímetros estéril tecido com fita adesiva para segurar as agulhas no lugar é uma forma em que para manter as agulhas de injecção e coberto em um ambiente estéril. Neste ponto, complete o set-up dentro da sala cirúrgica onde o procedimento será realizado. É mais fácil manter todos os equipamentos na sala cirúrgica em todos os momentos para que ele permaneça estéril, especialmente se este procedimento é feito dentro de uma instalação de barreira.
- Aspirar silicone para dentro da agulha de injecção e ejetar o silicone para deixar um revestimento ao longo das paredes internas da agulha. O revestimento de silicone maximiza a passagem de células e vírus através do furo da agulha, que, de outro modo aderir às paredes interiores de vidro capilar.
- Obter um comprimento de aproximadamente 8 cm de tubagem de plástico estéril, cortando uma colheita de sangue 25 ¾ calibre definido com luer-lock no ponto imediatamente após a agulha (remover a agulha do tubo).
- Encher um 1 ml Sub-Q 26 5/8-gauge seringa de ponta de deslizamento com uma solução salina estéril e retire a agulha da seringa.
- Fixar a agulha de injecção para a extremidade cortada do tubo de plástico e encaixe a seringa para o luer-lock na outrafim.
- Aspirar solução salina estéril para preencher o espaço morto na agulha e tubo capilar, uma solução salina de ejecção através da agulha para assegurar que ele está correctamente ligado sem qualquer fuga. Em seguida, aspirar uma pequena quantidade de cerca de 1 ul de ar, para dentro da ponta da agulha de injecção. Isto vai separar o soro fisiológico do fluido de injecção e proporcionar uma indicação visual que indica o fim do fluido de injecção, durante o procedimento cirúrgico. O aparelho de injeção deve ser mantido em uma superfície limpa limpo com etanol 70% durante o procedimento cirúrgico. Além disso, todo o equipamento utilizado durante o procedimento cirúrgico deve ser limpo, tanto antes como depois com etanol a 70%, com excepção de que as agulhas de injecção deve ser mantido já esterilizado e pronto para ser utilizado. Estas agulhas devem ser eliminados após a cirurgia e não reutilizado.
- Finalmente, aspirar solução injectável que contém o vector de terapia desejado embalados gene viral ou células estaminais. Isto pode ser feito pelatendo-se a solução de injecção uma ponta de pipeta estéril, em seguida pipetando a solução sobre a superfície de um prato de cultura de células estéril. A solução pode agora ser facilmente aspirada para dentro da agulha de injecção com a seringa. A quantidade necessária irá variar, dependendo da idade do rato. Para os nossos propósitos, usamos pós-natais dia 5 ratos, que podem ser injectados com 0,5-0,8 uL de fluido de injecção. Quantidades menores, 0,5 ul ou menos, podem ser utilizadas para os ratos mais jovens e maiores quantidades, tais como 1 uL, pode ser utilizado para ratinhos adultos. O título virai ou o número de células tem de ser determinado com base nos vírus / células serem injectados e seus tecidos-alvo desejado, como muitas partículas virais ou células num pequeno volume pode levar à toxicidade para as células da retina. No vídeo, para efeitos de visualização, utilizou 1,5 ul, uma maior quantidade de corante que é necessário para injectar no olho.
2. Acessando o espaço sub-retiniana
- Dentro do ambiente estéril cirúrgico,estabilizar ou anestesiar o rato de acordo com o protocolo aprovado localmente manuseamento dos animais, a qual irá variar de acordo com a idade do rato. Anestesia comum para ratinhos adultos inclui o uso de gás isoflurano ou de uma injecção intra-peritoneal de 0,1 mL/10 g de peso corporal de cetamina (100 mg / ml) e xilazina (20 mg / ml) em solução salina estéril. Para ratinhos perinatais, as técnicas de anestesia comuns incluem o uso de gás ou isoflurano Crioanestesia (hipotermia). Todas as técnicas de anestesia deve ser aprovado pelo seu comitê local IACUC antes do uso. Normalmente usamos dia pós-natal (P) 5 murganhos, embora as técnicas similares podem ser aplicadas a ratinhos jovens como P0 ou camundongos adultos. O procedimento cirúrgico não pode começar até que o mouse deixou mover os membros e não responde mais aos pés pitadas. Para ratos perinatais, eles vão tornar-se visivelmente mais leve na cor já que o fluxo de sangue irá desacelerar, outra chave para saber que eles são totalmente sob anestesia.
- Em camundongos perinatais, use Vannas tesouras retas para make uma incisão milímetros aproximado 1,5 ao longo da fissura a tampa fechada. Tenha o cuidado de cortar no recuo, onde o olho vai abrir naturalmente no futuro. Isso garante que as tampas se curar e abrir adequadamente durante o desenvolvimento do ratinho. A lâmina cirúrgica pode ser utilizada para esta finalidade, apesar de preferirmos Vannas tesoura, uma vez que reduzem o risco de perfurar o olho durante este procedimento. No vídeo, a tesoura foram usados diretamente punção e corte ao longo da margem palpebral. Quando esta técnica de aprendizagem, uma pinça deve ser usada para levantar a pálpebra antes do corte, e reduzir o risco de danificar o olho.
- Separar as pálpebras com uma pinça de vestir curvas para proptose do olho e beliscar as pálpebras ligeiramente debaixo do olho para mantê-lo proptose injectável. Se a incisão tampa feita em duas etapas é muito grande, o olho irá deslizar para trás sob as pálpebras e evitar a exposição adequada durante o processo de injecção. Para camundongos adultos, aplicando uma leve pressão ao redor dos olhos com o Dr.essing fórceps pode manter o olho proptose injectável.
- Fazer uma pequena incisão escleral no ou posterior ao equador do globo arranhando a superfície com uma lâmina de microcirurgia de 15 graus. Esta incisão deve ser apenas suficientemente grande para passar a ponta da agulha de injecção, mas não maior do que isso. Se preferido, uma agulha de pequeno e afiado tal como uma agulha de acupuntura pode ser usada para fazer essa incisão para o espaço sub-retiniano, em vez da lâmina de microcirurgia. Em animais pigmentadas, um tecido de cor castanha-escura pigmentada (a coróide-retinal do epitélio pigmentar) irá tornar-se visível no ponto de incisão. Em mais leves ratos pigmentados ou albinos, uma caneta de marcação cirúrgica pode ser aplicada à ponta da lâmina da microcirurgia para deixar uma mancha de tinta que indica o local da incisão. Se claros refluxos (vítreo) de fluido a partir do local da incisão, a lâmina foi colocada demasiado profunda e entrou na cavidade vítrea e o vírus terapêutico ou células podem entrar no espaço durante a injecção intravítrea. Para visualizatiem fins, fizemos a incisão para este ponto do vídeo. É ainda possível realizar uma injecção sub-retiniana, neste caso, no entanto, o descolamento da retina causada pela presença do líquido de injecção não pode curar completamente neste rato. Por conseguinte, deve ser tomado cuidado para cortar apenas a superfície exterior do olho, e não através da retina, antes da injecção.
- Cuidadosamente insira a agulha de injecção no local da incisão e fazê-la avançar paralelamente à parede exterior do olho para entrar no espaço sub-retiniano. Avançando muito perto da parede exterior ou demasiado profunda no interior do olho vai dirigir a injecção no local errado. O melhor método para compreender se a agulha está no local correto é praticar a técnica. Praticar em ratos levemente pigmentadas ou albino pode ajudar a fazer injeções precisos e exatos para o espaço sub-retiniano. Isto é porque o fluido de injecção da agulha e é visível dentro destes olhos.
- Aplicar uma leve pressão sobre o êmbolo da seringa e havergin injecção do fluido desejado. Se a agulha é colocada corretamente dentro do espaço sub-retiniana, contrapressão moderada será sentida. Se a agulha se encontra dentro do corpo vítreo, haverá contrapressão significativamente menor e, potencialmente, um pouco de fluido de refluxo durante a injecção. Se houver contrapressão significativa, segure a agulha no lugar para, pelo menos, um período adicional de 15 segundos antes de remover a agulha lentamente. Isto irá permitir que a pressão intra-ocular elevada para igualar a refluxo em vez de vírus ou as células injectadas para trás para fora do local da incisão. Parte do ar e solução salina pode ser injectada no espaço sub-retiniano devido ao aumento da pressão necessária durante o processo de injecção. Cuidados devem ser tomados para não sobre-injetar ar ou salina, uma vez que pode expulsar o vírus injetado ou células do olho. É também possível provocar o descolamento da retina permanente da presença de muito líquido injectado no espaço sub-retiniano. Para efeitos de visualização, o excesso de corante e ar foi injectado into o espaço sub-retiniano do vídeo. Pode ser claramente visto como parte do corante será liberado de volta para fora do espaço sub-retiniano se muito é injectado, mas também como a bolha de ar permanece no interior do espaço sub-retinal e não desaparece para dentro do vítreo. Este foi usado para enfatizar que estas injecções estavam todos dentro do local correto do olho, para que se possa visualizar como a agulha deve entrar no local da incisão. Todas as injecções no espaço sub-retiniano provocar um descolamento da retina temporária devido à presença do fluido de injecção. Se o procedimento de injecção está terminada correctamente, este descolamento da retina temporária curará dentro de 24 horas e ratos podem ser utilizados para todas as experiências adicionais. O olho pode permanecer macio durante aproximadamente uma semana em função do procedimento cirúrgico, para uma segunda injecção deve ser evitado durante este período de tempo.
- Para ratos neonatos, use a pinça de vestir curvas para empurrar cuidadosamente o olho para trás das pálpebras e na órbita. Pode ser útilde esperar por um minuto, a fim de permitir que o vírus se estabelecer no interior do espaço sub-retinal e não fazer com que seja empurrado para fora do local da incisão quando suavemente empurrando o olho de volta para a sua órbita. Após a cirurgia, uma gota de 0,5% de bupivacaína (marcaína) diluída a 0,25% em solução salina estéril a partir de uma agulha de calibre 25 pode ser colocado no local da injecção. Ratos não mostram sinais evidentes de desconforto após a cirurgia sub-retiniana e do uso de bupivacaína como um analgésico de longa ação tópica tem sido suficiente para os três anos anteriores. Ratos deve ser sempre monitorado após o procedimento cirúrgico para procurar por sinais de angústia, como infecção, inchaço, ou uma diminuição nas atividades habituais diárias do mouse. Se isso ocorrer, o veterinário deve ser notificado e medicamentos para a dor mais como a buprenorfina (0,05 mg / kg) pode ser administrado como uma injecção intraperitoneal.
- Acordar o mouse da anestesia acordo com o protocolo aprovado localmente animais manuseio. O rato deve ser mantido em um p aquecimentoad para manter a temperatura corporal normal, uma vez que acorda da anestesia. O procedimento cirúrgico deve levar menos de cinco minutos para completar, não contando o tempo para o mouse se submeter a anestesia. Assim, uma almofada de aquecimento não é necessário durante o procedimento real, mas podem ser necessários quando se está a aprender a técnica como o processo pode demorar um longo período de tempo. O mouse não deve ser colocado de volta em uma gaiola limpa, até que começou a se mover por conta própria. Para recém-nascidos, pitadas toe suaves vai ajudar para que eles se recuperar totalmente da anestesia, e eles devem recuperar a sua cor-de-rosa e movimento antes de serem colocados de volta com a mãe. Ratos deve ser monitorado ao longo do tempo por quaisquer sinais de angústia como listado anteriormente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um desenho do olho do rato é mostrado com grandes estruturas marcadas para referência, com setas que indicam os locais para os procedimentos de injeção intravítrea e sub-retiniana, tanto cirúrgicos (pontas de seta, Figura 1). Vectores de terapia génica, tais como a lentiviral vector lacZ (Figura 2), pode ser injectada usando estes locais. Além disso, as células estaminais, como células estaminais embrionárias de rato (Figura 3), podem também ser transplantadas para estes locais no olho do rato.
1 ul de um vector lentiviral contendo o gene repórter lacZ conduzido pelo promotor de citomegalovírus (CMV) (1x10 8 TU / ml, Lentigen Corporation, Figura 2A) foi injectado no espaço sub-retiniano de ratos C57BL/6J. Os olhos foram enucleados com seis semanas de idade por dissecção romba e imersos em 1 mg / ml de solução de X-gal (5 mM K 3 Fe (CN) 6, 2 mM de MgCl2, 0,02% de NP 40, e 0.1% de desoxicolato de sódio) durante a noite a 37 ° C. Os olhos foram fixados em glutaraldeído a 2% formaldehyde/0.2% durante 30 min e seccionados em micrótomo. LacZ expressão do gene repórter foi detectada como produto X-gal (azul) em aproximadamente 10% das células fotorreceptoras (Figura 2B). A presença intracelular do lacZ de expressão e os tecidos intactos circundantes indicar a injecção sub-retiniana de sucesso no olho do rato.
C57BL/6J-tronco embrionárias (ES), as células foram marcadas com uma proteína verde fluorescente (EGFP, Wellcome Trust Sanger Institute). Estas células foram então recolhidas e suspensas em estéril salina tamponada com fosfato e transplantadas para o espaço sub-retiniano do dia pós-natal (P) 5 murganhos da estirpe C57BL/6J, com cerca de 1x10 5 células injectadas por 1 ul. Os olhos foram enucleados com duas semanas de idade, por dissecção cega, fixado em um gradiente de sacarose e congelou-se em OCT meio de inclusão (Tissue-Tek). Olhos foram seccionados e vis ualized sob microscopia de fluorescência (Zeiss). A presença de GFP marcadas com células ES pode ser encontrado no interior do espaço sub-retiniano do olho do rato injectado (Figura 3A). Além disso, C57BL/6J-Tyr c-2J / J (c2j) estaminais embrionárias de rato (ES), as células foram electroporadas com proteína fluorescente amarela (YFP) e diferenciar-se em células epiteliais pigmentares da retina (RPE), as células in vitro. Após um mês de diferenciação, as YFP-rotulados RPE células semelhantes c2j ES foram suspensas em tampão de fosfato estéril, solução salina e injectado no espaço sub-retiniano de ratos P5 C57BL/6J. Às 15 semanas de idade, um ratinho foi visualizada utilizando-vivo imaging autofluorescência para a presença de YFP no interior da retina (Scanning Spectralis Oftalmoscópio Laser Confocal, Heidelberg Engineering, Figura 3B).
4286fig1highres.jpg "/>
Figura 1. Esquemática do Olho Mouse. Um desenho dos desenhos animados que descreve as estruturas do olho do rato com os locais para os procedimentos de injeção intravítrea e sub-retiniana ambos marcados (setas).
Figura 2. Injeção de sub-retiniana de um vetor Terapia Genética Viral. A. Lentivirus mapa de vectores, mostrando o gene repórter lacZ conduzido pelo promotor de citomegalovírus (CMV). B. A expressão do gene repórter lacZ na retina de um rato C57BL/6J seis semanas de idade após a injecção sub-retiniana no tratamento pós-natal de cinco dias. RGC, as células ganglionares da retina; INL, camada nuclear interna, é, segmentos fotorreceptoras internas (seta); ONL, camada nuclear externa (fotorreceptores) (seta); OS, fotorreceptoras segmentos exteriores.
Figura 3. Injeção de sub-retiniana-tronco embrionárias (ES) Células. A. A duas semanas do mouse C57BL/6J velho após a injeção sub-retiniana de proteína fluorescente verde (GFP) marcados com células-tronco embrionárias no pós-natal de cinco dias. GFP células positivas são visíveis no espaço sub-retiniano do olho injectado utilizando a microscopia de fluorescência (Zeiss). Verde, GFP marcada com células ES (setas); RGL, camada gânglio retinal; INL, camada nuclear interna; ONL, camada nuclear externa (fotorreceptores); SI / SO, os segmentos internos e externos de fotorreceptores; RPE, epitélio pigmentado da retina. B. A 15 semanas retina do rato velho C57BL/6J mostrado usando autofluorescência live-imagem (Scanning Spectralis Oftalmoscópio confocal a laser, Heidelberg Engineering) para a presença de uma proteína fluorescente amarela (YFP) marcadas com RPE-c2j como células-tronco embrionárias de rato dentro da retina.Injecção sub-retiniana dos RPE-YFP como células ES foi realizado em pós-natal de cinco dias.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Esta técnica de vídeo fornece instruções sobre a conclusão do procedimento de injecção sub-retiniana cirúrgica com sucesso, e de assegurar que o vector de terapia de gene ou células estaminais são colocados no local necessário para tratar eficientemente a doença oftálmica. Esta técnica permite o direccionamento de células da retina, tais como o RPE ou fotorreceptores, uma vez que coloca os vectores de terapia genética e de células-tronco derivadas de tecidos na vizinhança destas células. Métodos anteriores envolvido injecções intravítreas, onde o fluido é colocado no interior da cavidade vítrea e tem de migrar através da retina, a fim de atingir estas áreas específicas. Injecção intravítrea reduz a transdução de vectores de terapia de genes que fotorreceptores alvo ou a EPR, uma vez que nem todas as partículas virais irão migrar para o local correto. Além disso, as células estaminais estão a tornar-se cada vez mais popular para substituir RPE doentes ou fotorreceptores, e estas células diferenciadas devem ser transplantadas dentro do subespaço de retina. 5
O passo crítico neste procedimento é a entrada para o espaço sub-retiniano, uma vez que isto assegura a localização correcta de vectores de terapia génica ou de células-tronco derivadas de tecidos, a fim de ter o efeito terapêutico, em conjunto com a redução do potencial de descolamento da retina ou danos no olho circundante tecido. Deve ser tomado cuidado para solucionar antes do tempo, para ser capaz de localizar e de injectar o fluido para o espaço sub-retiniano. Isto pode ser feito através da prática utilizando corante de cor e ratos albinos, como mostrado no vídeo, uma vez que a agulha de injecção não será visível no interior do olho de ratos pigmentados. Após a prática, o pesquisador irá aprender a sentir a diferença de pressão quando o fluido é colocado corretamente no espaço sub-retiniana e estar confortável com o procedimento cirúrgico para concluí-lo em tempo hábil.
Existem algumas modificações potenciais para este procedimento cirúrgico. Estas injecções podem ser executared em ratos de idades diferentes, embora a quantidade de vectores de terapia génica ou de células-tronco derivadas de tecidos injectados pode variar dependendo da idade do rato. Deve ser tomado cuidado para determinar a quantidade de fluido irá promover um tratamento para a doença oftálmica, mas não prolongar desprendimento e danos na retina. A agulha puxado capilar pode ser modificado para ter diferentes diâmetros. Agulhas mais pequenas são suficientes para injecções virais, mas de maior diâmetro pode ser melhor para transplante celular. Além disso, a cirurgia pode ser executada em ratos adultos. A densidade do tecido ocular será muito maior, de modo afiados frescas, lâminas cirúrgicas são obrigados a penetrar no espaço sub-retiniano. Em todos os casos, as modificações podem ser feitas com base no presente protocolo para completar a injecção sub-retiniana de sucesso de um vector de terapia génica ou de células-tronco derivadas de tecido.
Todas as injecções sub-retiniano irá causar um descolamento da retina temporária devido à presença do fluido injectado no interior daespaço sub-retiniano, mas essa separação deve curar dentro de 24 horas após o procedimento cirúrgico. Os ratos podem ser cuidadosamente verificada ao microscópio para qualquer descolamento restante. É possível que alguns ratos não pode curar naturalmente, mesmo após uma injecção bem colocado. Todos os ratos são capazes de submeter-se a exame e experiências que utilizam este de 24 horas período de tempo, no entanto, o olho pode ser suave, devido a uma mudança na pressão do processo de injecção de até uma semana. Por conseguinte, uma limitação desta técnica é a capacidade de realizar injecções secundárias durante a primeira semana pós-operatória. Outra injecção pode não ser possível, durante o período pós-operatório imediato, uma vez que a incidência de deslocamento da retina que não cura após cirurgia é aumentada. Aconselha-se a esperar por um longo período de tempo, enquanto um mês, antes de voltar a injeção no olho do rato.
O mouse se tornou um organismo modelo importante para estudar a doença oftálmica e terapias potenciais tchapéu levará a ensaios clínicos em humanos. 9-12 Uma segunda limitação deste procedimento é que nem todas as células são transf ectadas com vectores de DNA após a injecção sub-retiniana, uma vez que seria em um modelo de rato transgénico. No entanto, este procedimento pode mais se aproximam um procedimento clínico em seres humanos, onde todas as células não transfectadas é. Assim, esta técnica pode ajudar a determinar a viabilidade de vectores virais de terapia génica ou de células-tronco derivadas da terapia de transplante de tecidos para tratar a degeneração macular e outras doenças vítreo-retinianas em humanos. As aplicações futuras podem incluir a utilização de diferentes promotores de células de retina e células estaminais diferenciados, ou mesmo injecções múltiplas, utilizando uma combinação de tratamentos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Pesquisar para prevenir a cegueira, assistência Experimental de Takayuki Nagasaki; Esta pesquisa está em conformidade com a Declaração de ARVO para o Uso de Animais em Oftalmologia e Pesquisa Visual. KJW é suportado pelo NIH e 5T32EY013933 5T32DK007647-20. VBM é suportado pelo NIH concessão K08EY020530.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.8-1.10 x 100 mm Capillary Tube (glass) | Kimble Glass, Inc. | 34502 99 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | Narishige microforge can be used instead. Catalog #MF-900 |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-25ML | Silicone |
| Dubecco's Phosphate Buffered Saline with Calcium Chloride and Magnesium Chloride | Gibco-Invitrogen | 14040-133 | |
| Safety-Lok 25 3/4G x 12"; Blood Collection Set | B-D Vacutainer | 367298 | |
| 1 ml Sub-Q 26 5/8G Slip-Tip Syringe | Becton-Dickinson | 309597 | |
| 0.5-10 μl Finnpipette II Adjustable-Volume Pipetter | Fisherbrand | 21-377-815 | |
| 1-200 μl Natural Beveled Tips | USA Scientific, Inc. | 1111-1700 | |
| Discovery.V8 Stereo Microscope | Zeiss | MC1500 | |
| 60 mm x 15 mm Style Treated Polystyrene Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| Vannas Straight Scissors | Storz Ophthalmics | E3383 S | |
| Curved Dressing Forceps with Serrations Delicate | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| 15 Degree Microsurgery Knife | Wilson Ophthalmic Corp. | 091204 | |
| Ketamine | Ketaset III | NADA #45-290 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | NADA #139-236 | |
| Bupivacaine (Marcaine) | AstraZeneca | N/A | |
| Buprenorphine | Sigma Aldrich | B9275 |
References
- Prevalence of Blindness Data Tables [NEI Statistics and Data]. , National Eye Insitute. Available from: http://www.nei.nih.gov/eyedata/pbd_tables.asp (2011).
- Abe, T. Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation. Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).
- Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E., Schwartz, S. B., Roman, A. J., Peden, M. C., Aleman, T. S., Boye, S. L., Sumaroka, A., et al. Gene therapy for Leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years. Arch. Ophthalmol. 130, 9-24 (2011).
- Schwartz, S. D., Hubschman, J. P., Heilwell, G., Franco-Cardenas, V., Pan, C. K., Ostrick, R. M., Mickunas, E., Gay, R., Klimanskaya, I., Lanza, R. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, 713-720 (2012).
- Wang, N. K., Tosi, J., Kasanuki, J. M., Chou, C. L., Kong, J., Parmalee, N., Wert, K. J., Allikmets, R. Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa. Transplantation. 89, 911-919 (2010).
- Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).
- Tosi, J., Sancho-Pelluz, J., Davis, R. J., Hsu, C. W., Wolpert, K. V., Sengillo, J. D., Lin, C. S., Tsang, S. H. Lentivirus-mediated expression of cDNA and shRNA slows degeneration in retinitis pigmentosa. Exp. Biol. Med. 236, 1211-1217 (2011).
- Tucker, B. A., Park, I. H., Qi, S. D., Klassen, H. J., Jiang, C., Yao, J., Redenti, S., Daley, G. Q., Young, M. J. Transplantation of adult mouse iPS cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice. PLoS One. 6, e189992 (2011).
- Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. , Cold Spring Harbor Laboratories. (2010).
- Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R.
- Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes. Mol. Vis. 5, 22 (1999).
- Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. Mouse model resources for vision research. J. Ophthalmol. 2011, 391384 (2011).
