Zeitraffer-Fluoreszenz-Imaging von Arabidopsis Wurzelwachstum mit Rapid Manipulation der Root-Umgebung mit dem RootChip

Zusammenfassung

Dieser Artikel enthält ein Protokoll für die Kultivierung von Arabidopsis-Keimlinge in der RootChip, ein Mikrofluidik-Imaging-Plattform, die eine automatisierte Kontrolle der Wachstumsbedingungen kombiniert mit mikroskopischen Wurzel Überwachungs-und FRET-basierten Messung der intrazellulären Metaboliten.

Zusammenfassung

Die Root-Funktionen wie die physische Verankerung der Pflanze und ist das Organ für die Aufnahme von Wasser und mineralischen Nährstoffen wie Stickstoff, Phosphor-, Sulfat-und Spurenelementen, die Pflanzen aus dem Boden zu erwerben. Wenn wir nachhaltige Konzepte für die Herstellung qualitativ Ernteertrag entwickeln wollen, müssen wir besser verstehen, wie die Wurzel, entwickelt greift ein breites Spektrum an Nährstoffen, und interagiert mit symbiotischen und pathogenen Organismen. Um diese Ziele zu erreichen, müssen wir in der Lage sein Wurzeln im mikroskopischen Detail über Zeiträume von Minuten bis Tagen zu erkunden.

Wir entwickelten die RootChip, ein Polydimethylsiloxan (PDMS) - basierte Mikrofluidik-Vorrichtung, die uns zu wachsen und Wurzeln Bild von Arabidopsis-Keimlinge können unter Vermeidung jeglicher körperlicher Belastung zu Wurzeln während der Vorbereitung für die Abbildung ¹ (Abb. 1). Das Gerät enthält einen gegabelten Kanalstruktur mit mikromechanischen, um die Fluidströmung leitenaus der Lösung Einlässen zu jedem der acht Beobachtung Kammern ^2. Diese Perfusion System ermöglicht die Wurzel Mikroumgebung gesteuert und modifiziert werden mit Präzision und Geschwindigkeit. Das Volumen der Kammern beträgt etwa 400 nl und erfordern somit nur minimale Mengen an Testlösung.

Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für das Studium der Biologie an der Wurzel RootChip mit bildgebenden Ansätze mit Echtzeit-Auflösung. Roots kann über mehrere Tage mit Zeitraffer-Mikroskopie analysiert werden. Roots mit Nährlösungen oder Inhibitoren durchströmt werden, und bis zu acht Sämlinge können parallel analysiert werden. Dieses System hat das Potenzial für eine breite Palette von Anwendungen, einschließlich der Analyse des Wurzelwachstums in Gegenwart oder Abwesenheit von Chemikalien, Fluoreszenz-basierte Analyse von Genexpression, und Analyse von Biosensoren, zB FRET Nanosensoren ^3.

Protokoll

Hinweis: Führen Sie alle Schritte vorbereitenden Schritte unter sterilen Bedingungen.

1. Vorbereitung von Kunststoff-Kegel für die Keimung der Samen

1. In eine 10 cm Petrischale mit Wachstumsmedium, das 1% Agar in einer Dicke von 5 mm. Wir verwenden eine halbe Stärke modifizierte Hoagland Medium ^4, aber mittel-Zusammensetzung sollte so gewählt werden, um individuelle experimentellen Anforderungen angepasst werden.
2. Während das Medium noch flüssig ist, verwenden Sie einen Mehrkanal-Pipette bis 10 ul Pipettenspitzen mit 5 ul Medium aus der Petrischale zu füllen.
3. Lagern Sie die gefüllten Spitzen in der Pipettenspitze Feld, bis das Medium ist solide, dann bis 4 mm langen Kunststoff-Kegel und aufrecht in eine Petrischale mit einem soliden Wachstum mittel geschnitten.

2. Samenkeimung und Wachstum des Keimlings

1. Auftauchen sterilisieren Samen in 5% NaOCl für 5 min waschen dreimal mit sterilem Wasser, dann einen einzigen Samen oben auf jeder der mittel-gefüllten Kegels.
2. Verschließen Sie die Schale mit Mikroporeklebeband (3M) und bei 4 ° C zur Keimung zu synchronisieren.
3. Nach drei Tagen, übertragen Sie die Platten zu einem Wachstum Schrank, um Keimung zu beginnen. Unser Wachstum Bedingungen sind 23 ° C bei einer hohen light/8h 16h Dunkel-Zyklus (Lichtintensität: 100 uE m ^-2 s ^-1).
4. Zwischen 5 und 7 Tage nach der Keimung, die Sämlinge sollten bereit sein, für die Übertragung zum RootChip. Zu diesem Zeitpunkt sollte Wurzelspitzen in der Nähe der unteren Auslässe der Kunststoffkegeln sein. Überprüfen Sie Sämling Gesundheit, Wurzellänge und, falls zutreffend, Expression eines fluoreszierenden Marker unter einem Binokular.
5. Markieren Sie einzelne Setzlinge für die Übertragung auf den Chip. Wählen Sie zehn oder so Sämlinge falls man diese während der Übertragung beschädigt.

3. Transfer von Sämlingen auf die RootChip

1. Um die RootChip für langfristige Experimente sterilisieren, wickelndas Gerät in Seidenpapier, in eine Glas-Petrischale, und Autoklaven.
2. Sobald die RootChip abgekühlt ist, bedecken Sie es mit flüssigen Nährmedium. Die RootChip sollten vollständig eingetaucht werden, sondern der Flüssigkeitsstand sollte nicht mehr als 3 mm über der Oberfläche RootChip sein.
3. Mit einem 20 ul Pipette, ziehen Medium durch die Wurzel Einlass-und Auslass Kammer, um die Beobachtung Kammer mit Medium füllen.
4. Stecken Kunststoffkonen in Schritt 2.5 in die Buchten RootChip ausgewählt. Die Kegel sollte eng anliegen in den Buchten. Da die RootChip auf einer dünnen Schicht aus optischem Glas montiert ist, nicht zu viel Druck auf den Chip.
5. Inkubieren Sie die RootChip über Nacht in einem flüssigen Medium. Um zu verhindern, schwimmend, legen Sie zwei Glasplättchen auf den Chip. Fügen Sie einen Magnetrührer und schließen Sie die Schüssel.
6. Übertragen Sie die Montage auf einem Magnetrührer und vorsichtig geschwenkt, das Medium.
7. Die RootChip die Buchten schneiden die Sender zu einem Winkel von 30 ° auf das Gerät normal FACIlitate Wurzelwachstum in die Kanäle (Abbildung 1A). Zur weiteren Unterstützung des Wachstums in die gewünschte Richtung, kippen Sie die Montage leicht, indem Sie einen Objektträger aus Glas unter der Petrischale auf der Seite des Chips gegenüber der Auslässe.
8. Um das Licht / Dunkel-Zyklus zu halten, beleuchten die Sämlinge mit einer Ringleuchte (Lichtintensität: 100 uE m ^-2 s ^-1), verbunden mit einer Zeitschaltuhr.

4. Anschließen des RootChip an die LVG

1. Am folgenden Tag, füllen einen verschließbaren, druckbeaufschlagbaren Fläschchen mit flüssigem Nährmedium (Abbildung 1B).
2. Kehren Sie die Chip-Träger und legen es auf eine stabile Oberfläche. Entfernen Sie die RootChip aus dem flüssigen Medium und setzen Sie sie PDMS Seite nach unten in die untere Öffnung des Chip-Trägers. Orient den Chip, so dass die Seite mit den Steuerschicht Einlässe zugewandten Seite der Druckleitung Schlauchverbinder in dem Träger Seitenwand.
3. Trocknen Sie das Deckglas auf dieBoden des Chips durch leichtes Blotting mit Tissue-Papier. Sichern Sie die RootChip auf dem Träger mit Klebeband und rechts der ganzen Versammlung.
4. Schlauchverbinder werden durch Schneiden flexiblem Kunststoff Microbore Schlauch (TYGON, 0,20 "ID x 0.060" OD) in 5 cm lange Stücke und deren Verbindung zu Edelstahl Microbore Röhren (New England Small Tube, 0,025 "AD x 0,013" ID x 0,75 gemacht " lang). Füllen Sie die Schlauchanschlüsse mit Wasser mit einer Spritze und stecken jede Schlauch-Anschluss in das entsprechende Control Layer Einlass auf dem Chip. Das Wasser wird später füllen die Kontrolle Schicht Kanäle und verwendet, um den Druck auf die mikromechanische Ventile übertragen werden.
5. Stecken Sie die entgegengesetzten Enden der Linien in den Medien / Lösung Durchstechflasche (n). Üben Sie Druck auf die Lösung Fläschchen mit einer Spritze von Luft. Die erhöhte Luftdruck innerhalb der Lösung Fläschchen wird Flüssigkeit in die Leitungen zu zwingen.

5. Montage des RootChip am Mikroskop

1. Setzen Sie den Träger auf den MikroskopOPE Bühne. Um die Möglichkeit der Anordnung Verschieben innerhalb des Experiments durch Vibrationen in den Raum zu verringern, sollte der Träger exakt in die Kerben der Einsatzplatte.
2. Die Chip-Ventile und die Strömung des Mediums durch den Chip werden durch Luftdruck gesteuert. Zwei Linien mit Regulatoren sind aus einer Hauptdruckleitung verzweigte - eine solche verwendet wird, um das Medium durch die Kanäle zu steuern, und der andere mit elektropneumatische Ventile, die die Push-up-Ventile der Steuerungsschicht Betätigung verbunden ist. Die Magnetventile werden vom Computer über den USB-Ventilsteuerung (entwickelt von Rafael Gómez-Sjöberg, Lawrence Berkeley National Lab) betrieben. Schließen Sie beide Druckregler, bevor Sie den Chip.
3. Fügen Sie ein paar ml Wasser zu den Stauseen des Trägers zu halten hoher Luftfeuchtigkeit innerhalb der Baugruppe. Dieser Schritt sollte über Verlauf der mehr Experimente, um die Pflanzen vor dem Austrocknen bewahren wiederholt werden. Lassen Sie die Lautstärke zu minimieren ter Menge an Flüssigkeit, die auf das Mikroskop fließen könnte. Für Langzeit-Experimenten, kann der Abfluss aus der Chip-Outlets in den Stauseen des Trägers durch die Verbindung der Chip-Filialen zu den Stauseen mit Microbore Schlauch (siehe Schritt 4.4) geführt werden. Alternativ kann der Ausfluss, der auf der Chip-Oberfläche sammelt durch Pipettieren gesammelt werden.
4. Bereiten squared Blatt aus transparentem Kunststoff von Klarsichthüllen (C-Line). Den durchsichtigem Kunststoff des Trägers durch doppelseitiges Klebeband mit hoher Luftfeuchtigkeit in der Anordnung zu halten.
5. Positionieren Sie den Ring leicht über den Chip und Pflege der Hell / Dunkel-Zyklus. Das Ringlicht sollte ausgeschaltet werden, bevor dem Beginn jedes Experiment, das fluoreszierende Marker verwendet, da die direkte Beleuchtung mit Bild Kollektion stören wird eingeschaltet.

6. Die Bedienung des RootChip mit dem LabVIEW-Schnittstelle

Die RootChip Controller-Schnittstelle für die LabVIEW-Software-Plattform könnenvon unserer Website heruntergeladen werden http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip .

1. Die Ventile auf dem Chip werden durch Aufbringen von Druck auf die Steuerschicht, in diesem Fall durch Öffnen der elektropneumatische Ventile geschlossen. Der Controller-Schnittstelle ermöglicht die Betätigung der Ventile durch Anklicken des Buttons unter dem Ventil-Nummer. Helles Grün zeigt an, Anwendung von Druck und Schließen eines Ventils Chip (Abbildung 2B). Aktivieren Sie alle drei Einlassventile-Lösung in der Controller-Schnittstelle vor dem Öffnen der Druckregler. Hinweis: Die Controller-Schnittstelle verfügt über eine Feedback-Schleife, die Überwachung der den Zustand des Systems ermöglicht. Diese Funktion kann durch einen Klick auf den "Rücklesen"-Button in der Controller-Schnittstelle aktiviert werden.
2. Öffnen Sie den Druckregler für die Steuerung Schicht und zunächst auf 15 psi eingestellt, öffnen Sie dann den Regler für den Fluss-Schicht und zunächst auf 5 psi eingestellt. AbhängigkeitDing von der gewünschten Strömungsrate, können die Drücke später eingestellt werden.
3. Öffnen Sie das Einlassventil für das Wachstum Medium der Wahl, um die Kammern mit Medium spülen.
4. Überprüfen Sie Fließwege unter dem Mikroskop. Typischerweise wird die Luft in den Strömungskanälen gefangen und muss entfernt werden. Zusätzlich sind die Kanäle des Control-Schicht noch Luft enthalten, die durchgeführt werden müssen und gezwungen durch das Wasser aus dem Schlauch-Anschlüsse (Dead-End-Füllung) ersetzt. Beide Aufgaben werden durch Spülen jedes der acht Kammern mehrfach (5 psi) bis die gesamte Luft aus den Kanälen in der PDMS ("Entgasen") gezwungen wird, erreicht. Hinweis: Die Controller-Schnittstelle kann so programmiert werden, um Experimente zu automatisieren. Solche Routinen können auch zu entgasen dem Chip verwendet werden.

7. Repräsentative Ergebnisse

Der Hauptzweck des RootChip ist es, eine Imaging-Plattform und einer Durchströmungsauslaßvorrichtung System in einem Gerät mit einem hohen Maß an Integration zu verbinden. Um die Manipulation nachweisender Mikroumgebung von Wurzeln gespült wir die Kammern mit dunklen Lebensmittelfarbe (1:4 Verdünnung in Hydrokultur-Medium) gemessen und den Austausch von Flüssigkeit in den Kammern. Bei der empfohlenen Druck von 5 psi messen wir einen vollständigen Austausch innerhalb von 10 Sekunden bei einem berechneten Flussrate von ca. 1,5 ml / min (Abbildung 3).

Wir beobachteten auch Wurzelwachstum von Sämlingen, in diesem Fall im Dunkeln gewachsen und mit 10 mM Glucose als eine externe Energiequelle (4). Abhängig von den Wachstumsbedingungen wie Licht und Zusammensetzung des Mediums, können Pflanzen in der RootChip für bis zu drei Tage lang beobachtet.

Die RootChip wurde genutzt, um intrazelluläre Glukose und Galaktose Ebenen in Wurzeln zum Ausdruck genetisch kodierte Nanosensoren, auf Förster Resonance Energy Transfer (FRET) ^7.5 basieren überwachen. Wurzeln in der Chip wurden mit Rechteckimpulsen von Glukose oder Galaktose-Lösung perfundiert ( Abbildung 5). Die intrazelluläre Niveaus von Zucker wurden überwacht und werden hier ausgedrückt als Verhältnis der Intensität des Akzeptor-Fluorophor Citrin der Intensität des Spenders ECFP gezeigt. Der Anstieg der Kennzahl zeigt Anhäufung von Zucker.

Abbildung 1. RootChip Prinzip.

1. Die Beobachtung RootChip verfügt über acht Kammern für das Wachstum von Wurzeln und Imaging. Die Samen zuerst in Kunststoffkonen keimen - gefertigt aus Kunststoff Pipettenspitzen - welche mit festen Medium gefüllt ist. Die Wurzelspitze wächst durch das Medium und erreicht den Raum, in dem ein kontinuierlicher Strom von flüssigem Medium hält die Bedingungen in der Kammer konstant. Mikromechanischen Ventilen (rot) steuern den Fluss. Der Chip basiert auf einem optischen Deckglas montiert.
   Zeichnung nicht maßstabsgerecht. (Adaptiert mit Erlaubnis von Grossmann et al., Plant Cell 2011.)
2. Scheme eines druckbeaufschlagbaren Lösung Fläschchen mit Membran (rot).

Abbildung 2. Anschließen und montieren RootChip.

1. Draufsicht auf die in vollem Umfang angeschlossen RootChip und Träger montiert auf einem inversen Mikroskop.
2. Schema, das die Ventilanordnung und die Controller-Schnittstelle. Ein Beispiel für ein Ventil Einstellung, um die Fluidströmung zu einer einzigen Kammer führen gezeigt. Während die Ventile 4 bis 8 wirken als einzelne Armaturen, Ventile 0 bis 3 Akt in Gruppen. Mit diesem System wird eine einzelne Kammer kann durch die Aktivierung einer Kombination von Ventilen gerichtet werden.

Abbildung 3. Austausch von Lösungen in der Beobachtung, chBernsteinen. Visualisierung der Austausch von Flüssigkeit in einem Beobachtungsraum mit Farbstofflösung. Das Bild ist eine Überlagerung von Hellfeld-und falsch-farbige Intensität des Farbstoffs Signal.

Abbildung 4. On-Chip-Wurzelwachstum. Beobachtung eines einzelnen wachsenden Wurzel Expression eines fluoreszierenden FRET Nanosensor für Glucose / Galactose im Laufe der 20h. Zeitformat: hh: mm; Maßstab: 100 um.

Abbildung 5. Messung der intrazellulären Blutzuckerspiegel mittels FRET Nanosensoren.

1. Die Höhe der Sensor als Citrin Intensität innerhalb der Wurzelspitze (links) dargestellt. Die Reaktion des intrazellulären FRET Nanosensor der Anwendung von Glucose oder Galactose Lösung ratiometrische Bildern gezeigt. (Mit freundlicher Genehmigung von Grossmann et al Angepasst., 2011 PlaNT-Cell) Balkenlänge. 100 um.
2. Tracing FRET-Verhältnis ändert sich als Reaktion auf drei wiederholten Rechteckimpulse von Glucose (grün) und Galactose (rot).

Diskussion

Die Hauptvorteile des RootChip gegenüber herkömmlichen Methoden sind das Wachstum minimal-invasive Präparation für die Mikroskopie, die Fähigkeit, reversibel und wiederholt verändern die Root-Umgebung, und die Fähigkeit zur kontinuierlichen Beobachtung von entwicklungspolitisch kompetente und physiologisch gesundes Gewebe über einen Zeitraum von mehreren Tagen. Zuvor wurden die Keimlinge senkrecht auf gelierten Medium gezüchtet und auf eine Perfusionssystem unmittelbar vor dem Experiment, das nur die Messung eine einzige Ursache zu einer Zeit ⁸ erlaubt. Mikrofluidik-Tools wurden für Arabidopsis, aber auf einem niedrigen Integrationsgrad ⁹ oder ohne Perfusion Steuerung ¹⁰ verwendet worden. Die RootChip verbindet ein hohes Maß an Integration mit der Fähigkeit, durch genaue Experimente Strömungsführung zu automatisieren. Ein weiterer Vorteil dieser Plattform Merkmal aller mikrofluidischen Vorrichtungen ^11, ist, dass nur minimale Mengen an Flüssigkeit benötigt, um die Wurzel mit der erforderlichen Mutter zuzuführenkontrollierten Nährstoffeintrag, auch für Experimente über mehrere Tage. Die RootChip wird derzeit als Einweg-Gerät konzipiert, aber da die Produktionskosten von Chips niedrig sind, macht die kleine Mengen an Reagenzien verbraucht der Chip immer noch sehr kostengünstig.

Es gibt ein paar kritische Schritte, die ergriffen werden, um die Gesundheit der Setzlinge garantiert werden muss:

Das Volumen in der Kunststoff-Kegel ist nur 3-4 ul, die beginnen, um zu trocknen, wenn sie der Luft ausgesetzt wird. Daher ist es wichtig, dass die Zapfen auf den Chip übertragen werden schnell und Feuchtigkeit hoch gehalten wird, bis die Wurzeln der Beobachtungskammern, die sie mit ausreichend Wasser liefert erreicht haben. Schritte von 4,2 bis 4,5 sollte schnell und ohne Unterbrechung der Trocknung der Sämlinge zu verhindern durchgeführt werden.

Schritte von 3,5 bis 3,8 beschreiben die Inkubation des Chips in flüssigen Medien, in denen die Wurzeln wachsen in die Beobachtungskammern. Dieser Schritt kann durch Montage des Chips in die c übersprungenarrier sofort ab und konstante Perfusion mit Wachstumsmedium. Wir empfehlen jedoch, Einweichen in Wachstumsmedium über Nacht, da sie einige Vorteile hat: 1) es schafft eine feuchte Umgebung, damit die Keimlinge weniger wahrscheinlich geworden ausgetrocknet, als sie in der Beobachtung Kammer wachsen sind; 2) wird der Chip in Flüssigkeit getränkt, so Entgasung (Schritt 6.4) wird schneller sein.

Es ist wichtig, um Medien mit niedrigen Konzentrationen der gelösten Stoffe zu verwenden. Mehr konzentrierten Lösungen können ausfallen und verstopfen die Kanäle, insbesondere, wenn der Chip über mehrere Tage verwendet wird.

Sobald das Gerät in der Druckluftleitung verbunden ist, wird die Strömung des Mediums, indem hydraulische Druck in den Ventile gesteuert. Um eine ordnungsgemäße Schließung der mikromechanische Ventile gewährleisten, ist es wichtig, einen Steuerdruck, die etwa dreimal höher als der Fließdruck zu wählen. Der Fließdruck sollte nicht mehr als 15 psi als die Flüssigkeit wird aus der Wurzel Buchten geschoben werden. Höhere Drücke may auch dazu führen, Delamination der Chip, der den Chip unbrauchbar macht.

Eine Begrenzung der RootChip ist, dass PDMS porösen auch hydrophob ist. Während das Material praktisch inert ist gegenüber wässrigen Lösungen, kann es zu absorbieren organischen Verbindungen ^12. Dies kann mit einem raschen Austausch von Lösungen als organische Verbindungen aus dem Material selbst wenn die Zufuhr dieser Verbindung an dem Einlass wurde gestoppt entweichen kann, beeinträchtigen. Aufgrund der Porosität kann die Verwendung von organischen Lösungsmitteln Aufquellen des PDMS ^12.

Wir unterstützen weiterhin die RootChip optimieren und erweitern ihren Nutzen, zum Beispiel mit Wurzeln von Nutzpflanzen. Wir glauben, dass durch die Verbesserung der Zugriff auf das Root für Behandlungen und Beobachtung, Mikrofluidik-Tools wie der RootChip eröffnen sich neue Dimensionen der Wurzel Forschung.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Artikel	Quelle	Information
Chip-Träger, Software und andere Informationen.	Carnegie Institution - DPB	CAD-und CNC-Dateien für Träger Fertigung, Controller-Software und weitere Informationen stehen zum Download auf der Website http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip Träger können auch von dieser Website bestellt werden.
RootChip	Stanford Foundry	Mask Design und Fertigung Protokolle sind auf Anfrage erhältlich. Ready-to-use RootChips kann bestellt werden bei http://www.stanford.edu/group/foundry/
Chip-Controller	-Home-gebaut	Die automatisierte Ventilsteuerung System wurde ursprünglich von Rafael Gómez-Sjöberg, Lawrence Berkeley National Lab entwickelt. Eine detaillierte Anleitung, wie Sie Ihre eigenen Controller bauen Ventil sind zu finden unter https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers