Methodenartikel

Verwendung von Zeitraffer-Mikroskopie zur Anoxie-induzierten Suspended Animation in Visualisieren C. elegans Embryonen

DOI:

10.3791/4319

⸱

3. Dezember 2012

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of North Texas

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier wird beschrieben ein In vivo Technik zur Bilder subzellulären Strukturen in Tieren, die mit Anoxie einen Gasstrom durch microincubation Kammer in Verbindung mit einer drehenden Scheibe Konfokalmikroskop. Dieses Verfahren ist einfach und flexibel genug, um eine Vielzahl von experimentellen Parameter und Modellsystemen anzupassen.

Zusammenfassung

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Caenorhabdits elegans wurde ausgiebig in der Studie der Stressresistenz, die durch die Transparenz des adulten Stadien und Embryo als auch durch die Verfügbarkeit von genetischen Mutanten und transgenen Linien Expression einer Vielzahl von Fusionsproteinen 1-4 erleichtert wird. Darüber hinaus können dynamische Prozesse wie Zellteilung Darstellung unter Verwendung von fluoreszierend markierten Reporter-Proteine ​​werden. Das Studium der Mitose kann durch den Einsatz von Zeitrafferexperimente in verschiedenen Systemen einschließlich intakten Organismen erleichtert; somit der frühen C. elegans Embryo wird auch für diese Studie geeignet. Präsentiert hier ist eine Technik, mit der in vivo Bildgebung von sub-zellulären Strukturen in Reaktion auf Sauerstoffmangel (99,999% N 2; <2 ppm O 2) Stress ist möglich, mit einem einfachen Gasfluss durch Setup auf einem High-Power-Mikroskop. Ein microincubation Kammer in Verbindung mit Stickstoffgas durchströmt und einer drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop verwendetum eine kontrollierte Umgebung, in der Tiere in vivo abgebildet werden können. Verwendung GFP-markierten Gamma-Tubulin und Histon, kann die Dynamik und Verhaftung der Zellteilung kontrolliert werden, bevor, während und nach der Einwirkung von einer sauerstoffarmen Umgebung. Die Ergebnisse dieser Technik sind hochauflösende, detaillierte Videos und Bilder von zellulären Strukturen innerhalb Blastomeren von Embryonen ausgesetzt Sauerstoffmangel.

Protokoll

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Ein. Probenvorbereitung

  1. Produzieren oder zu erhalten entsprechenden transgenen C. elegans-Stamm von Interesse unter Verwendung transgener Methoden oder von Caenorhabditis Genetics Stock Center (CGC) oder Kollegen. In diesem Fall sind wir mit dem Stamm TH32 (pie-1 :: tbg-1 :: GFP; pie-1 :: GFP :: H2B) 5 bis Chromosomen und Zentrosomen als Marker für die Zellteilung zu visualisieren.
  2. Generieren Sie eine synchronisierte Bevölkerung mit einem der drei Methoden: 1) zerfallen gravid Erwachsenen in Hypochloritlösung und verwenden restlichen Embryonen 6, 2) holen gravid Erwachsenen auf eine gesetzte Platte....

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Ergebnisse

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C. elegans Embryonen bei starken Sauerstoffmangel (Anoxie) können durch die Verhaftung biologische Prozesse einschließlich Entwicklung und Zellteilung 7 überleben. Die Anoxie induzierte Verhaftung der Zellteilung können überwacht werden, bei einem sub-zellulären Ebene durch Verwendung einer microincubation Kammer in Verbindung mit Stickstoffgas durchströmt und einer drehenden Scheibe konfokalen Mikroskops um eine kontrollierte Umgebung, in der Tiere in vivo abgebildet werden kann erstellen <.......

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Diskussion

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Sauerstoffmangel und Suspended Animation

Obgleich das Engagement in schweren Sauerstoffmangel kann tödlich sein für einige Organismen, sind einige Organismen, um die Exposition gegenüber Anoxie überleben. Im Falle von C. elegans, hängt Überleben von Anoxie Belichtung auf Entwicklungsstadium und ist ansprechend auf Anoxie Eintritt in einen Zustand der reversiblen suspendiert Animation in dem eine Anzahl von beobachtbaren biologische Prozesse werden verhaftet. Zellteilung, Entwicklung, B.......

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Offenlegungen

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

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Wir möchten unsere Wertschätzung für die Eingabe und Kommentare von Mitgliedern des Padilla Lab vermitteln. Nematode Stämme in dieser Arbeit wurden von der Caenorhabditis Genetics Center, das von der NIH National Center for Research Resources (NCRR) finanziert ist. Wir anerkennen und danken Dr. Lon Turnbull für technische Hilfe bei der konfokalen Mikroskopie. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Science Foundation (NSF-IOS, CAREER) an PAP unterstützt

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien / Equipment Zusammensetzung
Hypochloritlösung 0,7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, um 50 ml zu bringen mit ddH 2 0
M9-Puffer 3 g KH 2 PO 4, 11 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO 4 pro 1 L ddH 2 O
Glasobjektträger Fisher Scientific 12-550-343 3 "x1" x1.0 mm
Round micro Deckglas Electron Microscopy Sciences 72223-01 25 mm Durchmesser
Halocarbonöl 700 Sigma H8898-100ml
Narkose 0,5% tricaine, 0,05% Tetramisol
Leiden Closed Perfusion Microincubator Harvard Apparatus 650041
UHP Stickstoff Calgaz (Air Liquide) > 99,9990% N 2 <2 ppm O 2
Kunststoffschlauch VWR 89068-468 0,062 "ID x 0,125" OD
Spinning-Disk-konfokale Mikroskop McBain Systeme Zeiss invertiert optischen Mikroskop, Epifluoreszenz Beleuchtungssystem, CSU-10 Yokogawa konfokalen Scanner, Hamamatsu-Elektronen-Vervielfacher CCD-Kamera.

Referenzen

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  1. Powell-Coffman, J. A. Hypoxia signaling and resistance in C. elegans. Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).
  2. Padilla, P. A., Ladage, M. L. Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans. Cell Cycle. 11<....

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Schlagwörter

Gasfluss SetupSpinning Disk KonfokalmikroskopMikroinkubationskammerGFP markiertes Gamma TubulinHistondynamikZellzyklusarrestsauerstofffreie Umgebung

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